转基因小鼠的制备

转基因小鼠的制备
显微注射法
这一方法的实验程序如下：
⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；
⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。

处理后与可育雄鼠交配。

次日从输卵管收集受精卵备用；
⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核；
⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管，使胚胎在养母体发育成熟；
⑸对幼鼠的鉴定：
①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；
②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。

也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；
③自小鼠脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。

表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。

亦可取胚胎进行分析。

显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。

我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。

基因打靶与基因剔除技术
ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的胚团（inner cell mass）中分离出来的。

它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。

这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。

因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。

正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。

基因打靶是指外源DNA片段上带有与受体细胞染色体相应部位的同源序列，导入ES细胞后在同源部位发生定点整合，这种整合是通过同源重组的方式来实现的。

该方法的一般策略如下：
基因剔除----如果外源DNA含有突变失活的基因，定点整合人ES细胞染色体后取代原来的同源序列，即是基因剔除。

将这样的ES细胞转入小鼠胚胎，便可得到基因剔除的基因小鼠。

多采用突变基因（mutated gene）剔除正常基因以产生定位突变（target mutation）。

即首先选定需要突变基因的全部或部分DNA序列，通过插入、修饰、删除或置换等手段落使其突变，成为靶载体，将靶载体导入小鼠ES细胞中，使之与细胞染色体同源的靶序列进行重组，达到定位突变细胞该基因的目的。

然后在细胞水平和分子水平筛选富集发生突变细胞，并注射到小鼠囊胚腔，将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中，所产生的子代雄性嵌合鼠与正常雌鼠交配可获得生殖系携带该突变基因的纯合鼠。

最后对纯合鼠的表型、基因型、基因表达及其产生等进行分析。

目前筛选真正发生了同源重组的ES细胞的方案有数种，如正负双向选择法（positive and negative selection,pns）、标记基因的特异位点表达法及PCR法，其中用得最多的方法首推pns法。

其基本原理是：构建含有一段与靶基因同源序列（10～15kb）的载体，该序列的一个外显子插有neo r基因作为正选择的标志，在此序列3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（hsv-tk）基因作为负选择，hsv-tk基因由邻近的neo r基因启动子调节。

用电转移（electroporation）法将重组体导入ES细胞，继续作体外培养，并以新霉素（g418）和致死核苷类似物（ganc）作双重筛选。

因随机插入的DNA通常以从头至尾整合入受体细胞DNA中，hsv-tk+基因产物可使ganc转变成一种有毒物质使细胞死亡。

如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neo r基因在同源区之得以保留，这样受体细胞抗g418有正选择作用，对ganc无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的。

plump等（1992）用基因剔除技术已培育出缺apoe基因的tgm模型，并利用这一as小鼠模型研究了饮食和遗传因素对as的影响。

条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。

目前多采用cre-loxp重组系统（cre-loxp-mediated gene replacement ,cre-loxp recombination system）。

其中cre重组酶来源于侵染大肠杆菌p1噬菌体。

分子量38000，无论在大肠杆菌体或体外，它都能启动DNA分子间或分子的联合与重组，重组发生在一个被称为loxp的特异位点（loxp site），且不需要其他的蛋白质因子。

在cre酶存在时，两个loxp位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxp位点。

其原理如上图所示。

研究发现，在哺乳动物细胞中cre重组酶也同样能引起DNA联合和位点特异性重组。

条件性基因剔除系统的建立，使得转基因的目的更加明确，效果也进一步精确可靠，是基因剔除方法上的一个重大突破。

Cre酶作用原理
1、cre基因转译成cre酶；
2、cre酶作用于基因组上loxp位点；
3、cre酶使两个loxp 位点联合；
4、两个loxp位点发生同源重组切除x基因及一个loxp位点而仅留下一个loxp 位点。

1、有待于被剔除的基因组上某野生型基因片段；
2、将一个loxp位点插在野生型基因片段的3’端；
3、将新构建的DNA序列整合到基因组上；
4、在cre酶的作用下切除hsv-tk、neo r野生型基因及一个loxp位点；
5、经过cre-loxp重组系统作用后所形成的DNA序列。

Cu等（1994）在鼠的ES细胞中利用cre-loxp重组系统进行条件性基因剔除的程序如下：①用常规性基因剔除方法将一段新构建的DNA序列整合至源基因组，这段新构建的DNA序列由新的（突变的）基因片段，选择性标记基因hsv-tk及neo r、一个将被取代的正常基因片段等几部分组成。

在此新构建的DNA序列中，在可选择性标记基因
和正常基因片段的两侧都连有loxp位点；②经过基因剔除的ES细胞被一个编码cre重组酶载体迅速传染，因此处于两个loxp位点之间的hsv-tk、neo r及正常的野生型基因均在cre酶的作用下而被切除，只在原来的位置上留下了突变的基因和其3’端带有一个loxp位点，其cre-loxp重组系统进行条件性基因剔除程序如上图所示。

基因打靶
目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞。

但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现：
导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺如；
导入的外源基因整合入细胞正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；
外源基因的导入有可能激活细胞的原癌基因；
导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞不表达或表达难以控制。

为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。

即对细胞靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。

随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。

因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。

同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。

基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术
ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。

胚胎干细胞注入体与完整胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在的一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。

打靶载体的构建-------基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。

基因打靶载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基因置换型载体(Gene—replacement vector)。

插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。

置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。

大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。

外源DNA导人的方式-------外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。

目前应用最广的是显微注射法。

占接受外源DNA细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。

逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。

基因打靶的筛选方法-----正负双向选择系统、正相选择法。

（1）正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)-----为了更好地筛选发生同源重组的克隆，1988年Mansour等人设计了PNS, 解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。

同源重组时，只有载体的同源区以部分发生重组，同源区以外部分将被切除。

随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体。

置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo r基因，位于同源区，其在
随机整合和同源重组中均可正常表达。

负选择基因位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。

胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。

故同源重组时，G418和GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。

用G418作正筛选，选出含有neo r基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。

此方法是目前应用较广泛的一种策略。

正向筛选标记基因Neo r具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。

除了上述方法外，还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞。

常用的选择标记基因：正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶（neo r）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。

负选择标记基因有单纯疱疹病毒
胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）、SacB、rpsl（strA）、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、ccdB等。

（2）正相选择法（positive selection method）--------这种选择法适用于在靶细胞正常表达的基因的定点突变。

其主要程序是：将选择标记基因neo r的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列，将打靶载体转染进靶细胞，可能出现下面几种情况：
①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失；
②外源打靶序列随机整合，由于neo r基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启动子，使neo r基因的表达受阻；
③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neo r基因的表达；
④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neo r基因可借助靶基因自然存在的启动子和起始密码的作用而呈现表达活性。

因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。

位点特异性重组酶(site specific recombinase，SSR)主要有两个成员：来自埃希氏大肠杆菌噬菌体P1的Cre／Loxp重组酶系统和来自酿酒酵母2µ质粒的FIP／FRT系统。

它们以相似的原理在特异性位点切割和连接DNA，诱发重组。

其中Cre／Loxp系统在重组效率上更胜一筹。

Cre重组酶由343个氨基酸组成，分子量38kD，其编码基因长度大概lkb。

Loxp位点则是由34个碱基组成的“靶”基因位点，由8bp非对称的核心序列和两端
各13bp的反向重复序列构成；5-ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT-3 当cre重组酶识别Loxp位点后，可以在该位置切断DNA，并在断端形成中间体。

此后在cre重组酶催化下可重新连接其他DNA片段，由此会产生几个重组结果：
①交叉：如果基因组不同DNA分子上各有一个Loxp位点，可能出现Loxp前后基因片段交叉换位。

②移位：在两个方向相同的Loxp位点之间的基因片段可能会移动到另一个位置的单独Loxp位点上。

③颠倒：同一条DNA分子上有两个Loxp位点，如果顺序相反，则可能出现Loxp位点间基因方向颠倒。

④剔除：同一条DNA分子上有两个Loxp位点，如果顺序相同，则可能出现Loxp位点间基因剔除，仅留下一个Loxp位点。

①
位
酶
时间、空间特异性：如果将Cre结构基因置于某一特定的启动子或其他调节基因控制之下，便会实现Cre酶蛋白在特定组织和特定时
间的可控型表达，继而限定了重组发生的时空性。

②高效性：重组不受切除片段长短及位置影响，可以在活体动物
体内实现，可随细胞分裂和动物传代稳定遗传。

③准确性：在动物模型中至今未发现Loxp位点之外的非特异性重
组。

④快速性：动物实验已证实在受精卵分裂之前的短短时间内，
Cre介导的特异性重组便会完成。

Cre
／
Loxp
点
重
组
系
统
的
作
用
特
点
Cre／Loxp系统可以使某一基因只在特定的组织、细胞及细胞分化、成熟过程中的
某一时段被剔除，这样减少了对系统发育的副作用。

要实现时空特异性基因打靶(spatiotemporal gene targeting，STGT)需经以下三步：
建立诱导型GR基因缺陷小鼠模型。

其步骤大致是：利用同源重组原理在小鼠ES 细胞中将Cre重组酶的识别序列(即loxP位点)插入GR基因第2外显子的两侧，经囊胚注射获得种系嵌合体，然后与表达Cre重组酶的转基因小鼠杂交，由于Cre重组酶的表达受可被诱导性的启动子调控，其表达后loxP位点即发生重组，剔除2个loxP位点之间的序列，从而避免了因该胚胎发育相关基因的剔除导致小鼠死于肺发育不良引发呼吸衰竭而无法获得成体动物的缺点。

基因删除技术的基本操作过程是：
(1)构建打靶载体——首先克隆所要研
究的基因，并弄清此基因的结构，然后
将用于筛选的neo基因插入到此基因
的外显子中(或取代部分外显子)；
(2)转化胚胎干细胞(ES细胞)——将用
于打靶的质粒线性化，并用电转移方法
将打靶质粒导入到ES细胞中；
(3)筛选发生同源重组的ES细胞——
用含G418的培养基筛选具有G418抗
性的细胞单克隆，并等到单个克隆生长
到肉眼可见时，将细胞培养皿中的各个
单克隆转移到96孔细胞培养板的各个
小孔中继续培养，随后培养至双份，其
最初的转基因动物技术存在着盲目性这一缺点，这是因为外源DNA进入受体细胞后可以随机地插入到受体细胞基因组中的任意位置，这样就有可能导致内源有利基因结构的破坏和失活，或激活有害基因(例，癌基因)。

另外，整合到基因组上的外源基因其表达水平也难以预料。

所以，尽管转基因动物技术得到了一些应用，但比较成功的基因打靶载体的构建
用于同源重组的基因打靶载体的构建通常是将所要研究的基因克隆到质粒载体中，并将正选择标志基因——新霉素抗性基因(neo)插入到该基因的外显子中或取代部分外
显子，同时将负选择基因——疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因插入到该基因的3′未端与质粒载体的连接处。

这样当打靶载体进入ES细胞后，只有发生同源重组的ES细胞才能在含有G418和FIAU的培养基中存活，因为HSV-tk基因的产物可使FIAU转变成一种有毒物质并使细胞死亡。

基因打靶载体与ES细胞基因组中的同源基因发生同源重组过程见图3(A)所示。

另外打靶载体在转化ES细胞前需线性化，以免单点同源重组发生，见图3(B)。