实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定
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二、实验原理
1、 AKP概述 、 概述
催化有机单磷酸酯水解, ① 催化有机单磷酸酯水解,并有转移磷酸基的作用 最适pH 8.6~ pH: ②最适pH:8.6~10.3 特点: ③ 特点:特异性低
体内位置: ④体内位置:细胞膜表面 -肾小管的筛状缘 -肠粘膜的微绒毛 -胆小管的细胞膜缘 -肝窦状腺表面 -胎盘合体细胞滋养层细胞外表面
(标准曲线) 标准曲线)
注: A1、B1、C1、D液分别稀释 、50、20、10倍 液分别稀释50、 、 、 倍 液分别稀释
② 测定蛋白质含量
考马斯亮蓝法 (Coomassie Brilliant Blue G-250 ,Bradford法) 法
考马斯亮蓝G-250——红色和蓝色 红色和蓝色 考马斯亮蓝
VX = 5/6(0.83) VB/ /
注意事项
1. 低温条件进行 2. 有机溶剂边加边搅拌 3. 加完有机溶剂后,立即离心,分析沉淀 加完有机溶剂后,立即离心, 4. 加有机溶剂的量计算精确 5. 乙醇上层液入回收瓶
比色分析的原理 有色溶液
设:
I I
O
T (透光度 透光度) 透光度
O
I I A = lg = -lg = -lg T I I (吸光度 吸光度) 吸光度
K 测 = K 标;L 测 = L 标 A测 A标 C测 = A测 A标 C测 C标 × C标 × 稀释倍数
剩余C液 剩余 液Vc'
丙酮→ 加0.5Vc'冷丙酮 33% , 混匀, 混匀,离心 2000 rpm ,5 分钟
(待测蛋白质含量) 待测蛋白质含量)
Leabharlann Baidu
上述离心结果
上清
记体积Vc'',加1/3 Vc''冷丙酮 50% , 丙酮→ 入离心管 ,记体积
弃沉淀
混匀, 混匀, 离心 2000 rpm ,5 分钟
O
代表: 代表:有色物质对光的吸收能力
Lambert定律: A∝ L Beer定律: 定律: 定律 A∝ C 合并Lambert-Beer定律: 定律: 合并 定律 A ∝ C •L 即:A = K • C • L
摩尔吸光系数 L
入射光 透过光
I
O
C
I
在同一实验条件下,分别测定待测物溶液吸 光度(A测)和标准物溶液吸光度(A标),两者 均符合Lambert-Beer定律。 有 因为 A测=K测 C测 L测 A标=K标 C标 L标
① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织 本次实验:肝脏 本次实验:
② 生物组织与细胞的破碎
机械破碎法 :高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 高速组织捣碎机、匀浆器、 渗透破碎法 :低渗条件使细胞溶胀而破碎 反复冻融法 : 超声波法:超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而 超声波法:
④ 保护酶活性措施 a. 低温条件下操作 b. 所有试管均需洗干净 选择合适的pH及合适的缓冲体系, pH及合适的缓冲体系 c. 选择合适的pH及合适的缓冲体系,以稳定 酶活性
Mg(Ac)2 ~ NaAc 混合液提取 混合液提取AKP
保护和稳定AKP 保护和稳定
pH 8.8 Tris 缓冲液测 缓冲液测AKP活性 活性
使细胞破碎
酶法 :如用溶菌酶破坏微生物细胞
③ 选择合适分离提取方法
把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分 子物质(核酸、脂类、多糖) 子物质(核酸、脂类、多糖)去除掉
把酶从溶液中提取出来
有机溶剂方法—— 有机溶剂方法 有机溶剂分段沉淀法 原理: 原理: 利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂 中有不同的溶解度而进行分离。 中有不同的溶解度而进行分离。
A液 液 A1管
0.1 ml A液 + 液 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
(待测酶活性) 待测酶活性)
A2管
0.1 ml A液 + 液 4.9 ml 生理盐水
(待测蛋白质含量) 待测蛋白质含量)
剩余A液 剩余 液
正丁醇, 加2ml正丁醇,搅拌 正丁醇 3-5',室温放置 , ,室温放置30', 过滤,入离心管 过滤,
匀浆A 匀浆A 液 总体积(ml) 总体积(ml) 蛋白含量(mg/ml) 蛋白含量(mg/ml) 总蛋白量(mg) 总蛋白量(mg) AKP活性单位(u/ml) AKP活性单位(u/ml) 活性单位 总AKP活性单位(u) AKP活性单位( 活性单位 比活性(u/mg) 比活性(u/mg) 纯化倍数 得率 第一次丙酮提 取 ( B 液) 第二次乙醇提 取(C液) 第三次丙酮提 取(D液)
酸性游离状态
棕红色
465nm
+蛋白质 蛋白质 蛋白质-染料复合物 蛋白质 染料复合物 595nm
试剂(ml) 试剂 生理盐水 A2稀释液 稀释液 B2稀释液 稀释液 C2稀释液 稀释液 溶液D 溶液 考马斯亮兰试剂
B 0.10
1 0.10
2
3
4
0.10 0.10 0.10 5 5 5 5 5
混匀。2分钟后,H2O调零,λ=595nm比色,记录各管OD。 混匀。 分钟后, 调零, 比色,记录各管 。 分钟后 调零 比色
上述滤液
加等体积冷丙酮,混匀, 等体积冷丙酮,混匀, 冷丙酮 离心2000 rpm、5分钟 离心 、 分钟 上清入回收瓶 沉淀 加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2, 搅拌, 搅拌,记体积VB
B液 液
B1管
0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
(待测酶活性) 待测酶活性)
① 测定酶活性 磷酸苯二钠法 原理: 原理:
AKP K3Fe (CN) 6
4- 氨基 安替比林 氨基-安替比林
磷酸苯二钠
苯酚
醌类化合物
λ= 510nm
AKP活性单位定义 活性单位定义: 活性单位定义
37℃, ℃ 反应15分钟 分钟, 反应 分钟 产生1ug苯酚 产生 苯酚 一个AKP活性单位(u) 活性单位( ) 一个 活性单位
上清入回收瓶
沉淀
搅拌, 加 5ml 0.01M pH 8.8 Tris ,搅拌,记体积VD
D液 液 D1管
0.10ml D 液 + 0.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
(待测酶活性) 待测酶活性)
D2管
剩余D液 剩余 液
(直接待测蛋白质含量) 直接待测蛋白质含量)
二、实验原理 3、建立测定酶比活性的方法 比活性: 比活性: 指单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位 指单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位 比活性= 比活性= 酶活性单位数 / mg 蛋白 ① ②
弃沉淀
上清入回收瓶
沉淀
加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc 混合液4ml ,搅拌,记体积Vc 混合液 搅拌,
C液 液 C1管
0.10ml C 液 + 1.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
(待测酶活性) 待测酶活性)
C2管
0.1 ml C液 + 液 0.4 ml 生理盐水
试剂(ml) 试剂 A1稀释液 稀释液 B1稀释液 稀释液 C1稀释液 稀释液 D1稀释液 稀释液 pH8.8 Tris 缓冲液 复合基质液 0.5%K3Fe(CN)6
B
1 0.10
2 0.10
3
4
0.10 0.10 0.10 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2
立即混匀。将各管置于37℃水浴精确保温15分钟 立即混匀。将各管置于37℃水浴精确保温15分钟 37℃水浴精确保温15
立即混匀。终止酶促反应,室温静置 分钟 分钟。 调零, 立即混匀。终止酶促反应,室温静置10分钟。H2O调零, 调零 λ=510nm比色,记录各管 比色, 比色 记录各管OD。 。
计算酶活性: 计算酶活性:
各制剂总AKP单位数(U) 单位数( ) 各制剂总 单位数 = 查表所得值 ×稀释倍数 × 总体积
三、操作步骤
2g新鲜兔肝剪碎 匀浆管 新鲜兔肝剪碎→匀浆管 新鲜兔肝剪碎
加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc 混合液2ml ,匀浆 混合液
匀浆液入离心管
上述混合液冲洗匀浆器, 用4ml上述混合液冲洗匀浆器,并倒 上述混合液冲洗匀浆器 入离心管,混匀, 入离心管,混匀,记体积VA
有机溶剂体积的计算——96%乙醇 乙醇 有机溶剂体积的计算 VB/中加乙醇 中加乙醇96%
VX = 0.45 VB/
30%
(VB/ + VX)× 30% = 96% × VX
VB/ /中加乙醇(96% )从30% 中加乙醇(
60%
(VB/ / + VX)× 60% - VB/ / × 30% = 96% × VX
2、AKP的分离、提取、及纯化 、 的分离、 的分离 提取、 个阶段: 整个制备过程可分为 5 个阶段: 材料的选择和预处理, ①材料的选择和预处理, 细胞的破碎, ②细胞的破碎, 提取, ③提取, 纯化(包括盐析、有机溶剂提取、层析、 ④纯化(包括盐析、有机溶剂提取、层析、电泳 等), 浓缩、干燥及保存。 ⑤浓缩、干燥及保存。
2、得率 、
每一制剂中总的酶活性单位
得率 =
×100% 溶液A中总的酶活性单位 溶液 中总的酶活性单位
3、纯化倍数 、 纯化倍数 =
每一制剂AKP比活性(U/mg) 比活性( 每一制剂 比活性 ) 溶液A制剂 比活性( 溶液 制剂AKP比活性(U/mg) 制剂 比活性 )
AKP分离纯化小结表: 分离纯化小结表: 分离纯化小结表
碱性磷酸酶的提取及其 比活性测定
带教: 张学礼、戴薇薇 带教 张学礼、 龚张斌、 龚张斌、黎志萍
材料选择
细胞的破碎
分离纯化 分离纯化
鉴定
碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法; 的原理和方法; 掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算; 得率及纯化倍数的概念及计算; 了解AKP的临床意义及纯化蛋白质 AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方 3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方 法。
B2管
0.1 ml B液 + 液 4.9 ml 生理盐水
(待测蛋白质含量) 待测蛋白质含量)
剩余B液 剩余 液VB'
加 0.45VB' 冷乙醇 96%→ 30% ,混匀, 混匀, 离心 2500 rpm ,5 分钟
上述离心结果
上清
记体积V , 入离心管 ,记体积 B‘’,加 0.83 VB‘’冷乙醇 96% 混匀, (30%→ 60% ) 混匀, 离心 2500 rpm ,5 分钟
有机溶剂: 有机溶剂: ① 正丁醇
能去除与pro结合的脂类物质,使pro溶解在溶 结合的脂类物质, 能去除与 结合的脂类物质 溶解在溶 液中
② 乙醇
30% AKP 溶解状态 60% AKP 沉淀状态 通过离心,去除 通过离心, 部分杂蛋白 通过离心, 通过离心,进一 步去除杂蛋白
③ 丙酮
33% AKP 溶解状态 50% AKP 沉淀状态
计算蛋白质含量: 计算蛋白质含量:
各制剂总蛋白含量( ) 各制剂总蛋白含量(mg) = 查表所得值 ×稀释倍数 × 总体积
注: A2、B2、C2液分别稀释 50、50、5 倍 、 、
各制剂的比活性, ③ 各制剂的比活性,得率及纯化倍数的计算 1、AKP比活性: 、 比活性: 比活性
AKP比活性(U/mg)= 比活性( 比活性 ) 制剂中AKP活性单位数(U) 活性单位数( ) 每ml制剂中 制剂中 活性单位数 ml制剂中蛋白质含量 mg) 制剂中蛋白质含量( 每ml制剂中蛋白质含量(mg)
正常血清: ⑤正常血清: ALP主要来自肝(或胆管)和骨骼, ALP主要来自肝(或胆管)和骨骼,约各占总活性 主要来自肝 的一半。 的一半。 ALP活力增高 ⑥临床意义:血清ALP活力增高常见于 临床意义:血清ALP活力增高常见于 -肝胆疾病(胆道阻塞等) 肝胆疾病(胆道阻塞等) -骨骼疾病(佝偻病等) 骨骼疾病(佝偻病等) -甲状腺功能亢进 -妊娠和生长期儿童