小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验

【署名】

指导教师：于晓棠

【摘要】

目的：通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。

方法：使用近交系615小鼠皮下接种腹水型肝癌高淋巴道转移菌株（HCa-F）进行肿瘤淋巴道转移实验，取其淋巴结观察是否有淋巴道转移以及检测瘤株淋巴结转移能力。取肺肝肾组织切片以观察是否有血道转移。

结果：小鼠腹水型肝癌发生淋巴道转移，转移率为40%，并可造成相关器官发生病变。

结论：此方法操作简单，结果直观，小鼠腹水型肝癌淋巴道转移率较高。

【关键词】小鼠腹水型肝癌淋巴道转移

【前言】

为更好地了解肿瘤的发病机制、肿瘤与宿主的关系、肿瘤侵袭与转移的过程和治疗措施的有效性,需要建立合适的动物模型。小鼠与人类在遗传学、病理学、生物学许多特性方面相似,是肿瘤研究的理想动物模型。而且目前的技术能够在鼠的基因水平上设计与人类疾病相关的基因突变而获得相关疾病模型[1]。小鼠模型是目前可以整合基础和临床肿瘤研究的武器[2],已应用于肿瘤研究的各个领域。随着对肿瘤认识的不断深入，以及实验动物学的发展和一些新技术的运用，小鼠肿瘤模型的研究取得了重要进展,并已得到广泛应用。

肿瘤转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一，淋巴结转移是癌早期最常见的转移方式，且淋巴转移还可以成为进一步血道转移的桥头[3]。小鼠腹水型肝癌淋巴道转移试验是研究肝癌的淋巴道转移的生物学特性的试验。因为新近流行病学资料表明，我国的原发性肝癌病人数占全世界肝癌病人的一半以上。由于乙型肝炎、肝炎后肝硬化病人众多，致使我国的肝癌发病率和死亡率居高不下，其死亡率占所有恶性肿瘤的第二位。在上个世纪我国进行大规模的现场筛查，通过早期发现早期治疗，在临床治疗方面取得了巨大进步，使肝癌有不治之症变成了部分可治之症。近来综合治疗技术的发展，大肝癌缩小后二部切除，又使部分病人获得了可治愈机会。随着临床治疗经验的积累，逐渐意识到及时是小肝癌根治性切除，转移复发仍然是一个十分严峻的问题。术后5年复发率可高达50%。解决这些问题，单靠临床经验、病例分析是远远不够的。要涉及到肝癌的实质性问题——肿瘤本身的生物学特性，尤其是其转移的生物学特性。对肝癌转移的生物学行为进行实验研究，必须有一个良好的转移模型系统。

HCa-F是从小鼠腹水型肝癌细胞株H22中筛选出的特异性向淋巴道转移的细胞，HCa-F为高转移细胞株，接种于615小鼠腋中线皮下淋巴结转移率高于80%[4][5]。本实验为感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义提供了很好的帮助。

【正文】

方法：

一。实验材料：

1。细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。

2．实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6—8周龄，体重18—22g，由大连医科大学实验动物中心提供。

3。主要仪器及器皿：搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10% 甲醛固定液等。

二。研究方法

1。细胞系获取：从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞塑料冻存管，立即放入40度的温水中，一分钟内使冻存液全部融化，拉力机送入无菌室中。取出细胞悬液放入离心管中，有生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，在加1ml 生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0。2mlHCa-F细胞悬液，于第6天无菌条件取腹水。

2。615小鼠脚垫接种肿瘤细胞：取615小鼠癌性腹水0。1ml，接种于615小鼠脚垫上。定期观察肿瘤生长及淋巴结肿大情况。四周后处死全部小鼠，取瘤体及相关淋巴结，同时观察肺、肝、肾等器官。将上述组织固定于10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜检查。

3。组织取材：将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚2—3mm的小于2cm×1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定24—48小时。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木精-伊红染色。

4。切片脱色：石蜡切片法、HE染色法。

（1）脱水程序及时间：组织固定，冲洗，然后：

1）脱水。以下列顺序进行：60%酒精30分钟→80%酒精1—2小时→95%酒精2—4小时或过夜→95%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时或过夜;

2）透明：二甲苯I30—45分钟；二甲苯Ⅱ30—45分钟;

3）浸蜡。蜡碗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（各30—45分钟）；包埋;

4）修蜡块。修蜡块，贴号;

5）切片;

6）烘烤。烘烤切片60—70摄氏度，1小时;

7）染色。

（2） HE切片染色程序与方法:

1) 切片脱蜡水洗：

将烘干的切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟。无水酒精5分钟（消除二甲苯）→95%酒精2分钟→80%酒精2分钟→70%酒精2分钟→50%酒精2分钟→自来水冲洗5分钟（洗去切片上的酒精，切片透明）→蒸馏水清洗（防止污染苏木精染液）。脱蜡是水华过程，目的是通过酒精的缓冲作用，易于水洗与染色。因为染剂是谁，从无水酒精直接放入染液中，容易引起激烈的扩散作用，造成切片漂浮脱落或损伤组织。而经各级浓度酒精缓冲后即可避免发生这种现象。

2) HE染色：

苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的果然，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核呈明显的蓝色，胞质及背景无色。再经水

洗后用伊红染胞质，染成深浅不同程度的粉红色至红色。苏木染色（染核）15分钟→自来水冲洗3分钟→0。5%盐酸酒精溶液分化数秒钟→自来水洗2分钟→弱碱性水溶液显蓝30-60秒→自来水冲洗5分钟→伊红1分钟→蒸馏水洗1-2次。

3) 脱水、透明、封固：

脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固，便于观察和长期保存。 80%酒精10秒→95%酒精10秒→无水酒精Ⅰ3分钟→污水酒精Ⅱ3分钟→二甲苯Ⅰ5分钟→二甲苯Ⅱ5分钟→中性树胶封固。

显微镜下观察淋巴结转移的分布：

1。皮下瘤体：

大体：皮下瘤体较大，呈灰白色，质硬，与皮下组织粘附紧密，界限不清

LM：瘤细胞分布不规律（组织结构异型性），瘤细胞体积较大，形态不一，核较大，胞质蓝染，呈嗜碱性（细胞异型性）

2。同侧腋下淋巴结：

大体：比正常淋巴结大，呈卵圆形，质硬，切面灰白色

LM：在淋巴结边缘窦处可看到某些细胞分布不规律，细胞体积较大，形态不一，核较大，胞质蓝染，与在皮下瘤体的切片中看到的瘤细胞形态相似，表明此淋巴结中的肿瘤组织是原发在皮下的肿瘤经淋巴道转移的结果

3。肝肺肾

大体：未见异常