细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析
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细菌内毒素检测试验注意事项与 误差分析
董光宴 工程师
一、实验注意事项
二、影响试验结果的因素分析
湛江博康海洋生物有限公司
2014年10月24日 博康 1
一、试验操作注意事项
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》P310细菌内毒素检查法
实验前，须用肥皂洗手，用 75 ％酒精棉球消毒。
2014年10月24日
博康
32
2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。 鲎试剂与内毒素反应的最适宜 pH 在 6.5-8.0 ； pH ≤3 或≥ 10 时， 酶活性受到抑制。
相 对 活 力
7.0
PH
2014年10月24日
博康
33
在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将 洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内 毒素进入供试液。 复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1～3 秒，促进鲎试剂的溶解。
2014年10月24日
博康
2
由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程 中及观察结果时应注意不要使试管受到振动， 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素 的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支 细菌内毒素标准品。
2014年10月24日 博康 19
2） 湿度
吸潮
灵敏度增高 挥发
2014年10月24日
博康
20
5 实验器皿
器皿的计量管理（校正）
器皿的选择标准 器皿的正确处理
2014年10月24日
博康
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1） 器皿的选择标准
2014年10月24日
博康
4
二、影响试验结果的因素分析
鲎试剂
细菌内毒素工作标准品
细菌内毒素检查用水 环境
实验器皿
实验人员
样品
试验
2014年10月24日 博康 5
1 鲎试剂
质量标准：WS1-363（B-123）-91
细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于 0.015EU/ml （用于凝胶法）或 0.005EU/ml （用 于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的 灭菌注射用水。
灭菌注射用水
内毒素含量
PH值
无干扰作用
2014年10月24日
博康
17
4 环境
为保证实验结果的准确性，防止污染，内 毒素检查实验应在密闭的洁净室中或密闭实验 室的超净工作台下进行。 ——2010年版药品GMP实施指南
PH对反应速度的影响: 影响酶原的激活； 影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活 性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使 其变性失活。
2014年10月24日
博康
34
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和 6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀
2014年10月24日
博康
25
蒸馏水 有效期 应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器 皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有 的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃 器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复 核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是
由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。
2014年10月24日
博康
3
在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
密闭的洁净室中
密闭实验室的超净工作台
实验室温度：≤26℃
实验室湿度：45%～75%
2014年10月24日 博康 18
1）温度 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查 用水稀释成 2λ ，进行鲎试验，然后分别放置于 25、28、31、34、37、41、43、46、49℃水浴保 温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升 高而加快，但到达 49℃保温 90min 也未出现凝胶。 从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很 大，保温温度在25～41℃之间，随着温度的升高， 反应速度也升高，41℃尚未达到反应速度峰值， 25℃ 时反应速度已相当快；在 41 ～ 46℃之间， 温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；达到 49℃或 更高温度时，随温度升高而使酶蛋白逐渐变性， 则鲎试剂被破坏，反应速度反而降低。
它物质（如 β - 葡聚糖）判定为内毒素，错误将合 格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
2014年10月24日
博康
30
鲎试剂反应机理图
2014年10月24日
博康
31
判断假阳性的方法： 1、特异性鲎试剂法；
2、定量反应曲线分析法；
3、家兔模拟试验法。
博康
14
注意：①只能在安瓿的易折点上部开启内毒素， 不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在 封口膜上。 ②只能取 1ml 的细菌内毒素检查用水复溶 细菌内毒素工作标准品。 ③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可 按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后 分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次 性使用。
2014年10月24日
博康
13
4） 内毒素标准品操作误差 取细菌内毒素工作标准一支，
正确 （易折点）错误
轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，
再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，
用 75% 酒精棉球擦拭后启开，
防止玻璃屑落入瓶内。
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》
2014年10月24日
2014年10月24日
博康
12
3） 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标 准品之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素 工作标准品之间的生物效价存在一定的误差，用 不同细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度 时可能存在一定的误差。
中国药典要求“当 λc 在 0.5λ-2λ( 包括 0.5λ 和 2λ) 时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵 敏度 λ 为该批鲎试剂的灵敏度。”试验结果只要 在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。
2014年10月24日
博康
27
7 样品
β -葡聚糖样物质的影响
PH值的影响 金属离子和弱酸阴离子的影响 药物浓度的影响
2014年10月24日
博康
28
1） β -葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。 鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，
2014年10月24日 博康 9
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素标准品操作误差
细菌内毒素标准品的错误使用
2014年10月24日
博康
10
1） 细菌内毒素标准品种类
细菌内毒素国际标准品（IS2，94/580）
细菌内毒素国家标准品（200707）
细菌内毒素工作标准品（200758-201174）
国外内毒素标准品：国标、工作品
2014年10月24日
博康
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2） 细菌内毒素标准品用途
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取 精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度 和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家 标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵 敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 ——2010年版《中国药典》
国药典》
国外鲎试剂：灵敏度由FDA统一标定
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博康
7
1 鲎试剂
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂
的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方
法是否正确及实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂 进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查 前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 ——2010版《中国药品检验标准操作规程》
博康
23
2） 器皿的正确处理 2010年版《中国药品检验标准操作规范》310页— —细菌内毒素检查法“3 实验准备”规定： 3.1.1 玻璃器皿的洗涤 将玻璃器皿放入铬酸洗液 或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取 出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净， 再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜 的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属 容器内，放置入烤箱。
性状、鉴别、检查、灵敏度测定、 用途、规格、贮藏 应用标准：干扰能力、稳定性 国外标准：无菌
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博康
6
1 鲎试剂
灵 敏 度：在本检查法规定的条件下，使鲎试
剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的
标示灵敏度，用 EU/ml 表示。 ——2010 版《中
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博康
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6 实验人员
负责质量检验的人员应受过适当教育，并经专业 技术培训，具有基础理论知识和实际操作技能。 质量控制实验室所有人员的职责应当书面规定。
内毒素检测人员应经过严格的培训，并应配备相 应的防护设施（如穿防护服、戴口罩、头套等）。
——2010年版药品GMP实施指南
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博康
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3.1.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒 素 玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至 250℃，待 烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤 30 分 钟以上。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温 度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下， 可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装， 在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须 再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
2014年10月24日
博康
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1 鲎试剂
外 观：本品为白色或类白色冻干块或粉末，
在水和生理盐水中易溶。 干扰能力：指在药品、生物制品和血液制品中鲎 试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能 造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判
为内毒素。
鲎试剂参考品：150603-201003，2.2ml/0.06EU
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博康
15
5） 错误使用
使用内毒素工作标准品标定鲎试剂灵敏度
使用厂家的内毒素复核鲎试剂灵敏度
厂家内毒素交叉复核鲎试剂灵敏度
使用厂家的内毒素做干扰实验
厂家的内毒素做于定量实验
2014年10月24日
博康
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3 细菌内毒素检查用水
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光
滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用
注射器，最好使用经过校正的玻璃刻度移液管
或精密移液器。注射器刻度不精确，内壁磨沙
面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引 入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注
射器。
2014年10月24日
博康
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如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用
本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在
此行业中被鉴定为无内毒素和β -葡聚糖污染的产
品，其中包括 , 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便 ,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素 ,很快 分析判断出误差原因。
2014年10月24日
溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典
故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
2014年10月24日
博康
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3） 金属离子和弱酸阴离子 离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面
既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物
质错判为内毒素。
2014年10月24日
博康
29
目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的
物质有细菌内毒素和 β - 葡聚糖，而内毒素反应曲
线为 S 型特征曲线， β - 葡聚糖反应曲线为经过 0 点
的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其
董光宴 工程师
一、实验注意事项
二、影响试验结果的因素分析
湛江博康海洋生物有限公司
2014年10月24日 博康 1
一、试验操作注意事项
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》P310细菌内毒素检查法
实验前，须用肥皂洗手，用 75 ％酒精棉球消毒。
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2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。 鲎试剂与内毒素反应的最适宜 pH 在 6.5-8.0 ； pH ≤3 或≥ 10 时， 酶活性受到抑制。
相 对 活 力
7.0
PH
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在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将 洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内 毒素进入供试液。 复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1～3 秒，促进鲎试剂的溶解。
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由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程 中及观察结果时应注意不要使试管受到振动， 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素 的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支 细菌内毒素标准品。
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2） 湿度
吸潮
灵敏度增高 挥发
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5 实验器皿
器皿的计量管理（校正）
器皿的选择标准 器皿的正确处理
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1） 器皿的选择标准
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二、影响试验结果的因素分析
鲎试剂
细菌内毒素工作标准品
细菌内毒素检查用水 环境
实验器皿
实验人员
样品
试验
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1 鲎试剂
质量标准：WS1-363（B-123）-91
细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于 0.015EU/ml （用于凝胶法）或 0.005EU/ml （用 于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的 灭菌注射用水。
灭菌注射用水
内毒素含量
PH值
无干扰作用
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4 环境
为保证实验结果的准确性，防止污染，内 毒素检查实验应在密闭的洁净室中或密闭实验 室的超净工作台下进行。 ——2010年版药品GMP实施指南
PH对反应速度的影响: 影响酶原的激活； 影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活 性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使 其变性失活。
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故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和 6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀
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蒸馏水 有效期 应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器 皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有 的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃 器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复 核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是
由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。
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在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
密闭的洁净室中
密闭实验室的超净工作台
实验室温度：≤26℃
实验室湿度：45%～75%
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1）温度 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查 用水稀释成 2λ ，进行鲎试验，然后分别放置于 25、28、31、34、37、41、43、46、49℃水浴保 温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升 高而加快，但到达 49℃保温 90min 也未出现凝胶。 从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很 大，保温温度在25～41℃之间，随着温度的升高， 反应速度也升高，41℃尚未达到反应速度峰值， 25℃ 时反应速度已相当快；在 41 ～ 46℃之间， 温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；达到 49℃或 更高温度时，随温度升高而使酶蛋白逐渐变性， 则鲎试剂被破坏，反应速度反而降低。
它物质（如 β - 葡聚糖）判定为内毒素，错误将合 格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
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鲎试剂反应机理图
2014年10月24日
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判断假阳性的方法： 1、特异性鲎试剂法；
2、定量反应曲线分析法；
3、家兔模拟试验法。
博康
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注意：①只能在安瓿的易折点上部开启内毒素， 不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在 封口膜上。 ②只能取 1ml 的细菌内毒素检查用水复溶 细菌内毒素工作标准品。 ③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可 按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后 分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次 性使用。
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4） 内毒素标准品操作误差 取细菌内毒素工作标准一支，
正确 （易折点）错误
轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，
再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，
用 75% 酒精棉球擦拭后启开，
防止玻璃屑落入瓶内。
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》
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3） 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标 准品之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素 工作标准品之间的生物效价存在一定的误差，用 不同细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度 时可能存在一定的误差。
中国药典要求“当 λc 在 0.5λ-2λ( 包括 0.5λ 和 2λ) 时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵 敏度 λ 为该批鲎试剂的灵敏度。”试验结果只要 在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。
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7 样品
β -葡聚糖样物质的影响
PH值的影响 金属离子和弱酸阴离子的影响 药物浓度的影响
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1） β -葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。 鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，
2014年10月24日 博康 9
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素标准品操作误差
细菌内毒素标准品的错误使用
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10
1） 细菌内毒素标准品种类
细菌内毒素国际标准品（IS2，94/580）
细菌内毒素国家标准品（200707）
细菌内毒素工作标准品（200758-201174）
国外内毒素标准品：国标、工作品
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2） 细菌内毒素标准品用途
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取 精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度 和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家 标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵 敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 ——2010年版《中国药典》
国药典》
国外鲎试剂：灵敏度由FDA统一标定
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7
1 鲎试剂
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂
的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方
法是否正确及实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂 进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查 前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 ——2010版《中国药品检验标准操作规程》
博康
23
2） 器皿的正确处理 2010年版《中国药品检验标准操作规范》310页— —细菌内毒素检查法“3 实验准备”规定： 3.1.1 玻璃器皿的洗涤 将玻璃器皿放入铬酸洗液 或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取 出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净， 再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜 的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属 容器内，放置入烤箱。
性状、鉴别、检查、灵敏度测定、 用途、规格、贮藏 应用标准：干扰能力、稳定性 国外标准：无菌
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1 鲎试剂
灵 敏 度：在本检查法规定的条件下，使鲎试
剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的
标示灵敏度，用 EU/ml 表示。 ——2010 版《中
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6 实验人员
负责质量检验的人员应受过适当教育，并经专业 技术培训，具有基础理论知识和实际操作技能。 质量控制实验室所有人员的职责应当书面规定。
内毒素检测人员应经过严格的培训，并应配备相 应的防护设施（如穿防护服、戴口罩、头套等）。
——2010年版药品GMP实施指南
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3.1.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒 素 玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至 250℃，待 烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤 30 分 钟以上。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温 度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下， 可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装， 在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须 再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
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1 鲎试剂
外 观：本品为白色或类白色冻干块或粉末，
在水和生理盐水中易溶。 干扰能力：指在药品、生物制品和血液制品中鲎 试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能 造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判
为内毒素。
鲎试剂参考品：150603-201003，2.2ml/0.06EU
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5） 错误使用
使用内毒素工作标准品标定鲎试剂灵敏度
使用厂家的内毒素复核鲎试剂灵敏度
厂家内毒素交叉复核鲎试剂灵敏度
使用厂家的内毒素做干扰实验
厂家的内毒素做于定量实验
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3 细菌内毒素检查用水
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光
滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用
注射器，最好使用经过校正的玻璃刻度移液管
或精密移液器。注射器刻度不精确，内壁磨沙
面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引 入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注
射器。
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如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用
本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在
此行业中被鉴定为无内毒素和β -葡聚糖污染的产
品，其中包括 , 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便 ,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素 ,很快 分析判断出误差原因。
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溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典
故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
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3） 金属离子和弱酸阴离子 离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面
既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物
质错判为内毒素。
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目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的
物质有细菌内毒素和 β - 葡聚糖，而内毒素反应曲
线为 S 型特征曲线， β - 葡聚糖反应曲线为经过 0 点
的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其