乳酸菌菌种的分离筛选办法

乳酸菌菌种的分离筛选办法

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乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，

需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用mRs琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，sL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用gYp培养基，链球菌有TYc培养基、ms培养基。m17培养基被用作乳球菌的分离培养基。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在mRs培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。一.筛选方法：1.溶钙圈法：

利用一些产酸类细菌在含caco3的培养基上产生caco3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入caco3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；

②中和产生的酸，以维持培养基的ph。

筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶

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钙圈的菌落反复在mRs培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。2.溴甲酚绿指示剂法：

培养基：mRs培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）

筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。二.菌种的分离筛选1.培养基：

℃1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10bx）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/Lph自然（分离用）℃℃1.2牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L 番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐温0.05êco315-20g/L溴甲酚绿0.01%ph6.0-6.5（分离用）℃1.3番茄汁碳酸钙培养基：酵母膏7.5g/L 葡萄糖10g/L番茄汁100mL蛋白胨7.5g/LKh2po42.0g/L吐温

0.5mLph6.0-6.5（分离用）

1.4葡萄糖20g/L酵母膏10g/Lph6.0-6.51.5蛋白胨8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖

13-15g/LKh2po41.5-2.0g/Lmgso40.3-0.5g/Lmnso40.2-0.25g/LnaAc3.0-5. 0g/Lph5.5-6.51.6蛋白胨0.8-1.0g/L糖蜜3.0-5.0g/L酵母膏3-5g/L玉米浆0.5-1.0g/LKh2po40.1-0.3g/Lmgso40.3-0.5g/Lnac13-5g/L葡萄糖8-10g/Lph5.5-6.5（发酵或种子培养基）℃℃1.7mRs培养基（分离培养计数用）蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1L,ph6.5。（分离培养基），当mRs培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀,倒平板。1.8bcp培养基（溴甲酚紫培养基）乳糖5.0g蛋白胨5.0g 酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000mlph6.5-7.0（分离用）1.9bcg牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒精溶液0.07ml，0.075mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml 水中，加酵母膏1.0g溶解后调ph6.5-6.8，0.1mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

精心整理2.分离筛选：

2.1富集培养：取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.2.2菌种分离纯化：溶钙圈法：富集菌液或样品适当稀释至10，混菌法分离，先加入10-12mlmRs 培养基?或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状

或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于mRs培养基培养后保存备用。或接入液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于mRs培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备用。2.3性能测定：乳酸菌定性试验：不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于mRs液体培养基中25℃37℃温度下培养测不同菌株不同温度的ph。方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0℅高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。

方法2.纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛细血管吸取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为对照，平衡2小时后进行层析，3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值。产酸量测定：5.0ml 发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。

-7精心整理

醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3/样品毫升数x100

同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。3.菌株鉴定：3.1菌落形态：