第三讲----神经干细胞(2014)

神经干细胞的应用
一、内源性神经干细胞的活化
体内干细胞的功能状态受下列因素影响： 1、学习因子（enriched environment）--是观察海马神经干细 胞增殖的常用模型。 2、年龄—随着年龄增长，神经干细胞的增殖能力逐渐下降， 但在老年哺乳动物仍然保留此功能； 3、应激因素—糖皮质激素、紧张等应激因素可使中枢内神 经发生明显下降； 4、生长因子—对体内外神经干细胞均有影响； 5、神经递质—GABA，Glu等对神经干细胞增殖也有影响； 6、其它—损伤、癫痫发作或诱导、锻炼等因素可促进脑内 神经干细胞的分裂增殖。

神经干细胞生物学特征

4、低免疫源性：

神经干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，具有 低免疫源性，因此在移植后相对较少发生异体排斥反应，有利于
其存活 -----基因治疗的载体

百度文库
目前神经多能干细胞被用于体外基因转导实验：转导报告基因 (LacZ基因)，转导神经递质合成酶(酪氨酸羟化酶)的基因用于治
神经干细胞分类
根据分化潜能及产生子细胞种类不同分类 1）神经管上皮细胞----胚第3周 分裂能力最强，只存在胚胎时期，可以产生成神经细胞和 成胶质细胞
神经细胞\神经胶质 的分化与成熟

2）神经母细胞
成年人体中主要存在的神经干细胞，可以产生
神经前体细胞和神经元和各类神经胶质细胞.

3）神经前体细胞
神经干细胞的应用
1、内源性神经干细胞的活化-----借助细胞因子等方法 将体内的神经干细胞激活，分化形成神经元或神经胶 质细胞。 2、外源性神经干细胞移植---将神经干细胞分离、培 养并分化后直接用于移植；
3、基因载体---利用病毒载体携带目的基因导入神经 干细胞，筛选到高效表达目的基因的克隆进行移植；
（1）纤维细胞生长因子( fibroblastgrowth factor, FGF)
（2）EGF（表皮生长因子）： 为促有丝分裂因子
脑发育各期均有EGF的表达 ；
促神经干细胞增殖。体内连续6天注射EGF于Brdu
标记的前脑区细胞后发现，标记细胞数量增加 18
倍，且分离得到的NSCS克隆数量增加3.7倍；
----微环境对神经干细胞分化起主导作用。
神经干细胞分化的调控
（二） 外源性因素—微环境

1、神经递质 神经递质作为细胞外环境的一员，不仅介导 神经元之间和神经元与效应器之间的信号传递， 还参与NSC的增殖和分化。这些神经递质包括谷氨 酸（G1u）、5-羟色胺（5-HT）、GABA、甘氨酸 （G1y）、乙酰胆碱（Ach）一氧化氮（NO）、肾 上腺素与性激素等。
（一） 内源性因素（基因） 1、促进NSC分化的基因--通过促进干细胞不对称分 裂促进干细胞分化。 如碱性螺旋-环-螺旋基因（bHLH基因家族）：
在神经元分化中起关键作用，可促进细胞脱离细胞周期， 并激活下游特定神经元分化的遗传基因表达。
2、抑制NSC分化的基因--通过促进干细胞对称分裂、 增加干细胞数量。 如Notch基因：
1、位臵：
（缺血）
三、神经嵴干细胞
为外周神经干细胞， 可发育为外周神经 细胞、神经内分泌 细胞和Schwann氏 细胞，也能分化为 色素细胞 (pigmented cell)和 平滑肌细胞等。
神经干细胞生物学特征
。
1、形态
无血清培养：球型，悬浮生长
（含EGF，bFGF等） 有血清培养：贴壁分化为成熟神经细胞
NSE染色呈阳性神经元
GFAP染色阳性星形胶质细胞
3、神经干细胞生长方式

一种是对称分裂,形成两个相同的神经干细胞
另一种是非对称分裂(主要形式) ,由于细胞质中的 调节分化蛋白不均匀的分配 ，使得一个子细胞不 可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化细 胞 ,另一个子细胞则保持亲代的特征 ，仍作为神 经干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细 胞的数目和分裂次数控制。
二、神经干细胞移植研究
移植细胞的功能可能有三方面作用： 1.用移植的细胞取代受损的细胞,释放神经递质； 重建神经回路； 2.利用移植细胞产生神经营养或保护因子,保护受损的神 经细胞，使其免于死亡，长出轴突，并与次级神经元形成
疗帕金森疾病，转导一种代谢性酶(β-葡萄苷酸酶)的基因用于
治疗粘多糖病等，利用神经干细胞作为基因治疗载体，弥补了病 毒载体的一些不足。
神经干细胞生物学特征

5、自我更新：
神经干细胞具有对称分裂及不对称分裂两种分裂方 式，从而保持干细胞库稳定。 克隆化的神经干细胞系，在无血清条件培养下，或经癌 基因转染后，可在体外传代达三年以上。 但经癌基因转染的神经干细胞在移植入体内后，其基因 表达在48小时后自动下调，未发现肿瘤形成的现象。
一、内源性神经干细胞的活化

2、脑损伤时神经干细胞的迁移和分化： 神经干细胞的迁移能力与神经信号、细胞因 子、生存微环境等多种因素密切相关。 现已证实在脑损伤时，NSC具有迁移能力，且 受病变部位信号的诱导向病灶区迁移，从细胞结 构上与宿主细胞整合，可分化为特定的神经细胞， 并与周围神经元建立突触联系，为恢复神经功能 提供结构上的保证。
2
3
神经干细胞分化的调控
(4) 3 、细胞因子或生长因子的影响
细胞生长因子对神经干细胞增殖、分化有促
进作用，有发育阶段的特异性和敏感性。如鼠胚
14-18天的神经干细胞对FGF-2敏感，对EGF不敏感。
干细胞本身对不同信号的敏感性及对不同信 号浓度的反应性不同，表现出分化的时序性：即 神经干细胞向神经元分化的时序早于向神经胶质 细胞的分化。
依赖FGF发育
不表达EGFR 整个发育期脊髓均 有FGF依赖干细胞 产生PNS和神经嵴细胞 快
产生细胞 不产生神经嵴和PNS细胞 分化速率 慢
此外，各类限制性前体细胞还具不同的表面抗原特性
神经干细胞生物学特征
2、神经干细胞的特异性标志
2、神经干细胞的特异性标志 musashi
缺乏神经系统分化的标志如：神经元特异烯醇化酶 （NSE），胶质纤维酸性蛋白（GFAP)等。
神经干细胞分化的调控
（二） 外源性因素—微环境


Niche是影响干细胞增殖和分化的重要因素，包括 神经细胞、神经胶质细胞和细胞外基质。 Gage将神经球注入成年脑组织的某脑区观察发现： 注射的神经干细胞迁移部位的不同有不同的分化 方向。迁移至嗅球和海马齿状回等能产生新生神 经元的脑区神经干细胞可以分化为特异功能的神 经元，而之外的脑区或注射到损伤的局部则分化 为神经胶质细胞。
神经干细胞生物学特征

7、良好的组织融合性：

脑室内移植的神经干细胞可以通过血脑屏障，迁徙至脑 实质中与宿主细胞在形态和功能上形成良好的整合。 神经干细胞与宿主神经组织的良好的融合性，确保了神 经干细胞的长存活，并真正达到功能修复的能力。


8、迁徙（migration）能力：对损伤和疾病的反应能力
二、神经干细胞移植
一种理想的可移植细胞应具备以下三点： 1、强大的增殖潜能，以便在体外培养获得大量可供 移植的细胞来源； 2、表现未成熟特征及表型的可塑性； 3、增殖和分化的可控性。
NSCS是细胞移植治疗颅脑损伤的一种良好来源。

神经干细胞用于治疗的可能机理 1、患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引 神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分 化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于 缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局 部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细 胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位； 2、神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤 细胞的修复； 3、神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新 的神经环路。
CNS在不同区域可能有形态的多样性和不 同的生物学特征。
EGF依赖神经球细胞
生长方式 发生时间 表达受体 分布 悬浮式生长 发育后期（E14.5天后) EGFR
FGF依赖神经上皮干细胞
贴壁生长或悬浮生长 发育中期（大鼠E10.5/小鼠E8.5）
依赖生长因子 依赖EGF发育
脑区，在脊髓无EGF依赖神经球出现
3、但内源性神经干细胞激活修复CSN存在以下问题： NSC数量不足; 调节始动、聚集、迁移、分化、成活、轴突延伸和突触形 成的细胞因子不足使新生的神经细胞达到应有的数量和满 足功能需要; 在CNS受损后，分化而成的细胞多为神经胶质细胞。 其可能原因有: 1)原位诱导出功能特异的神经元可能需要多种刺激和 特定细胞因子的作用; (2)患者中枢神经系统的干细胞缺陷或无法激活。 激活内源性神经干细胞以治疗神经系统损伤研究不成熟， 移植是目前最有前途的治疗方案。
多诱导向星型胶质细胞分化。
（ 4）
（5）神经营养因子（neurotrophic factor）
在培养的神经元中加入BDNF，将明显促进神经元
突起的生长，促进神经元存活。
注意：
神经干细胞对不同种类、不同浓度的因子以及多 种因子联合应用作用各不相同 ,在神经干细胞发 育分化的不同阶段 ,相同因子的作用也不同。
2、神经干细胞发育的时限性


胚胎神经干细胞来源：胚胎12-15天（鼠）
星形胶质细胞在胚胎16天可检测到
少突胶质细胞主要发生在出生时，大量的胶 质细胞产生于出生后1个月；
神经元在胚胎胶质细胞分化之前得到充分分 化，至出生时基本完成; 细胞分化时空间隔，有利于神经网络的形成。


二、成年脑神经干细胞—处于静止状态


神经干细胞生物学特征

6、多潜能分化


神经干细胞可以向神经元、星形胶质细胞和少突胶质 细胞分化的能力。 体外培养发现，分化环境中的细胞因子对神经细胞的 分化起到调节作用，因此可以在一定程度上控制其分 化的时间和方向。 随着对跨胚胎层分化调控机制的深入认识和争论，神 经干细胞的移植将更加丰富多彩。
一、内源性神经干细胞的活化

1、脑损伤时神经干细胞的增殖：
成年CNS中，尤其是齿状回的神经组织发生常 受到环境因素的调控，如追踪眨眼训练和空间探 索训练，两种依赖海马的任务均可加强成年大鼠 海马中神经组织的发生。 相反，心理压力和长期给予吗啡和海洛因者， 可使成年动物海马齿状回的神经组织萎缩，功能 受损。 研究提示：内源性神经干细胞可针对环境的 变化调整增殖与分化的速度。
神经干细胞迁移模式： 1、放射状迁移：以辅助细胞的放射状胶质为引导， 沿突起前进（大部分以此方式） 2、正切迁移：不需要帮助，直接迁移到达目的地 （14%以此途径）
神经干细胞迁移机制：细胞因子影响 ---NRG（neurogulin/gliagrowth factor） slit/ephrin
神经干细胞分化的调控
神经干细胞基础与进展
(neural stem cell，NSCs)
神经干细胞生物学特征
神经干细胞分离培养与鉴定 神经干细胞应用



1989年，Temple等从13天大鼠胚胎脑隔区取出细胞进行培 养，发现这些细胞发育成神经元和神经胶质细胞。 其后从成年鼠纹状体、海马齿状回等处分离出能在体外不 断增殖，并具有向神经元和星形胶质细胞分化潜能的细胞 群。 20世纪90年代后，许多实验都证实，人脑内也同样存在神 经干细胞。 Mckay在1997年提出神经干细胞的概念；神经干细胞是指 具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力， 能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。
各类神经细胞的前体细胞--定向祖细胞
神经干细胞分类

根据存在部位分：
一、胚胎神经干细胞
1、来源
主要集中在嗅球、侧脑室室管膜区、室下区、海马、 脊髓、大脑和小脑皮质等7个部位。 但干细胞的数目和发育的模式在不同种属的动物中各 不相同。一般认为，并不是一群干细胞散布于多处，而是 在不同部位存在着不同的干细胞群。如有些干细胞依赖EGF 而发育，有些是FGF依赖神经干细胞，都具有自我新和多向 分化的能力。
迁徙是神经干细胞分化的必经阶段 发育中的神经干细胞只有迁移到特定的组织才能分化为 特殊功能的神经元

体外培养神经干细胞移植到宿主体内后，经过一定的时 间生长，移植细胞不仅可以存活，一定数量的细胞还可 以迁出移植区，与宿主组织建立联系。 神经干细胞具有迁徙能力，这使得在脑血管病的治 疗中，可以将神经干细胞移植到损伤区边缘