蛋白尿致肾小管间质炎症形成机理

蛋白负荷大鼠模型
Eddy AA. Am J Pathol.1989;135:719–33 Zoja C. et al. J Am Soc Nephrol. 2003 Jun;14 Suppl 1:S36-41.
蛋白负荷导致大鼠形成蛋白尿及肾小管损伤
Liu D, Liu BC. et al. Int J Biochem Cell Biol. 2014 Oct 2;57C:7-19
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
* *
IL-18
IL-1β
肾脏皮质
Liu D, Liu BC. et al. Int J Biochem Cell Biol. 2014 Oct 2;57C:7-19
白蛋白对HK-2细胞Nlrp3炎性体表达的影响
白蛋白致Nlrp3炎性体活化依赖Nlrp3-caspase-1通路
蛋白尿致肾小管间质炎症形成机理
慢性肾脏病正成为我国严重的公共健康问题
患病率高 并发症多 病死率高 医疗费用高 10.8％ CVD、MBD 十大死因之一 约1000亿/年
Zhang L, et al. Lancet, 2012 Chen N, et al . Nephrol Dial Transplant. 2009 Menzin J, et al. Pharmacoeconomics, 2011
TGF-β
系膜细胞增殖 表型改变 生长因子 ROS 细胞因子
细胞凋亡
足细胞损害
肌成纤维细胞
EMT
胞外基质积聚
肾小球硬化
小管结构消失
肾脏纤维化 肾功能下降
蛋白尿：肾脏的毒素，炎症的来源
？
Abbate, M., et al. J Am Soc Nephrol, 2006. 17(11): p. 2974-84.
TLR4
Cubilin
Lysosomal rupture
TLR2
IκB NF-κB
Cathepsin B
ROS
NLRP3
NF-κB
ASC
pro-caspase-1
小
结
蛋白负荷通过引起肾
小管上皮细胞内ROS
产生增加及线粒体功
能障碍，激活Nlrp3 炎性体，向小管间质 释放促炎因子，导致 肾小管间质炎症发生
AngII诱导肾小管间质炎症损伤-在体AngII灌注
WT WT + AngII NLRP3-/- +AngII AT1R-/- +AngII AngII灌注 诱导肾小 管损伤 AngII灌注 诱导肾小 管Nlrp3炎 性体活化 NLRP3、 AT1R基因 敲除小鼠 改善肾脏 损伤及 Nlrp3炎性 体活化
蛋白尿：肾脏病的症状
蛋白尿的形成： --肾小球滤过屏障损伤 --近端肾小管上皮细胞重吸 收功能障碍
Jefferson, J. A. et al. Kidney Int. 2008. 74, 22–36;
感染、免疫、代谢紊乱、血流动力学等 肾小球损伤 滤过膜受损 肾小管损伤
蛋白尿
巨噬细胞浸润
趋化因子表达
12 10 8 6 4 2 0
Control AO
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Control
*
2.5 2
IL-6 mRNA
*
1.5 1 0.5 0
TNF- α
AO
Control
AO
Albumin
Signal 1
Signal 2
Albumin Megalin
1.0
1.5
c
Nlrp3 expression (IOD)
15000 10000
Lg proteinuria (g/24h)
15000
Lg proteinuria (g/24h)
IL-18 expression (IOD)
10000
5000
r=0.585 p<0.05
5000
r =0.516 p=0.058
Liu D, Liu BC. et al JBC. Submitted, under review
线粒体功能障碍与Nlrp3炎性体活化
Kepp O，Nat Immunol. 2011 Mar;12(3):199-200.
问题3
蛋白负荷导致大鼠肾小管细胞线粒体损伤
蛋白负荷大鼠线粒体形态异常
线粒体肿胀伴“气球” 样变 基质变浅 线粒体嵴减少
蛋白负荷导致大鼠肾小管细胞损伤及小管间质炎症
蛋白负荷大鼠模型：蛋白尿形成、肾小管上皮细胞损伤、肾小管扩张伴 蛋白管型、间质炎症细胞浸润
蛋白负荷导致大鼠肾小管细胞Nlrp3炎性体活化
蛋白负荷导致大鼠肾小管上皮细胞Nlrp3炎性体活化
a
b
c
Relative Expression (Protein)
蛋白尿如何导致小管间质炎症持续不断？ Ang II的作用
RAS激活在肾脏炎症和纤维化中的作用
大量研究表明，肾脏局部RAS激活在慢性肾脏病 进展中起着十分重要的作用。
Tang RN, et al. Int J Cardiol, 2011 Tang RN, et al. Cardiovasc Diabetol, 2010 Liu BC, et al. Am J Nephrol, 2008 Zhang JD, et al. Am J Physiol Renal Physiol , 2010
白蛋白诱导AngII上调参与肾脏炎症及纤维化反应
我们前期研究发现：蛋白白通过调 节ACE/ACE2，上调AngII的表达
问
题：
蛋白尿
ANG II增加
Nlrp3炎性体激活
IL1β↑ IL18↑
血管紧张素Ⅱ激活HK-2细胞Nlrp3炎性体
Wang J, Liu BC, et al. APS, 2015
52.9
MitoTracker Green
e
NAC清除BSA诱导 的胞浆内ROS
NAC:a ROS scavenger
ROS清除剂抑制白蛋白诱导的Nlrp3炎性体活化
NAC抑制细胞上清液 中IL-18的分泌（ELISA）
NAC抑制HK-2 细胞Nlrp3炎 性体相关蛋 白表达 （western blot）
炎症是机体损伤后重要的防御性反应
Wynn TA, et al. Nature Med 2012; 18(7):1028
细胞死亡与炎症形成
JASN; 2014;25：1387-1400
胞外基质与炎症形成
JASN; 2014;25：1387-1400
NOD样受体及Nlrp3炎性体
相关疾病:
痛风性关节炎 2型糖尿病 动脉粥样硬化
肾脏纤维化的共同病理特征
肾小球硬化
肾小管萎缩
致病因素：
衰 老 糖尿病 高血压 动脉粥样硬化 自身免疫性疾病 … CKD 肾脏纤维化
炎症细胞浸润
进展因素：
蛋白尿
肾间质纤维化
肾脏纤维化的发展过程
蛋白尿： •临床表现 •致病因素
Liu, Y. Nat Rev Nephrol. 2011 Oct 18;7(12):684-96
血管紧张素Ⅱ激活HK-2细胞Nlrp3炎性体
Wang J, Liu BC, et al. APS, 2015
内质网应激介导AngII引起的Nlrp3炎性体活化
AngⅡ可引起 HK-2细胞中的 内质网应激
替米沙坦能 抑制AngⅡ诱 导的内质网 应激
4-PBA(内质网 应激抑制剂） 能抑制AngⅡ 诱导Nlrp3炎 性体激活
BSA刺激HK-2细胞溶酶体 酸化功能障碍
Liu D, Liu BC. et al JBC. Submitted, under review
溶酶体蛋白酶Cathepsin B抑制剂降低Nlrp3炎性体活化
BSA刺激HK-2细胞Cathepsin B表达增加，Cathepsin B抑制剂Ca074-Me有效抑制 Nlrp3炎性体相关蛋白表达，而Cathepsin D抑制剂Pepstatin A无明显作用
ROS清除剂抑制蛋白尿诱导的HK-2细胞内ROS聚积
c
MitoTracker Red CMXRos
Mitotracker 检测线粒 体膜电位 MitoSOX检 测线粒体 ROS
d
Mock
1
CCCP
<1 R2 R2
63.56
NAC改善BSA诱导的线粒 体膜电位下降
1
BSA+NAC
BSA
37.6 R2 R2
PAS
NLRP3
caspase-1
线粒体损伤介导AngII引起的Nlrp3炎性体活化
WT Cntl
Cyt C 胞浆 Β-actin Cyt C 线粒体 Cox IV
WT+AngII
N-/- Cntl
N-/- + AngII
AngII灌注引起线粒体损伤 及功能障碍 Nlrp3-/-及AT1R-/-改善AngII 诱导的线粒体功能障碍
AO
B
Control
AO
C
90KDa 95KDa 34KDa 65KDa 43KDa
TLR2 TLR4 MyD88 NF-κB β-actin
白蛋白对HK-2细胞TLR2/4-MyD88-NF-κB通路表达的影响
A
B
Control AO
TLR2 mRNA
7 6 5 4 3 2 1 0
Control
b
Nlrp3 expression (IOD)
0
10000
IL-18 expression (IOD)
8000 6000 4000 2000 0 -1.0 -0.5
r=0.670 p<0.05
10000
5000
r=0.708 p<0.05
0 -1.0 -0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
0.0
0.5
Nlrp3 炎性体
炎症性肠病
Beckley K. Davis et al. Annu. Rev. Immunol. 2011. 29:707–35
NLRP3基因敲除减轻UUO小鼠肾脏纤维化
Vilaysane, A., et al. J Am Soc Nephrol, 2010. 21(10): p. 1732-44
蛋白负荷导致HK-2细胞线粒体形态异常及功能障碍
正常HK-2细胞 线粒体均匀分 布于细胞浆内， 且呈长纤维丝 样
蛋白负荷导致 HK-2细胞线粒 体向胞核聚积， 且呈碎片状改 变
线粒体功能障碍与Nlrp3炎性体活化
JC-1：线粒体膜电位检测 BSA刺激引起线粒体膜电位下降
DCF：细胞内ROS检测 BSA刺激引起细胞浆内ROS聚积增加
WT
蛋白尿如何介导肾小管损伤及间质炎症形成？
研究假说
损伤性因素
蛋白尿致恶性管球反馈 与炎症形成
AngⅡ
IL1β NLRP3 Caspase 1 IL18
Zhang JD, Liu BC. Medical Hypothesis, 2011
问题1
IgA肾病患者蛋白尿水平与肾小管细胞Nlrp3表达相关
ROS清除剂抑制白蛋白诱导的Nlrp3炎性体活化
mROS参与蛋白尿诱导的肾小管上皮细胞 Nlrp3炎性体活化 BSA刺激引起Nlrp3与线粒体发生明显共定位； NAC能够有效抑制两者之间相互作用
蛋白负荷对大鼠肾脏中TLR2/4-MyD88-NF-κB表达影响
A
Control TLR2 TLR4 MyD88 NF-κB
*
TLR2 TLR4 MyD88
NF-κB TNF α IL-6 β-actin
90KDa 95KDa 34KDa
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
Control
*
10 8
*
MyD88 mRNA
AO
TLR4 mRNA
6 4 2 0
Control AO
AO
*
14
NF- κ B mRNA
mRNA
65KDa 17KDa 26KDa 43KDa
0 0 1 2 3 4
0 0 1 2 3 4
interstitial inflammation
interstitial inflammation
Liu D, Liu BC. et al. Int J Biochem Cell Biol. 2014 Oct 2;57C:7-19
研究方法
BSA 腹腔注射
Albuminoverload Nlrp3 siRNA transfection
inflammasome Nlrp3 Caspase-1
IL-18，IL-1β Caspase-1 inhibitor ---Z-VAD-fmk
d
18'kD' 17'kD'
BSA' Z* VAD* fmk(μM)' 5' 10' 20' cleaved'IL* 18' cleaved'IL* 1β'
问题2
Megalin/cubilin受体
Lysosome
megalin/cubilin siRNA可抑制Nlrp3炎性体活化
Liu D, Liu BC. et al JBC. Submitted, under review
蛋白负荷导致TECs溶酶体形态异常及功能障碍
蛋白负荷大鼠肾小管上皮细 胞溶酶体增多、体积增大