人工染色体载体
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四、cosmid克隆载体的工作原理
cosmid 克隆载体具有质粒克隆载体的性 质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转 化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。
实际上，使用 cosmid克隆载体主要利用它 的λ噬菌体克隆载体性质 。
19
因为cosmid克隆载体含有 cos位点，可 承载大的 DNA 片段，进行体外包装后能高 效率转导受体细胞 。
14
cosmid 克隆载体具有质粒的复制子，在大肠 杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转 化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下， 同样也会获得扩增。
cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因， 作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带 上基因插入失活的克隆位点。
15
③具有λ噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一 个cos位点。
l fragment cos
2020/6/30
6
一、黏粒的结构特征和用途
黏粒它的大小一般 5-7kb 左
右，用来克隆大片段 DNA。
BamHI PstI
Tcr
克隆的最大 DNA 片段可达 Apr
SalI
45kb。 ①质粒复制起点（ colE1） 象 质粒一样转化和增殖。
pHC79 6400 bp
②抗性标记 Ampr 。
cosmid 克隆载体在克隆了合适长度的外源 DNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以 高效地转导对 λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
16
进入寄主细胞之后的 cosmid克隆载体 DNA 分子，便按照 λ噬菌体DNA同样的方式环化起 来。
但由于cosmid克隆载体并不含有 λ噬菌体的全 部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无 法形成子代噬菌体颗粒。
使用cosmid克隆载体的程序与使用 λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
20
作为λ噬菌体克隆载体，线形重组 λDNA分 子两端必须各有一个 cos末端。而 cosmid克隆载 体只有一个 cos位点，因此必须先对 cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个 cos位点的二 联体线形 DNA分子。
Tcr SalI
pHC79 6400 bp
ori l fragment
cos
5
考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
?它是用正常的质粒同 λ
BamHI PstI
Tcr
Apr
SalI
噬菌体的 cos位点构成。
? cos序列是l 噬菌体
pHC79
DNA 中将DNA包装到噬
6400 bp
菌体颗粒中所需的 DNA ori 序列。
ori
③ cos位点。有的粘粒载体含 有2个cos位点。
2020/6/30
l fragmen cos
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一、黏粒的结构特征和用途
? 能像l -DNA那样进行体外包装，并高效转染受 体细胞；
? 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； ? 重组操作简便，筛选容易； ? 装载量大（ 45 kb）且克隆片段具有一定的大小
P1人工染色体载体（ PAC）
2020/6பைடு நூலகம்30
3
第一节 黏粒（cosmid）载体
? 1978年J.Collins和
BamHI Apr PstI
Tcr SalI
B.Hohn等人发明
构建1.8 kb的l -DNA 片段 + pBR322 片段 装载范围为 31 - 45 ori
kb。
pHC79 6400 bp
2020/6/30
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人工染色体载体:
利用染色体的复制元件来驱动外源 DNA片段复
制的载体称为 人工染色体载体。
模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片 段的DNA片段。
2020/6/30
2
? 目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人工染色体载体（ BAC） 酵母人工染色体载体（ YAC）
黏粒载体（ cosmid ）
l fragment cos
2020/6/30
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第一节 黏粒（cosmid）载体
黏粒克隆载体 （柯斯质粒载体 ） 实际上是质粒的衍 生物，是由英文 “ cos site-carrying plasmid”缩写而成 的，其原意是指 带 cos位点的质粒。
2020/6/30
BamHI Apr PstI
12
λDNA片段除了cos 位点之外，在其两侧还 具有与噬菌体包装有关 的DNA短序列；
质粒DNA部 分则是一个完整的 复制子。
克隆能力为31～ 45kb，而且能够被包 装成为具有感染性能 的噬菌体颗粒。
13
三、 cosmid克隆载体的特征
包括以下 4个方面 ①构建的 cosmid 克隆载体是一种环形双链 DNA分子， —般在5--7kb 。 ②cosmid 克隆载体具有质粒的性质。
由λDNA片段和pBR322
质粒DNA联合组成的。
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pBR322质粒(p43)
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用λ噬菌体基因组的 cro—rⅡ的BglⅡ限制 片段，取代 pBR322质粒DNA的位于1 459～1 666bp之间的Sau3A片段，产生出具有 BglⅡ单 切割位点 的重组体分子。
然后通过 这个位点，将带有 cos序列、长度 为1.78kb 的λDNA 之 BglⅡ片段 插入进去，于是 得到了pHC79柯斯质粒 .
范围； ? 不能体内包装，不裂解受体细胞。
2020/6/30
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二、 构建cosmid克隆载体的策略
根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者 的这些性质，取长去短，设计由 质粒和含有cos位 点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体， 即cosmid 克隆载体 。
9
cosmid 载 体 ----
pHC79
21
当外源DNA片段组入二联体线形 DNA分子， 并且两个 cos位点之间的 DNA核苷酸序列达到足 够长时，两个 cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组 λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌 落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。
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④构建的 cosmid 克隆载体较小，因此能承载比较 大的外源 DNA 片段。
如果cosmid克隆载体的大小为 6.5 kb，按入噬 菌体容许包装的量计算，能承载的外源 DNA片段 最大可达44.5 kb(即51 kb～6.5 kb)，最小的也有 29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用这样的 cosmid 克隆载体能克隆 40kb左右的外源 DNA片段。
四、cosmid克隆载体的工作原理
cosmid 克隆载体具有质粒克隆载体的性 质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转 化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。
实际上，使用 cosmid克隆载体主要利用它 的λ噬菌体克隆载体性质 。
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因为cosmid克隆载体含有 cos位点，可 承载大的 DNA 片段，进行体外包装后能高 效率转导受体细胞 。
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cosmid 克隆载体具有质粒的复制子，在大肠 杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转 化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下， 同样也会获得扩增。
cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因， 作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带 上基因插入失活的克隆位点。
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③具有λ噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一 个cos位点。
l fragment cos
2020/6/30
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一、黏粒的结构特征和用途
黏粒它的大小一般 5-7kb 左
右，用来克隆大片段 DNA。
BamHI PstI
Tcr
克隆的最大 DNA 片段可达 Apr
SalI
45kb。 ①质粒复制起点（ colE1） 象 质粒一样转化和增殖。
pHC79 6400 bp
②抗性标记 Ampr 。
cosmid 克隆载体在克隆了合适长度的外源 DNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以 高效地转导对 λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
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进入寄主细胞之后的 cosmid克隆载体 DNA 分子，便按照 λ噬菌体DNA同样的方式环化起 来。
但由于cosmid克隆载体并不含有 λ噬菌体的全 部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无 法形成子代噬菌体颗粒。
使用cosmid克隆载体的程序与使用 λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
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作为λ噬菌体克隆载体，线形重组 λDNA分 子两端必须各有一个 cos末端。而 cosmid克隆载 体只有一个 cos位点，因此必须先对 cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个 cos位点的二 联体线形 DNA分子。
Tcr SalI
pHC79 6400 bp
ori l fragment
cos
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考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
?它是用正常的质粒同 λ
BamHI PstI
Tcr
Apr
SalI
噬菌体的 cos位点构成。
? cos序列是l 噬菌体
pHC79
DNA 中将DNA包装到噬
6400 bp
菌体颗粒中所需的 DNA ori 序列。
ori
③ cos位点。有的粘粒载体含 有2个cos位点。
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l fragmen cos
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一、黏粒的结构特征和用途
? 能像l -DNA那样进行体外包装，并高效转染受 体细胞；
? 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； ? 重组操作简便，筛选容易； ? 装载量大（ 45 kb）且克隆片段具有一定的大小
P1人工染色体载体（ PAC）
2020/6பைடு நூலகம்30
3
第一节 黏粒（cosmid）载体
? 1978年J.Collins和
BamHI Apr PstI
Tcr SalI
B.Hohn等人发明
构建1.8 kb的l -DNA 片段 + pBR322 片段 装载范围为 31 - 45 ori
kb。
pHC79 6400 bp
2020/6/30
1
人工染色体载体:
利用染色体的复制元件来驱动外源 DNA片段复
制的载体称为 人工染色体载体。
模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片 段的DNA片段。
2020/6/30
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? 目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人工染色体载体（ BAC） 酵母人工染色体载体（ YAC）
黏粒载体（ cosmid ）
l fragment cos
2020/6/30
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第一节 黏粒（cosmid）载体
黏粒克隆载体 （柯斯质粒载体 ） 实际上是质粒的衍 生物，是由英文 “ cos site-carrying plasmid”缩写而成 的，其原意是指 带 cos位点的质粒。
2020/6/30
BamHI Apr PstI
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λDNA片段除了cos 位点之外，在其两侧还 具有与噬菌体包装有关 的DNA短序列；
质粒DNA部 分则是一个完整的 复制子。
克隆能力为31～ 45kb，而且能够被包 装成为具有感染性能 的噬菌体颗粒。
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三、 cosmid克隆载体的特征
包括以下 4个方面 ①构建的 cosmid 克隆载体是一种环形双链 DNA分子， —般在5--7kb 。 ②cosmid 克隆载体具有质粒的性质。
由λDNA片段和pBR322
质粒DNA联合组成的。
10
pBR322质粒(p43)
2020/6/30
11
用λ噬菌体基因组的 cro—rⅡ的BglⅡ限制 片段，取代 pBR322质粒DNA的位于1 459～1 666bp之间的Sau3A片段，产生出具有 BglⅡ单 切割位点 的重组体分子。
然后通过 这个位点，将带有 cos序列、长度 为1.78kb 的λDNA 之 BglⅡ片段 插入进去，于是 得到了pHC79柯斯质粒 .
范围； ? 不能体内包装，不裂解受体细胞。
2020/6/30
8
二、 构建cosmid克隆载体的策略
根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者 的这些性质，取长去短，设计由 质粒和含有cos位 点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体， 即cosmid 克隆载体 。
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cosmid 载 体 ----
pHC79
21
当外源DNA片段组入二联体线形 DNA分子， 并且两个 cos位点之间的 DNA核苷酸序列达到足 够长时，两个 cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组 λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌 落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。
17
④构建的 cosmid 克隆载体较小，因此能承载比较 大的外源 DNA 片段。
如果cosmid克隆载体的大小为 6.5 kb，按入噬 菌体容许包装的量计算，能承载的外源 DNA片段 最大可达44.5 kb(即51 kb～6.5 kb)，最小的也有 29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用这样的 cosmid 克隆载体能克隆 40kb左右的外源 DNA片段。