薄层色谱法的发展

薄层色谱分析法的应用和发展

一、薄层色谱分析在层析分离过程中的应用

生物技术、新型材料技术、信息技术是当今科技发展的前沿 ,在某种程度上甚至可以代表一个国家的科学技术发展水平。层析分离过程是生化产物分离和纯化的重要手段之一 ,作为生物技术产业化进程中的“下游技术”往往成为技术和经济的关键 , 直接关系到产品的产量和质量 ,其成本经常占到总成本的60 %～90 %[2 ] 。因此 ,层析分离过程的优化和控制就显得十分重要。薄层色谱分析方法 , 因其具有分析迅速快、成本低廉、可现场操作等特点在层析分离过程中不可缺少。

1. 薄层色谱分析的优越性

薄层色谱分析方法和高效液相色谱分析方法均遵循层析分离的基本原理 ,因此 ,层析分离过程的中间控制性分析和分离后的最终产物的检验 ,用上述两种分析方法是非常适合的。高效液相色谱分析方法的精度高、分离效能高、选择性高、检测器灵敏度高 , 比较适合最终产物的检验。虽然高效液相色谱也可用于中控分析 ,但是分析检验的成本非常高，需要设置专业人员进行分析操作。由于样品在分析前需要预处理 ,得到分析结果的时间相对较长 ,对于层析过程的中间控制就显得不够及时 , 同时过高的分析精度也没有必要。薄层色谱分析方法在对层析分离过程控制性分析中就显示出了很高的优越性。

2. 薄层色谱片的制作和分析操作

用于层析分离过程的中间控制性分析的薄层色谱片可以在专业试剂商店买到 ,如果在实验室自己制备则可节约80 %的成本, 同时可以根据分析的实际需要灵活地调整固定相薄层的配方。固定相通常用 GF254 硅胶和一定比例的纤维素配合而成。将固定相的浆料均匀地涂布在毛玻璃片上，经烘干活化后即可使用。每片薄层可以分析多个样品，重复使用几次。经毛细管点样、在层析缸用展开剂展开后，在紫外分析仪上可观察到非常清晰的分析结果，一次分析过程基本可控制在 10min左右，现场操作人员经短时间的培训就可掌握。

3. 薄层色谱分析对层析分离过程的优化

应用薄层色谱进行层析中间控制分析，选用展开剂和确定不同展开剂的比例是薄层分析的关键。展开剂的确定一般需要以下几个前提条件：（1）层析前的样品要经过高效液相色谱分析，获得较高的分离度。

（2）确定样品中各组份的组成，明确层析分离要得到的主产物。

（3）层析分离过程的操作方法及洗脱剂的配比要基本确定 ,各组份的洗脱次序要明确。

（4）层析分离要得到主产物的纯度要规定一个在工艺上比较合理的范围（关系到最终的收率和产品质量）。

（5）层析分离后的主产物和副产物要经过高效液相色谱分析，确定产物的含量。

其中（1）和（2）通常也是必不可少的工艺条件，可以和薄层色谱分析结果相互印证。在上述前提条件具备后，可以根据样品的理化性质，选用几组常用的展开剂，分别用层析前和层析后的样品进行试验。选定一组分离效果较好的再进行微调 , 以围绕主产物能获得一个较好的分离度为准。所获得的分离度并非越高越好 ,因为通常情况下最初确定的层析分离过程本身为薄层分析提供了足够的时间和组份之间的空间。我们利用薄层分析方法对层析过程进行监控的另一个很重要的一个目的在于，减少这种时间和空间，从而缩短层析分离过程的时间、降低洗脱剂的用量，扩大最终产品的利用空间。薄层分析的这种作用在产品试制和工艺放大过程中是非常显著。例如 :用硅胶层析柱（Φ40×400）分离一种新型高效生物农药（各组份分子量在800～1000之间）小试产品时，用自制的薄层片对层析过程进行控制性分析，并进一步优化层析过程。最终使层析时间缩短了20 %，洗脱溶剂乙醇、乙酸乙酯的用量分别减少了10%和15%。

4.层析分离过程中应注意的问题

层析分离操作中,层析柱制备好后一般都要多次使用，层析柱的承载能力和分离效能是逐渐下降的。在层析操作方法和薄层分析方法确定下来后，要注意分析频次只能做一个基本的规定。因为同一批制备的层析柱，在使用过程中分离能力的衰减速度往往是不同的，不排除某一个柱子突然失效的可能。所以在薄层分析中要注意这一点，根据实际情况调整分析频次，工艺人员也要有相应的预案。薄层分析结果与高效液相色谱分析结果对照时，要注意两种方法所采用固定相的差异，确定好各组份的次序。

5. 结论

薄层色谱分析方法对层析分离过程的控制性分析和优化作用是十分显著的。近年来，随着生物制品的研制和中药制剂的开发，薄层色谱分析方法作为一种快速、高效、简便、低成本的分析方法，将有更加广阔的应用前景。

二、薄层色谱分析法在药物分析中应用进展

薄层色谱法 ( TL C)是将供试品溶液点样于薄层板上，经展开，检视所得的色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，用于药品的鉴别或杂质检查的方法。TL C是一种快速、灵敏、高效地分离微量物质的方法，是最简单的色谱技术之一，具有操作方便、备简单、离效率高、属性好、分析速度快、色谱参数易调整等特点，在药物分析中应用广泛。

1药品真伪鉴别

1.1 化学药品及其复方制剂

阿片中含生物碱 20余种 ,其含量差异较大。徐明琴等 [1 ]将TL C用于阿片类药物及其代谢产物的检测。以硅胶为吸附剂 ,为展开剂 ,显色方法为 254nm 紫外灯、碘化钾试剂、酸性碘铂酸钾试剂、蒸气等。通过选择适当的薄层板、开剂、色剂 ,与标准对照品比较比移值 ( R f )和斑点大小 ,可初步确定阿片类药物的种类。复方降压胶囊中 ,组成成分近 10种 ,董海彦 [2 ]以TL C同时鉴别处方中利血平、利眠宁和盐酸异丙嗪 3种成分 ,取 3种对照品及供试品制成溶液 ,分别点于硅胶 GF 254板上 ,以苯 -丙酮 ( 3∶2)为展开剂 ,展开后 ,晾干 ,置

254nm紫外光灯下检视 ,供试品与对照品 3个斑点位置一致 ,R f值适中 ,斑点明显。薄层色谱中展开剂应尽量不使用毒性很大的溶剂。苯毒性较大 ,有致癌作用 ,除了必要情况下 ,尽量用其它溶剂代替。此方法展开剂中的苯 ,如能以其它溶剂替代则更好。钱丽华等 [3 ]采用薄层色谱法在同一薄层板上对抗结核类药物中的 4种主要成分利福平、异烟肼、盐酸乙胺丁醇、吡嗪酰胺进行快速分离鉴别。使用硅胶GF254板，以甲醇-水-浓氨水（30:1:0.3）为展开剂 ,点样量为 2μl ,展开晾干后 ,先在紫外灯 ( 254nm)下检视 ,可见利福平、烟肼、嗪酰胺3个斑点 ,再进行碘熏蒸 ,可见利福平、异烟肼、盐酸乙胺丁醇 3个斑点 , Rf 值适中 ,分离效果和重现性好。吕长淮、阿利等对氨咖黄敏胶囊 TL C鉴别方法进行改进，分别通过改变展开剂配比、取样量及色谱条件。使原标准中未检出的成分得以检出。

1.2 抗生素及其制剂

麦迪霉素片原标准TLC操作上受温度影响较大，所需硅胶H板较为特殊，显色剂配置繁琐。陈庆坤通过试验，该吸附剂为硅胶GF254，在室温下展开即可，样品展开后，置紫外光灯254nm下检视，供试液所显斑点的位置与颜色和对照液所显斑点相同，Rf值为0.5，斑点清晰，无拖尾现象，灵敏度高，分离效果好。金建平通过采用乙醚溶液四环素眼膏和眼膏基质，盐酸提取的方法处理样品，将对照品和样品制成适宜溶液，分别点于同一硅藻土G板上，以5%乙二胺四醋酸二钠溶液5ml与醋酸乙酯-氯仿-丙酮（2:2:1）200ml的混合液为展开剂。展开后，热空气中干燥，氨蒸汽熏，置紫外灯365nm下检视。结果，供试液所显斑点的颜色和位置与标准液所显的斑点相同。

1.3 中药材

黄玉清采用TLC鉴别牡丹皮及其伪品芍药根皮，取牡丹皮、芍药根皮粉格1g，用乙醚提取后挥发，残渣加丙酮溶解，作为供试液；另取丹皮酚、芍药苷分别加冰铜溶液制成对照液。分别点与同一硅胶G板上，以环己烷-乙酸乙酯（3:1）为展开剂。展开后，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，牡丹皮供试液与丹皮酚对照液位置上显相同的紫色斑点，芍药根皮供试液与芍药苷对照液相应的位置上显相同的蓝色斑点。

2. 药品杂质检查

有关物质检查通常采用色谱法，可根据有关物质的性质，选用专属性好，灵敏度高的TLC法、高效液相色谱HPLC法及气相色谱法GC法。TLC法设备简单，操作简便，但影响重现性和精密度的因素较多，用作一般有关物质检查。施亚琴等采用反相薄层色谱法，建立了阿德福韦酯有关物质检查法。以反相高效F254薄层吧板（HP TLC RP18F254）为吸附剂，以甲醇-水3：1为展开剂，在紫外光灯254nm下检视，阿德福韦酯与其有关物质的分离状况良好，检测灵敏度高，最小检测限为0.1g。涂莉等采用TLC法，建立了雌三醇栓中有关物质的检查方法以硅胶G板为吸附剂，以氯仿-甲醇-丙酮-冰醋酸（9：0 5 ：0 5 ∶0 5）为展开剂, 展开后，晾干，喷以30%硫酸乙醇液，在100 ℃加热至斑点清晰。结果，3种有关物质与原药完全分离，Rf值适中，最低检出量为0.2ɥg ,且重现性好。毕雪艳等采用TLC法检查复方氨酚烷胺颗粒中的有关物质对氯苯乙酰胺，使用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)GF254硅胶板,以氯仿-丙酮-甲苯(13:5:2)为展开剂，紫外光灯254nm下检视。结果，检出对氯苯乙酰胺杂质斑点与其它主药成分斑点分离良好，空白样品溶液的斑点对杂质斑点无干扰，重现性好，Rf值适中,能有效检出有关物质。

3.中药指纹图谱分析