微生物检测领域新技术介绍

Cepheid Smart Cycler
BioRad- IQBio
BioControl GDS
DuPont BAX
Biomereiux VIDAS
BECTON DICKINSON METHOD KEY
= PCR methods = Colourimetric methods = Plate Based Methods
缺点：耗时费力，无法高通量，容易假阴性 或假阳性，低菌数的样品需要过滤浓缩。

ATP快速检测法(三磷酸腺苷) 优点：生产线或管道清洁程度快速检测；纯 培养微生物数量粗略定量；无菌产品保温 数天后高通量快速检测；
缺点：ATP法一般检测限细菌是10000个，酵 母10个；受非微生物ATP干扰易出现假Baidu Nhomakorabea性 结果；微生物的生长状况影响，样品保存 条件，基质的干扰等各种因素影响较大

免疫磁分离方法，无需选择性增菌，快速 实现高特异性分离。 大样循环，提高灵敏度 减少样品基质的干扰 减少其它微生物的干扰，减少假阳性

PATHATRIX HAS BEEN SUCCESFULLY COUPLED TO….
IDAHO RAPID LT Applied BioSystems ROCHE Light Cycler
混合样 50,000 µl
PCR / ELISA 5 µl - 100 µl
非选择性 增菌数小 时或过夜 250mL或 1375mL循 环捕获

外磁场捕获磁分离
磁分离捕获样品中微生物
洗涤去除干扰杂质
撤离磁场，洗脱，实现大样浓缩
最快
较快
较慢
•
通常绝大多数病毒带负电荷，Matrix公 司提供一种试剂PCAT50，它是一种带 磁性的阳离子树脂，可以将大量样品 中的病毒通过循环捕获进行浓缩纯化， 可以大大提高灵敏度，减少样品基质 的干扰。

速度慢

经典时间 2 – 14天 事后性的追溯 速度与灵敏度的折衷方案

灵敏度不一致

结果取决于微生物区系，培养基及培养条件

孢子、受抑制的或厌氧的微生物需要延长相当长 的培养时间

显微镜快速计数 优点：辅助适当染色剂，可快速地用于澄清 的、高菌数的样品进行定性或粗略定量检 测，一般用于水、饮料、酒类产品中的无 菌检测或污染菌检测
35个光学 检测头全 方位检测 光谱信号

鉴定成本低至1元人民币，与其它产品相比， 无需专用鉴定耗材，检测成本几乎可以忽略
鉴定速度快。只需挑取菌种，用无菌过滤水 稀释后上机鉴定，10分钟出鉴定结果。 目前可鉴定26种常见致病菌，数据库正在不 断升级中。 已经获得AOAC权威认可

免疫磁分离由于采用了大样循环，只需将 菌增菌至102-103/mL就已经足够。
减少样品基质的干扰，提高检测灵敏度 加快检测速度

处理公共应急突发事件，将免疫磁分离与 定量PCR结合，快速在2小时内获取结果。 做为一个方法储备

东莞兽医站、北京兽医卫生监督所 浙江质监局、杭州质监局 北京应用科学研究院理化研究所 宁波CIQ，北京CIQ，江苏CIQ，浙江 CIQ，天津CIQ，河北CIQ，安徽CIQ， 北京检科院 军事科学院(北京，天津各1) 上海松江CDC

物理参数间接测定微生物(电导率、二氧化碳、 颜色) 优点：菌数越高，越快出结果.电导率方法成 本较低
缺点：需要做标准曲线；要让菌数长到上百万 个才有明显的信号变化；基于二氧化碳和颜 色变化的方法检测成本太高；受样品基质干 扰较大；微生物区系复杂偏差较大。
优点： 直接对单个细胞进行计数，无需长成菌落； 检测时间只需1小时； 灵敏度可以达到1-100个菌 有全自动或半自动仪器可选 缺点： 仪器投入较大；检测成本相对较高。



认证号： 2009_060901 认证结论： The PTM blind test score of 99% indicates that the MIT 1000 RMID System can accurately identify Listeria and distinguish it from other bacteria and we recommend that this Method be approved by AOAC RI. The test protocol required a total of 81 blind tests – 55 done by the MIT laboratory and 26 done by the USDA ARS laboratory. Eighty of 81 tests were correctly identified yielding a score of 99%.
Add 100 µl PBS to Re-suspend the beads
Capture Beads for 1 min
PCR +VE ? 18 µl 96 10 µl Test Sample Cap and Spin (3 secs) Add 10 µl of PCR Reconstitution Buffer to ‘unknown’ test vial Transfer 10 µl of bead free supernatant to ‘unknown’ vial MIX WELL Place test capillaries in R.A.P.I.D. LT carousel, Check -/+ PCR controls are in position 1&2 Close lid and follow screen shot protocol to begin PCR test
10 µl Reconstitution Buffer
(optional) PLATE OUT bead suspension from Pathatrix (75 µl)
Transfer 18 µl from ‘Unknown’ test vials to capillaries.
单独用定量PCR检测微生物干扰物质多 4 5 单独用定量PCR需要将菌增菌至10 -10 /mL， 时间较长 免疫磁分离可大大减少干扰
TECRA ELISA
OXOID
取样量比较
KEY
= 225 ml +25 g food sample – standard Pathatrix = 50 ml Pooled sub-sample = 0.05 - 0.1 ml PCR/ELISA sub-sample
完整样品 250,000 µl
华粤行仪器有限公司
广州市华粤行仪器有限公司 产品经理 邹黎明
沉降法测浮游菌
人工稀释
自动稀释
研 钵 搅拌机
混合器
低效率
高效率，高噪声
高效率，低噪声
传统灭菌及手动倒平板
自动制备及分装系统
手工液 体分装
蠕动泵液 体分装
自动液体分装
手工计数 压力传感式 累加计数
简单的自动 菌落计数
高级自动 菌落计数
手工鉴定
数据编码软 件辅助鉴定
全自动微生物鉴定系统

致病微生物检测： 快速检测组合：免疫磁分离＋定量PCR 快速低成本致病菌鉴定 基因芯片 生物传感器
常规微生物项目： 超快速流式细胞微生物快速检测


灵敏度问题 导致出现假阴性结果 检测速度问题 通常需要3-7天


25g+225g(mL)稀释→均质→增菌（1－3次）→挑 取一接种环选择性分离→可疑菌落进行鉴定 每接种环一般为1－10uL，也即是说250mL体系里 要有25万个－2.5万个菌才有可能挑中一个菌。

“零”成本微生物鉴定时代即将来临
美国MIT公司全称Micro Emaging Technology 是一家上市高新技术公司(OTCBB "MMTC"), MIT采用全新专利技术研发的MIT 1000致病 微生物快速鉴定系统，是一项具有划时代 的影响深远的革命性的技术，对微生物检 测领域无疑是一次质的飞跃和突破，从此 政府和企业不必再承担高昂的微生物鉴定 成本。
线性流体 单细胞分析 高灵敏检测器
绿光检测器
激光 鞘液流速：10mL/min 样品流速：200uL/min
红光检测器
与鞘液混合后的废液
自动化仪器，减少人工操作
前处理后的样品放入自动仪器中
每批25或50个样品
全自动标记和过滤
自动加所有试剂 自动控制保温温度和时间

快速灵敏的分析
每小时50个样品 结果直接显示每mL多少个菌数




芽胞菌：蜡样芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌 产气肠杆菌 粪肠球菌 E.coli, E. coli O157:H7 肺炎杆菌 克氏库克菌 李斯特菌spp 奇异变形杆菌，普通变形杆菌 绿脓杆菌 沙门氏菌：猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌 志贺氏菌：鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌 葡萄球菌：金黄色葡萄球菌、抗新青霉素型金黄色葡萄球菌、表皮葡 萄球菌 化脓性链球菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌




食品、药品和化妆品企业对致病菌进行快 速鉴定用
政府检测机构对致病菌进行快速低成本鉴 定 CDC、医院等对病原菌进行快速鉴定，节 省大量检测成本。

数据库还需要再扩充 在中国的标准化问题 进一步增加AOAC认证项目

华粤企业集团有限公司
流式细胞与活细胞荧光标记技术 在微生物快速检测中的应用

样品过滤或稀释 平板上培养 培养 2-14天读数
Growth phase 2 - 14 days
Single cell
Colony
90%的微生物测试使用此方法达到 130 年之久，倾注平板法由Robert Koch (1843-1910) 和 Julius Richard Petri (1852-1921) 发明，从单细胞至可 见菌落需要几天时间


MIT 1000采用全新设计理念，与传统的检测表型 或基因型方法鉴定微生物的原理完全不同，它采 用660nm激光照射微生物活体细胞，通过35个光 学检测器全方位检测反射和透射光谱信号，信号 经过特殊算法合成一个光谱图，每种微生物的特 征图谱是不同的，用各种标准菌株建立光谱图数 据库，鉴定时系统只需分析10-50个细胞的光谱图 ，在10分钟内将检测到的图谱与数据库对比，给 出最可能的鉴定结果。

活细胞的标准:
活性底物
酶活力 膜完整性

酶
用于: TVC总活菌数 酵母和霉菌总数

游离荧光色原
细菌
细菌
酵母
霉菌
流式细胞技术在微生物检测中的应用
用于可过滤或不可过滤产品的微生物 快速计数
灵敏度可以达到1-100个细胞
30-60min完成检测
单细胞标记检测技术
流式细胞:

鞘液
标记后的样品

Fluorassure® Reagents
荧光标记试剂
ChemScan ® RDI
细胞扫描读数 用于可过滤产品
D-Count®
全自动流式细胞 用于可过滤或不可过滤产品
BactiFlow®
紧凑型流式细胞仪 用于可过滤或不可过滤产品
基于单个完整细胞的荧光标记技术 可对总活菌数及特定微生物 十几年工业应用经验 大量的科学文献支持


灵敏度问题
25g+225g(mL)稀释→均质→增菌（1－3次） →取1mL菌液提取DNA →PCR检测 一般定量PCR方法的检测限从数十个至几千 个菌，也即是说250mL体系里要有数万个至 上百万个菌才有可能检出。


加大取样量 优化前处理方法，减少样品基质的干扰 优化非选择性或选择性增菌培养基 优化分离培养基，最好能使用显色培养基
Pathatrix免疫纯化 30分钟
定量PCR快速确认 <1hr
便携式设计 主要用于移动检测车 在美国主要用于CDC 及军方

STANDARD PATHATRIX SAMPLE
Magnetic Capture Rack
25 µl Bead free Supernatant Transfer 25 µl of bead suspension into Small Bead Tube Replace cap and Bead Beat for 5 min on Vortex Genie with Turbo Mix on highest setting