第一章 基因工程学概论
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基因工程原理
Genetic Engineering
高成江，教授，泰山学者
• 88382292 (office), 88382113 (lab) • Office: building 6, Rm 438 • Email: cgao@sdu.edu.cn
第一章 概论
一、基因工程概述
基本概念 发展历史 相关理论的复习
制的若干基因组成的一个遗传单位。
• 标准结构包括：调控区 (调节基因，启动基因，操 纵基因) ，位于上游 结构基因：3-12个蛋白质编码基因 转录终止子：位于下游 • 共同协调作用，结构基因被转录成一个多顺反子 mRNA，再翻译成各自的蛋白质。
乳糖操纵子结构
• Lac操纵子调控区有I基因、启动子（P）和 操纵基因（O），Lac I编码阻遏蛋白，结 合于操纵基因（O）上，启动子（P）是转 录起始时RNA酶的结合部位 • Lac操纵子有3个结构基因：Z基因、Y基因 和A基因，分别编码beta-半乳糖苷酶、渗 透酶和乙酰化酶，参与乳糖的代谢。 • Lac操纵子受分解代谢系统的正调控和阻遏 蛋白的负调控
乳糖操纵子的表达调控
I基因编码的阻遏蛋白 与操纵基因（O）结合， 阻断转录； 诱导物与阻遏蛋白结合， 操纵基因解除抑制， RNA聚合酶结合于启动 子，基因转录； 转录产物为同时含有Z 基因、Y基因和A基因的 多顺反子mRNA
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、 结合并启动基因转录的一段DNA序列。 • 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 • 共有保守序列： -10区（pribnow box，TATA box ）：位于 转录起始点上游10bp处，TATAAT，与转录起 始点的距离5-10bp，是给RNA聚合酶定向的序 列，使RNA合成按5′ 3 ′方向进行 -35区：位于转录起始点上游35bp处，有 TTGACA一组共有序列，RNA聚合酶的识别 序列
• 常见基因组特点：
– 病毒基因组
– 原核生物基因组 – 真核生物基因组 – 人类基因组
1. 病毒基因组
• 基因组小，基因数少
• 带有重叠基因
• 大部分为编码蛋白质的结构基因
HBV 基 因 组
2. 原核生物基因组
• 基因组很小，大多只有一条染色体（细菌染色体）
质粒（plasmid）：
细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。
RNA
3’
5’
DNA
Adenovirus fully utilizes its genomic sequence
Antisense RNA Inhibits the Expression
Nontemplate
Antisense Gene
Antisense RNA
+ +
+
RNA/RNA Hybrid
格里菲思肺炎双球菌的转化实验
S（Smooth）型菌： 有荚膜，有毒性
R（Rough）型菌： 无荚膜，无毒性
艾弗里及同事的实验
R型细菌 S型菌的DNA
R型细菌 S型菌
R型细菌
S型菌的 只长R型菌 蛋白质或荚膜多糖
百度文库
R型细菌
S型菌的 DNA+DNA酶
只长R型菌
蛋白质 的组成元素： C、H、O、N、（S） DNA 的组成元素： C、H、O、N 、P(99%)
• 原核细胞与翻译有关的组分： —— 核糖体结合位 点(ribosome binding site, RBS)
（1）翻译起始密码子AUG
（2）SD顺序（Shine-Dalgarno）：是细菌核糖体结 合于mRNA和翻译起始所必需的核苷酸序列
存在于大肠杆菌 mRNA 的前导序列区， AUG上游 3-11 bp 长约3-9bp,富含嘌呤核苷酸 5′…AGGAGG…3′ 与16s核糖体RNA 3′-端碱基3′…UCCUCC…5′互补， 将AUG安臵于核糖体适当位臵，启动翻译反应 1974年澳大利亚的Shine和Dalgarno首先提出
需要的基因、基因产物或创造出新的生物类型的分子
生物学技术。
载体（Vector）：
能容忍外源DNA片段插入，可在细胞间转移 并在宿主细胞内自主复制的DNA分子。
复制子（Replicon）
具有独立复制能力的DNA分子，或DNA 分子中可从某一起点进行复制的部分称复制子。
DNA重组（DNA recombination)：
X
Template
RNAi
mRNA
-
-
Promoter
• 原核细胞中基因的表达调控主要包括2个过 程：转录和翻译 转录：遗传信息DNA RNA 翻译：mRNA 蛋白质 • 真核细胞中基因的表达调控是多层次的， 包含多个步骤。
原核生物基因表达特点
仅一种RNA聚合酶，识别原核细胞启动 子，催化所有RNA合成。 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA (naked DNA) ，其转录和翻译是 偶联的连续进行。 在翻译过程中形成 多核糖体，每个核糖体独立完成一条 肽链的合成。
复制后的DNA ：组成
母链（旧链）
子链（新链）
复制子
DNA中发生一次复制的单位称为复制子(replicon) 。
复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的， 在复制启动位点具起始点（origin)，在复制终止位点 具终点（terminus)。起始点仅作用于所在复制子。
注：在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复制， 且只发生一次。
• RNA聚合酶识别并结合启动子 • 各种启动子启动转录能力不同 • 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其 间隔序列
-35区是RNA聚合酶对转录起始的辨认位点，辨 认结合后，酶到达Pribnow盒，DNA双螺旋结构被打 开，形成开放型启动子复合物，开始转录
终止子（terminator，T）:位于DNA链的3’端,给予 RNA聚合酶转录终止信号的序列.
二、基因工程的基本过程与策略 三、基因工程的发展与应用
一、基本概念
基因工程
载体和复制子 DNA重组、转化
基因工程 (genetic engineering)：
在基因水平上，根据人们的需要以人工的方法取得 特定基因，在体外重组于载体DNA分子上，然后将重 组DNA转入受体细胞进行无性繁殖（称为“克隆” ） 和行使正常功能（称为“表达 ” ），从而制备人类
特征： 富含G/C的区域和富含A/T区域相邻排列，具有 回文对称结构，在RNA转录本上形成茎-环（stemloop)结构。 不同的终止子的作用也有强弱之分。
包括与蛋白质因子无关的转录终止信号和依赖于蛋 白质因子的转录终止信号
•富含GC的反向重复序列
•富含AT的序列
转录形成发夹 式结构
茎-环结构比转录 泡内的RNA-DNA杂合双 链稳定，转录泡丧失， RNA聚合酶与模板DNA 解离，转录终止
1970年 限制性核酸内切酶的分离和纯化（Hind III） 1970年 逆转录酶的发现 1972年 载体与重组技术
1972年 Berg 首次实现基因重组 1973年 Cohen 重组DNA转化
基因工程核心技术：DNA的重组技术
相关理论的复习
• 基因的概念和特性
• 基因组
• DNA的结构与性能
DNA的复制与表达
• 半保留复制（semi-conservative replication） • 基因表达（gene expression）
复 制
转录 逆转录 翻译
DNA
RNA
蛋白质
DNA的复制
解旋 ：解旋酶催化 模板 同时进行
复制：以母链为模板进行碱基配对 （在DNA聚合酶的催化下，利用游 离的脱氧核苷酸进行）
基因的功能分类
• 结构基因（structure gene)：
决定蛋白质/多肽链或酶分子的结构
• 调控基因 (regulatory gene)：
调节控制结构基因表达功能
乳糖操纵子
基因的一般特性
• 半保留自我复制 • 决定生物表型或性状 • 基因突变 新的生物性状
基因组（genome）
• 概念：细胞或生物体的全套遗传物质的总和
• 启动子与终止子
Template (-) Strand Transcribes to mRNA
nontemplate strand (+) strand coding strand
5’
ATG TAG
Identical sequence
3’
Codon is denoted on mRNA
Start codon
人类基因组
细胞核基因组（nuclear genome)
线粒体基因组 (mitochondrial genome)
DNA的结构
• 基本单位：核苷酸（A、T、C、G）
• 双螺旋结构
DNA的性能
• 吸收光谱高峰为260nm
• 在电场中的迁移率与分子量大小、构象有关 • DNA变性：在物理或化学因素作用下，氢键断裂 成单链的过程 • DNA复性：变性因素去除后，恢复成双链的过程
原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在 合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成 多条肽链。
一般不含内含子（intron），没有转录 及翻译后加工系统 原核生物中功能相关的基因串联在一 起，形成操纵子。
操纵子（operon） ：
• 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单 位）。 是一组功能上相关，受同一调控区控
5’
AUG
UAG
3’ RNA 5’
3’
TAC
template strand (-) strand
ATC
Both DNA Strands Could Be Expressed
5’
DNA
3’ 5’
3’
RNA
RNA is synthesized in 5’→ 3’ direction 5’ 3’
Promoter marks the initiation of transcription
——用32p标记 （含P）
噬 菌 体
35S标记 —— 用 （含S）
赫尔希和蔡斯得噬菌体侵染细菌实验
离心
离心
DNA的空间结构
沃森和克里克根据对DNA的X光衍射结果，以及 对DNA分子不同碱基之间数量关系的分析，提出了 DNA分子的双螺旋结构模型。
从图上可辨认出DNA是由两条 链交缠在一起的螺旋结构
• 可自主复制 • 编码生物学形状 • 基因工程常用载体
• 结构简单，没有核膜 • 存在转录单元多顺反子
细菌及质粒DNA的三种构型：
– 超螺旋：共价闭环（CCC） – 开环：单链缺口（OC） – 线型：双链断裂（L）
真核生物基因组
• 真核基因组结构庞大 3×109bp、染色质、核膜
• 基因不连续性，大部分基因含有内含子(intron) • 非编码区域多于编码区域(9:1)，编码基因约2万个 • 单顺反子 • 含有大量重复序列
• DNA的复制
• DNA的转录与调控
基因的概念和分子生物学定义
• 遗传学概念：位于染色体上的基本遗传单位，携带遗 传信息，控制遗传性状
DNA双螺旋结构 mRNA
• 分子生物学定义：编码功能性蛋白质多肽链或RNA 分子所必需的全部核酸序列，负载特定的遗传信息并 在一定条件下表达遗传信息，指令或调控蛋白质合成。
不同来源的DNA片段共价连接、通过重新组 合构成了具有两个DNA分子遗传信息的新重组 体DNA分子的过程。
转化 (transformation)：
以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件 下引入受体细胞的过程。
基因工程发展历史
• 基因工程三大理论基础 • 基因工程三大技术发现
基因工程理论基础
20世纪40年代：证明了遗传物质是DNA 20世纪50年代：DNA双螺旋结构 20世纪60年代：确定了遗传信息的传递方式
沃森、克里克发现 生命的双螺旋而荣 获1962年诺贝尔医 学生理学奖。
面对DNA双螺旋模 型的美国生物学家 沃森(左)和英国生 物物理学家克里克 ( 右) 。
遗传信息的传递方式
复 制 转录 逆转录 翻译
DNA
RNA
蛋白质
Non-coding RNA microRNA, lncRNA
基因工程学重大的技术发现
不同生物复制子的数目
• 质粒一般是一个自主环状的DNA基因组， 构成一个独立复制子； • 原核生物基因组中一般只含一个复制子， 在唯一的起始点启动就会引起整个基因
组复制；
• 真核生物基因组含多个复制子（一般 40-100kb/个）。
基因的转录
转录：遗传信息DNA RNA • 模板链：反义链或（-）链，dsDNA分子中被转录成 RNA转录本的链 • 编码链：有义链或（+）链，以T代替U，与RNA转 录本具有同样的序列 • 转录酶：依赖于DNA的RNA聚合酶 • 把转录起始点的碱基定为+1，5’端方向为“-”，3’ 端为“+”
Genetic Engineering
高成江，教授，泰山学者
• 88382292 (office), 88382113 (lab) • Office: building 6, Rm 438 • Email: cgao@sdu.edu.cn
第一章 概论
一、基因工程概述
基本概念 发展历史 相关理论的复习
制的若干基因组成的一个遗传单位。
• 标准结构包括：调控区 (调节基因，启动基因，操 纵基因) ，位于上游 结构基因：3-12个蛋白质编码基因 转录终止子：位于下游 • 共同协调作用，结构基因被转录成一个多顺反子 mRNA，再翻译成各自的蛋白质。
乳糖操纵子结构
• Lac操纵子调控区有I基因、启动子（P）和 操纵基因（O），Lac I编码阻遏蛋白，结 合于操纵基因（O）上，启动子（P）是转 录起始时RNA酶的结合部位 • Lac操纵子有3个结构基因：Z基因、Y基因 和A基因，分别编码beta-半乳糖苷酶、渗 透酶和乙酰化酶，参与乳糖的代谢。 • Lac操纵子受分解代谢系统的正调控和阻遏 蛋白的负调控
乳糖操纵子的表达调控
I基因编码的阻遏蛋白 与操纵基因（O）结合， 阻断转录； 诱导物与阻遏蛋白结合， 操纵基因解除抑制， RNA聚合酶结合于启动 子，基因转录； 转录产物为同时含有Z 基因、Y基因和A基因的 多顺反子mRNA
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、 结合并启动基因转录的一段DNA序列。 • 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 • 共有保守序列： -10区（pribnow box，TATA box ）：位于 转录起始点上游10bp处，TATAAT，与转录起 始点的距离5-10bp，是给RNA聚合酶定向的序 列，使RNA合成按5′ 3 ′方向进行 -35区：位于转录起始点上游35bp处，有 TTGACA一组共有序列，RNA聚合酶的识别 序列
• 常见基因组特点：
– 病毒基因组
– 原核生物基因组 – 真核生物基因组 – 人类基因组
1. 病毒基因组
• 基因组小，基因数少
• 带有重叠基因
• 大部分为编码蛋白质的结构基因
HBV 基 因 组
2. 原核生物基因组
• 基因组很小，大多只有一条染色体（细菌染色体）
质粒（plasmid）：
细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。
RNA
3’
5’
DNA
Adenovirus fully utilizes its genomic sequence
Antisense RNA Inhibits the Expression
Nontemplate
Antisense Gene
Antisense RNA
+ +
+
RNA/RNA Hybrid
格里菲思肺炎双球菌的转化实验
S（Smooth）型菌： 有荚膜，有毒性
R（Rough）型菌： 无荚膜，无毒性
艾弗里及同事的实验
R型细菌 S型菌的DNA
R型细菌 S型菌
R型细菌
S型菌的 只长R型菌 蛋白质或荚膜多糖
百度文库
R型细菌
S型菌的 DNA+DNA酶
只长R型菌
蛋白质 的组成元素： C、H、O、N、（S） DNA 的组成元素： C、H、O、N 、P(99%)
• 原核细胞与翻译有关的组分： —— 核糖体结合位 点(ribosome binding site, RBS)
（1）翻译起始密码子AUG
（2）SD顺序（Shine-Dalgarno）：是细菌核糖体结 合于mRNA和翻译起始所必需的核苷酸序列
存在于大肠杆菌 mRNA 的前导序列区， AUG上游 3-11 bp 长约3-9bp,富含嘌呤核苷酸 5′…AGGAGG…3′ 与16s核糖体RNA 3′-端碱基3′…UCCUCC…5′互补， 将AUG安臵于核糖体适当位臵，启动翻译反应 1974年澳大利亚的Shine和Dalgarno首先提出
需要的基因、基因产物或创造出新的生物类型的分子
生物学技术。
载体（Vector）：
能容忍外源DNA片段插入，可在细胞间转移 并在宿主细胞内自主复制的DNA分子。
复制子（Replicon）
具有独立复制能力的DNA分子，或DNA 分子中可从某一起点进行复制的部分称复制子。
DNA重组（DNA recombination)：
X
Template
RNAi
mRNA
-
-
Promoter
• 原核细胞中基因的表达调控主要包括2个过 程：转录和翻译 转录：遗传信息DNA RNA 翻译：mRNA 蛋白质 • 真核细胞中基因的表达调控是多层次的， 包含多个步骤。
原核生物基因表达特点
仅一种RNA聚合酶，识别原核细胞启动 子，催化所有RNA合成。 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA (naked DNA) ，其转录和翻译是 偶联的连续进行。 在翻译过程中形成 多核糖体，每个核糖体独立完成一条 肽链的合成。
复制后的DNA ：组成
母链（旧链）
子链（新链）
复制子
DNA中发生一次复制的单位称为复制子(replicon) 。
复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的， 在复制启动位点具起始点（origin)，在复制终止位点 具终点（terminus)。起始点仅作用于所在复制子。
注：在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复制， 且只发生一次。
• RNA聚合酶识别并结合启动子 • 各种启动子启动转录能力不同 • 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其 间隔序列
-35区是RNA聚合酶对转录起始的辨认位点，辨 认结合后，酶到达Pribnow盒，DNA双螺旋结构被打 开，形成开放型启动子复合物，开始转录
终止子（terminator，T）:位于DNA链的3’端,给予 RNA聚合酶转录终止信号的序列.
二、基因工程的基本过程与策略 三、基因工程的发展与应用
一、基本概念
基因工程
载体和复制子 DNA重组、转化
基因工程 (genetic engineering)：
在基因水平上，根据人们的需要以人工的方法取得 特定基因，在体外重组于载体DNA分子上，然后将重 组DNA转入受体细胞进行无性繁殖（称为“克隆” ） 和行使正常功能（称为“表达 ” ），从而制备人类
特征： 富含G/C的区域和富含A/T区域相邻排列，具有 回文对称结构，在RNA转录本上形成茎-环（stemloop)结构。 不同的终止子的作用也有强弱之分。
包括与蛋白质因子无关的转录终止信号和依赖于蛋 白质因子的转录终止信号
•富含GC的反向重复序列
•富含AT的序列
转录形成发夹 式结构
茎-环结构比转录 泡内的RNA-DNA杂合双 链稳定，转录泡丧失， RNA聚合酶与模板DNA 解离，转录终止
1970年 限制性核酸内切酶的分离和纯化（Hind III） 1970年 逆转录酶的发现 1972年 载体与重组技术
1972年 Berg 首次实现基因重组 1973年 Cohen 重组DNA转化
基因工程核心技术：DNA的重组技术
相关理论的复习
• 基因的概念和特性
• 基因组
• DNA的结构与性能
DNA的复制与表达
• 半保留复制（semi-conservative replication） • 基因表达（gene expression）
复 制
转录 逆转录 翻译
DNA
RNA
蛋白质
DNA的复制
解旋 ：解旋酶催化 模板 同时进行
复制：以母链为模板进行碱基配对 （在DNA聚合酶的催化下，利用游 离的脱氧核苷酸进行）
基因的功能分类
• 结构基因（structure gene)：
决定蛋白质/多肽链或酶分子的结构
• 调控基因 (regulatory gene)：
调节控制结构基因表达功能
乳糖操纵子
基因的一般特性
• 半保留自我复制 • 决定生物表型或性状 • 基因突变 新的生物性状
基因组（genome）
• 概念：细胞或生物体的全套遗传物质的总和
• 启动子与终止子
Template (-) Strand Transcribes to mRNA
nontemplate strand (+) strand coding strand
5’
ATG TAG
Identical sequence
3’
Codon is denoted on mRNA
Start codon
人类基因组
细胞核基因组（nuclear genome)
线粒体基因组 (mitochondrial genome)
DNA的结构
• 基本单位：核苷酸（A、T、C、G）
• 双螺旋结构
DNA的性能
• 吸收光谱高峰为260nm
• 在电场中的迁移率与分子量大小、构象有关 • DNA变性：在物理或化学因素作用下，氢键断裂 成单链的过程 • DNA复性：变性因素去除后，恢复成双链的过程
原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在 合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成 多条肽链。
一般不含内含子（intron），没有转录 及翻译后加工系统 原核生物中功能相关的基因串联在一 起，形成操纵子。
操纵子（operon） ：
• 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单 位）。 是一组功能上相关，受同一调控区控
5’
AUG
UAG
3’ RNA 5’
3’
TAC
template strand (-) strand
ATC
Both DNA Strands Could Be Expressed
5’
DNA
3’ 5’
3’
RNA
RNA is synthesized in 5’→ 3’ direction 5’ 3’
Promoter marks the initiation of transcription
——用32p标记 （含P）
噬 菌 体
35S标记 —— 用 （含S）
赫尔希和蔡斯得噬菌体侵染细菌实验
离心
离心
DNA的空间结构
沃森和克里克根据对DNA的X光衍射结果，以及 对DNA分子不同碱基之间数量关系的分析，提出了 DNA分子的双螺旋结构模型。
从图上可辨认出DNA是由两条 链交缠在一起的螺旋结构
• 可自主复制 • 编码生物学形状 • 基因工程常用载体
• 结构简单，没有核膜 • 存在转录单元多顺反子
细菌及质粒DNA的三种构型：
– 超螺旋：共价闭环（CCC） – 开环：单链缺口（OC） – 线型：双链断裂（L）
真核生物基因组
• 真核基因组结构庞大 3×109bp、染色质、核膜
• 基因不连续性，大部分基因含有内含子(intron) • 非编码区域多于编码区域(9:1)，编码基因约2万个 • 单顺反子 • 含有大量重复序列
• DNA的复制
• DNA的转录与调控
基因的概念和分子生物学定义
• 遗传学概念：位于染色体上的基本遗传单位，携带遗 传信息，控制遗传性状
DNA双螺旋结构 mRNA
• 分子生物学定义：编码功能性蛋白质多肽链或RNA 分子所必需的全部核酸序列，负载特定的遗传信息并 在一定条件下表达遗传信息，指令或调控蛋白质合成。
不同来源的DNA片段共价连接、通过重新组 合构成了具有两个DNA分子遗传信息的新重组 体DNA分子的过程。
转化 (transformation)：
以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件 下引入受体细胞的过程。
基因工程发展历史
• 基因工程三大理论基础 • 基因工程三大技术发现
基因工程理论基础
20世纪40年代：证明了遗传物质是DNA 20世纪50年代：DNA双螺旋结构 20世纪60年代：确定了遗传信息的传递方式
沃森、克里克发现 生命的双螺旋而荣 获1962年诺贝尔医 学生理学奖。
面对DNA双螺旋模 型的美国生物学家 沃森(左)和英国生 物物理学家克里克 ( 右) 。
遗传信息的传递方式
复 制 转录 逆转录 翻译
DNA
RNA
蛋白质
Non-coding RNA microRNA, lncRNA
基因工程学重大的技术发现
不同生物复制子的数目
• 质粒一般是一个自主环状的DNA基因组， 构成一个独立复制子； • 原核生物基因组中一般只含一个复制子， 在唯一的起始点启动就会引起整个基因
组复制；
• 真核生物基因组含多个复制子（一般 40-100kb/个）。
基因的转录
转录：遗传信息DNA RNA • 模板链：反义链或（-）链，dsDNA分子中被转录成 RNA转录本的链 • 编码链：有义链或（+）链，以T代替U，与RNA转 录本具有同样的序列 • 转录酶：依赖于DNA的RNA聚合酶 • 把转录起始点的碱基定为+1，5’端方向为“-”，3’ 端为“+”