蛋白质的研究方法与原理
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分离基本原理：不同蛋白质在两相之间具有不同的分 配系数。两相作相对运动时，分子在两相间进行多次 的分配，使它们具有微小差异的分配系数逐级得到放 大，最终达到分离的效果。
（一）凝胶过滤层析
凝胶过滤层 析因操作简 单、快速， 广泛应用于 蛋白质的脱 盐、分离提 纯。
（二）离子交换层析
可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、 选择性好，分离速度快等优点，广发用于蛋白质的分离纯 化。
⑥在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/L二硫苏糖醇（DTT） (或 β-巯基乙醇），防止含巯基的蛋白质被氧化；
⑦避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性；
⑧使用灭菌溶液，防止微生物生长。
三、蛋白质纯化的一般设计原则
①在材料选取上，尽可能选取来源方便、成本低、易操 作的组织或细胞，其中目标蛋白的含量和活性要尽可 能高、可溶性和稳定性尽可能好；
（一）盐析法
盐析法：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和 电荷而使蛋白质沉淀。 分段盐析法：各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不 同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分 别沉淀出来。 优点：操作简便
对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。 缺点：分辨率低，后续需要进一步除盐
（一）有机溶剂沉淀法
二、离心技术分离蛋白质
离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力， 使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使 某些颗粒达到浓缩或与其它颗粒分离的目的。
在单位离心场力作用下，溶质分子沉降的速率为：
dx/dt = ω2x•S
其中ω为离心角速度，t为离心时间，x为溶质离开中心轴的距离，S为沉降系 数（单位秒）。沉降系数的大小与蛋白质的密度与形状相关，一般蛋白质 的沉降系数为10-13~10-12秒。人们以Svedberg单位来表示沉降系数，1S = 1×10-13秒。
蛋白质的研究方法与原理
第一节 概 述
一、蛋白质分离纯化的一般程序
①材料的选择和预处理（如动物组织要去除结缔组织、 植物种子先行去壳和除脂、微生物需将菌体与发酵液 分开等）；
②细胞的破碎（有时需分离细胞器）； ③提取； ④纯化(包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、
层析、超离心及结晶等)； ⑤浓缩、干燥及保存。
基本原理
（1）有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了蛋白 质分子间的电荷相互吸引，导致溶解度下降 （2）有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的 水化膜，也促使蛋白质变得不稳定而聚集析出。 常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、正丁醇
高浓度的有机溶剂容易引起蛋白质变 性，为此应采取以下措施：
• 低温操作 • 边加有机溶剂边震荡混匀以免局部浓度过大 • 添加0.05mol/L左右的中性盐 • 操作后尽快除去有机溶剂
固定相的非极性强，而流动相的极性相对较高，样品中极性较高 的组分先被洗脱，极性较低的组分后被洗脱。
（七）高效液相层析（HPLC）
HPLC分离能力强、测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极 广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不 稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物 碱、类固醇和类脂等尤为有利。
（三）选择沉淀法
选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不 影响目标蛋白质的分离方法。
例：
将提取液加热至一定温度并维持一段时间，使某些 不耐热的蛋白质变性沉淀等。 惰性液体（如氯仿）震荡和利用泡沫形成使某些蛋 白质产生表面变性。
（四）蛋白质结晶
蛋白质结晶：是溶液中的蛋白质由随机状态转变
为有规则排列状态的晶体，从溶液中析出的过程。 常用于分析研究其结构。
②建立一个快速、准确、具有良好特异性和重现性的蛋 白活性检测方法。
③遵循先粗分再细分的原则，即先利用目标蛋白的某一 种理化特性，采用最简单的方法去除最主要的杂质， 然后再利用他的其他特性进行细致的分离纯化，有时 需多步纯化才能达到目的。
第二节 蛋白质的分离纯化技术
性质
方法
溶解度的差异 盐析、萃取、溶剂抽提、选择性沉淀、 结晶、分配层析、逆流分配等
（三）聚焦层析
在等电聚焦基础上发展起来的一种离子交换柱层析。聚焦效应 是指蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程。
（四）亲和层析
利用生物分子间存在着特异的相互作用，如抗原-抗体、 酶-底物、激素-受体等。
（五）疏水作用层析
属于吸附层析，用于离子交换层析很难或不能分离的物质
（六）反相层析
二、蛋白质纯化的注意事项
①尽量减少分离纯化的步骤，缩短操作时间，维持低温， 使用温和的溶剂，操作也要温柔；
②提取液不要太稀，蛋白浓度维持在μg/ml～mg/ml； ③选择合适的缓冲溶液和pH，避免与目标蛋白pI相同，
防止蛋白质的沉淀；
④使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；
⑤在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防 止DNA对蛋白的污染；
差速离心法
通过逐步增加相对离心 力，使一个非均相混合 液内形状不同的大小颗 粒分步沉淀。
常用来分离亚细胞结构、 粗提的核酸、蛋白质。
2
[ ] S未知
Mr未知 3
=
S已知
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Mr已知
利用S粗估蛋白质分子量
三、层析技术分离纯化蛋白质
是利用不同物质的理化性质的差异而建立起来的技术， 也称色谱技术。
最基本的特征： 固定相 流动相
分子的大小与形状 超滤、透析、差速离心、凝胶电泳、分
的差异
子筛层析等
电荷的差异
电泳、等电点沉淀、离子交换层析、吸 附层吸、聚焦层析等
生物功能专一性的 亲和层析 差异
疏水性的差异 疏水作用层析、反相高效液相层析
一、蛋白质的沉淀与结晶
• 改变蛋白在溶液中的溶解度，让目标蛋白或 杂质蛋白沉淀下来，实现分离
（八）扩张柱床吸附层析
针对基因工程产品中包涵体复性过程中产生的问题，节省时间和 成本
(1) 层析柱平衡 (2) 样品由下而 上注入 (3).细 胞碎片等不吸 附祖坟的从上 流出，红色的 可吸附蛋白与 填料结合到 (4) 重新压缩装柱， 由上而下，洗 脱蛋白。
（九）置换层析
置换剂对亲和性大于吸附蛋白，一点点把吸附能力弱的蛋白推出， 分辨率高
置换剂的推动下，形成一 系列已分离的置换序列
四、电泳技术分离蛋白质
（一）凝胶过滤层析
凝胶过滤层 析因操作简 单、快速， 广泛应用于 蛋白质的脱 盐、分离提 纯。
（二）离子交换层析
可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、 选择性好，分离速度快等优点，广发用于蛋白质的分离纯 化。
⑥在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/L二硫苏糖醇（DTT） (或 β-巯基乙醇），防止含巯基的蛋白质被氧化；
⑦避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性；
⑧使用灭菌溶液，防止微生物生长。
三、蛋白质纯化的一般设计原则
①在材料选取上，尽可能选取来源方便、成本低、易操 作的组织或细胞，其中目标蛋白的含量和活性要尽可 能高、可溶性和稳定性尽可能好；
（一）盐析法
盐析法：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和 电荷而使蛋白质沉淀。 分段盐析法：各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不 同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分 别沉淀出来。 优点：操作简便
对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。 缺点：分辨率低，后续需要进一步除盐
（一）有机溶剂沉淀法
二、离心技术分离蛋白质
离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力， 使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使 某些颗粒达到浓缩或与其它颗粒分离的目的。
在单位离心场力作用下，溶质分子沉降的速率为：
dx/dt = ω2x•S
其中ω为离心角速度，t为离心时间，x为溶质离开中心轴的距离，S为沉降系 数（单位秒）。沉降系数的大小与蛋白质的密度与形状相关，一般蛋白质 的沉降系数为10-13~10-12秒。人们以Svedberg单位来表示沉降系数，1S = 1×10-13秒。
蛋白质的研究方法与原理
第一节 概 述
一、蛋白质分离纯化的一般程序
①材料的选择和预处理（如动物组织要去除结缔组织、 植物种子先行去壳和除脂、微生物需将菌体与发酵液 分开等）；
②细胞的破碎（有时需分离细胞器）； ③提取； ④纯化(包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、
层析、超离心及结晶等)； ⑤浓缩、干燥及保存。
基本原理
（1）有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了蛋白 质分子间的电荷相互吸引，导致溶解度下降 （2）有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的 水化膜，也促使蛋白质变得不稳定而聚集析出。 常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、正丁醇
高浓度的有机溶剂容易引起蛋白质变 性，为此应采取以下措施：
• 低温操作 • 边加有机溶剂边震荡混匀以免局部浓度过大 • 添加0.05mol/L左右的中性盐 • 操作后尽快除去有机溶剂
固定相的非极性强，而流动相的极性相对较高，样品中极性较高 的组分先被洗脱，极性较低的组分后被洗脱。
（七）高效液相层析（HPLC）
HPLC分离能力强、测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极 广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不 稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物 碱、类固醇和类脂等尤为有利。
（三）选择沉淀法
选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不 影响目标蛋白质的分离方法。
例：
将提取液加热至一定温度并维持一段时间，使某些 不耐热的蛋白质变性沉淀等。 惰性液体（如氯仿）震荡和利用泡沫形成使某些蛋 白质产生表面变性。
（四）蛋白质结晶
蛋白质结晶：是溶液中的蛋白质由随机状态转变
为有规则排列状态的晶体，从溶液中析出的过程。 常用于分析研究其结构。
②建立一个快速、准确、具有良好特异性和重现性的蛋 白活性检测方法。
③遵循先粗分再细分的原则，即先利用目标蛋白的某一 种理化特性，采用最简单的方法去除最主要的杂质， 然后再利用他的其他特性进行细致的分离纯化，有时 需多步纯化才能达到目的。
第二节 蛋白质的分离纯化技术
性质
方法
溶解度的差异 盐析、萃取、溶剂抽提、选择性沉淀、 结晶、分配层析、逆流分配等
（三）聚焦层析
在等电聚焦基础上发展起来的一种离子交换柱层析。聚焦效应 是指蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程。
（四）亲和层析
利用生物分子间存在着特异的相互作用，如抗原-抗体、 酶-底物、激素-受体等。
（五）疏水作用层析
属于吸附层析，用于离子交换层析很难或不能分离的物质
（六）反相层析
二、蛋白质纯化的注意事项
①尽量减少分离纯化的步骤，缩短操作时间，维持低温， 使用温和的溶剂，操作也要温柔；
②提取液不要太稀，蛋白浓度维持在μg/ml～mg/ml； ③选择合适的缓冲溶液和pH，避免与目标蛋白pI相同，
防止蛋白质的沉淀；
④使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；
⑤在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防 止DNA对蛋白的污染；
差速离心法
通过逐步增加相对离心 力，使一个非均相混合 液内形状不同的大小颗 粒分步沉淀。
常用来分离亚细胞结构、 粗提的核酸、蛋白质。
2
[ ] S未知
Mr未知 3
=
S已知
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Mr已知
利用S粗估蛋白质分子量
三、层析技术分离纯化蛋白质
是利用不同物质的理化性质的差异而建立起来的技术， 也称色谱技术。
最基本的特征： 固定相 流动相
分子的大小与形状 超滤、透析、差速离心、凝胶电泳、分
的差异
子筛层析等
电荷的差异
电泳、等电点沉淀、离子交换层析、吸 附层吸、聚焦层析等
生物功能专一性的 亲和层析 差异
疏水性的差异 疏水作用层析、反相高效液相层析
一、蛋白质的沉淀与结晶
• 改变蛋白在溶液中的溶解度，让目标蛋白或 杂质蛋白沉淀下来，实现分离
（八）扩张柱床吸附层析
针对基因工程产品中包涵体复性过程中产生的问题，节省时间和 成本
(1) 层析柱平衡 (2) 样品由下而 上注入 (3).细 胞碎片等不吸 附祖坟的从上 流出，红色的 可吸附蛋白与 填料结合到 (4) 重新压缩装柱， 由上而下，洗 脱蛋白。
（九）置换层析
置换剂对亲和性大于吸附蛋白，一点点把吸附能力弱的蛋白推出， 分辨率高
置换剂的推动下，形成一 系列已分离的置换序列
四、电泳技术分离蛋白质