第九章核酸降解和核苷酸代谢优秀课件

限制性内切酶的发现
1953年，Arber研究噬菌体与细菌的关系，发现限制现象。 1962年，Arber发现大肠杆菌对外来侵入的DNA有限制作
用。预言了DNA限制性内切酶的存在。 1968年，H·O·Smith分离出第一个内切酶。 1971年，D·Nathans应用内切酶切割SV-40病毒的DNA，
嘧啶核苷酸合成特点
先合成嘧啶环，再与PRPP连接； 先合成UMP，再转变成其他嘧啶核苷酸。
氨甲酰磷酸合成
2A TP 2A D P+Pi
RNA酶A 逆转录酶
降解RNA 补平反应，合成cDNA或制探针
碱性磷酸酶
切除核酸末端磷酸基
核苷酸的进一步水解
H2
核苷酸 O
H2 O
5-Pi-戊糖+碱基
仅在E.Coli和棕 色固氮菌中发现
碱基＋戊糖 仅对植物和微生
物的核糖核苷酸
H2 O
核苷+ Pi Pi
碱基＋1-Pi-戊糖
核苷酸分解代谢
➢ 核苷酸水解，产生磷酸和核苷。核苷可在核苷酶的 作用下进一步分解为戊糖和碱基。
第九章核酸降解和 核苷酸代谢
核酸水解
酸水解 糖苷键、磷酸酯键均可酸水解 最不稳定为嘌啉与脱氧核糖间的糖苷键
碱水解 RNA的磷酸酯键易碱解，DNA耐受 碱浓度0.3-1M,37℃18－24h完成
核酸酶解
外源核酸在小肠发生有限的消化吸收 核酸在核酸酶的作用下，水解为寡核苷酸或单核苷酸 单核苷酸可进一步降解为碱基、戊糖和磷酸。
限制性内切酶的命名
限制酶由三部分构成，即菌种名（斜写）、菌系 编号、分离顺序。
HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae， “ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的 第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
嘌呤核苷酸的 生物合成
嘧啶碱合成的元素来源
C
Gln
N 3 4 5C
Aபைடு நூலகம்p
CO 2
C 2 1 6C N
嘧啶核苷酸“从头 合成”途径
合成嘧啶的原料主要是CO2、NH3 和天冬氨酸。
生物体先利用小分子化合物形成 嘧啶环，形成乳清酸，然后再与 核糖磷酸结合形成嘧啶核苷酸。
首先形成的是尿苷酸，然后再转 变为其它嘧啶核苷酸。
获得了第一个DNA的内切图谱 限制性内切酶的发现启动了基因工程时代 三人共享了1978年的诺贝尔奖
限制与修饰现象
限制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的 甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。
修饰和限制现象是50年代初发现的一种细菌自卫的方式。 细菌内两种不同功能的酶：限制性内切酶；甲基化酶。 甲基化酶能识别限制性内切酶所识别的碱基顺序，并把
➢ 氧化降解，环不打破; ➢ 最终产物:尿酸; ➢ 嘌呤代谢障碍: 痛风症
嘌呤代谢的终产物
尿 酸 灵长类，鸟类、爬虫类、昆虫等
尿囊素 哺乳动物（灵长类除外）
尿囊酸 硬骨鱼
尿 素 大多数鱼类、两栖类
氨
甲壳类、咸水瓣鳃类
嘧啶分解代谢特点
还原降解，环被打破
胞嘧啶
尿嘧啶
胸腺嘧啶
β -脲基丙酸 H2O
β -脲基异丁酸 H2O
限制性内切酶的特点
识别长度为4-8个核苷酸的特异序列； 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序列：
5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如 BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC ↓GGG)
H2N CH2 CH2 COOH
β -丙氨酸
CO2 + NH3
H2N CH2 CH COOH CH3
β -氨基异丁酸
核苷酸的生物合成
生物体内的核苷酸，可以直接利用细胞中自由存在 的碱基和核苷合成（补救途径），也可以利用氨基 酸和某些小分子物质为原料，经一系列酶促反应从 头合成核苷酸（从头合成途径）。
连接两个DNA分子或片段
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 制作DNA探针；合成cDNA第二链； 填补双链DNA
或Klenow酶
3`凹端； DNA测序。
Taq DNA 聚合酶
聚合酶链式反应（PCR）
多核苷酸激酶
多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针
末端转移酶 S1核酸酶 DNA酶Ⅰ
使3`-末端加同聚物尾 降解单链DNA或RNA 在双链DNA上产生随机切口
同裂酶与同尾酶
来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同功 异源酶 (isoschizomer), 有时也称同裂酶；
有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性 末端，这些酶称为同尾酶（isocaudamer)
基因工程常用工具酶
酶
主要用途
限制性核酸内切酶
识别DNA特定序列，切割DNA分子
DNA连接酶
核酸外切酶和核酸内切酶
根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为 核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶 （endonuclease）。
有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下 单核苷酸，所以称为核酸外切酶。
核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。
限制性内切酶
20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶， 能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列 内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。称为限制性 核酸内切酶（restriction endonuclease）
➢ 不同种类生物降解嘌呤碱基的能力不同，代谢产物 的形式也各不相同。人类、灵长类、鸟类、爬虫类 以及大多数昆虫体内缺乏尿酸酶，故嘌呤代谢的最 终产物是尿酸。
➢ 嘧啶的降解：嘧啶碱的分解过程比较复杂，包括水 解脱氨基作用、氨化、还原、水解和脱羧基作用等。
嘌 呤 核 苷 酸 分 解
人体嘌呤分解代谢的特点
其中某些碱基甲基化。 被修饰酶甲基化了的DNA就不能被限制性内切酶降解
三类限制与修饰酶
类型Ⅰ：多亚基双功能酶，甲基化和切割由同一酶完成。 识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点
类型Ⅱ：修饰和限制由两个分开的酶完成。能识别双链 DNA的特殊序列，并可特异切割DNA
类型Ⅲ：双亚基双功能酶，切割位点在识别位点下游2426bp处。