碱性磷酸酶活性测定
碱性磷酸酶活性测定
方法评价
优点：灵敏度较高，显色稳定，
不需去蛋白，操作简单、快速；
缺点：准确度和精密度都较低,受
胆红素和溶血的干扰。
实验材料与仪器
器材： 新鲜血清、移液器、试管及试管 架、吸量管、恒温水浴箱、分光 光度计
移液器
1.调刻度 2.取样 注意：加不同物质换 枪头
实验材料与仪器
试剂盒：
1.混合液：磷酸苯二钠、4-氨基安替比林 2.标准液：已知浓度的酚溶液 3.样 品：血清 4.蒸馏水 5.显色剂:高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
血清碱性磷酸酶活性测定
授课教师：
实验目的
1.学习血清碱性磷酸酶活性测定 的原理及方法 2.了解血清碱性磷酸酶活性测定 的临床意义
基本概念
酶活性：即酶催化化学反应的能力。
酶的活性通常以活性单位表示。
它反映在规定的条件下，酶促反应 在单位时间内（秒、分或小时）生 成一定量的产物（mg、μg 、μmol） 或消耗一定量的底物所需的酶量。
——呆小病、磷酸酶过少症、维生素C缺 乏症等。
Katal单位：1Katal指在规定条件下， 每秒钟转化1mol底物的酶量。 1Katal=60×106IU
本实验以血清在37℃，pH为10的
条件下，与AKP底物液作用30min， 每生成1mg酚所需的酶量为1个酶
活性单位。
实验原理
碱性磷酸酶（AKP）在碱性条件下
催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和
磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安
基本概念
酶活性单位是衡量酶数量的尺度， 同一种酶由于实验方法、测定条件 不同，酶活性单位的规定也不同。
在相同测定条件下，酶活性单位越 大，表示酶的含量越高，酶促反应 速度越快。
碱性磷酸酶活力测定
诊断常用血清酶
血清酶
鸟氨酸氨基甲酰转移酶 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 谷氨酸脱氢酶 山梨醇脱氢酶 丙氨酸氨基转移酶 异柠檬酸脱氢酶
-谷氨酰转肽酶 5ˊ-核苷酸酶 单胺氧化酶 天门冬氨酸氨基转移酶 肌酸激酶 乳酸脱氢酶 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 淀粉酶 脂肪酶
符号 5ˊ
来源
肝 肝 肝
肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法） • 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底
物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 • 连续监测法： （速率法） • 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量
•
在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶（）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶
等。
•
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功
能试验的一部分。
•
血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
•
在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。
• • 临床上测定活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍 ，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。
碱性磷酸酶比活力测定
（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）
3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系 （Lambert--Beer定律）：
当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D） 与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度 （I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这 就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定 律。
4. 待测溶液浓度的计算：
蛋白浓度按下式计算：
100g / mL牛血清白蛋白 ＝ C未知
OD280
OD280
数据处理
单位时间0.1mL酶液催化产物量计算： 克分子消光系数法
PNP 1 mol / L(1cm光程)＝C未知
OD40（5 8.8 103）
OD即Βιβλιοθήκη C未知＝OD/(8.8103)
计算：
酶活力(U/mL) = B t V1
（3）消光系数法：
1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
（1）标准管法：
在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D） 值，然后计算：
血清碱性磷酸酶的活性测定
思考
结合参考值范围、临床意义分析本小组 的实验结果
12
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高
2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄
疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
8
计算公式
9
注意事项
1.铁氰化钾应避光保存，如出现蓝绿色 即作废。铁氰化钾 的水溶液受到光线 的作用，就会分解成黄血盐钾 K4[Fe(CN)6]
2.底物液中不应含有酚，如含有酚时空 白管显红色，说明磷酸苯二钠开始分解， 不宜继续使用
3.加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则 显色不充分
10
临床意义
6
试剂
碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替 比林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。 棕色瓶贮存。
磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
1
实验目的
1.熟悉酶活力测定方法的一般原理 2.掌握血清碱性磷酸酶(ALP)的测定原理
与临床意义。 3.酶活力测定的目的是了解组织提取液、
体液中酶的存在于含量。
2
实验原理
一.基本概念 1.酶活力测定 酶的催化功能可以用在一定条件下
酶所催化的某一特定化学反应的速度来表示。反 应速度越快，酶活力越高;反之，活力越低。测定 酶活力实际上是测定酶促反应速率。 2.酶的活力单位 a.国际 在特定的条件下，1min内将1μmol底物转 化为产物所需的酶量为1个国际单位(IU)。 1IU=16.67×10-9Katal b.临床上采用金氏（Kings）的定义：每100ml血清 在37℃与底物作用15min，产生苯酚1mg的酶量为1 个金氏单位。 c.Kat单位 在特定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量。1Kat=6×107 IU
碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1
试剂（ml）
生理盐水 标准蛋白溶液 样品 考马斯亮蓝试剂
空白管
0.1标Biblioteka 管ABC0.1 A2液0.1 5.0 5.0 5.0 B2液0.1 5.0 C2液0.1 5.0
室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量=A样品/A标准×C标准×稀释倍数
目录
3. 结果处理与分析
结果处理表
酶活性计算 体积 (ml) A 值
目录
检测酶提取纯化的指标
1. 酶的纯度： 用比活性代表（单位重量蛋白质样品中 的活性单位） 2. 酶的回收效率 所含酶
※在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的回收率
目录
实验内容
酶的提取及比活性测定
目录
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 的分离纯化及比活性测定
[目的] 1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注 意事项 2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。
25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液）
A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性
A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度
+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （3000rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃）
蛋白含量计算 酶的总 活性 （ U） A 值
稀 释 倍 数
酶活性 (U/ml)
稀 释 倍 数
比活 酶的 性 蛋白浓度 得率 (U/mg) (mg/ml)
A 液 B液
4 2.2
100%
C液
2
目录
血清碱性磷酸酶活性测定
检测方法的准确性评估
参考方法：国际标 准或国家标准的血 清碱性磷酸酶活性 测定方法
准确性评估指标： 回收率、精密度、 线性范围、干扰因 素等
准确性评估方法： 与参考方法进行比 对，或与其他实验 室进行比对
操作规程标准化：制定标准化的操作规程，确保检测过程的规范性和一致性。
室内质量控制：通过定期进行室内质量控制，监控检测过程的稳定性和准确性，及时发现 并纠正误差。
实验室间质量控制
定期进行实验室间比对实验，确 保不同实验室间的检测结果具有 可比性。
对实验室内部质量控制数据进行 分析，及时发现和解决潜在问题。
检测方法的标准化
检测方法的标准化是确保血清碱性磷酸酶活性测定准确性和可靠性的关键步骤。
标准化包括使用统一的仪器设备、试剂和操作程序，以及定期对标准品进行校准等。
标准化可 标准化对于血清碱性磷酸酶活性测定的临床应用和科学研究具有重要意义。
检测方法的临床应用范围
添加标题
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参与权威机构组织的质控活动， 获取质控样品并按照要求进行检 测。
关注国内外质量控制动态，更新 质量控制方法和标准。
质量控制的监测指标
精密度：测定结果的重复性和稳 定性
灵敏度：检测低浓度样本的能力
添加标题
添加标题
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准确度：测定结果与真实值的接 近程度
抗干扰能力：抵抗非特异性物质 干扰的能力
药物使用：某些药物可能影响血 清碱性磷酸酶活性。
药物因素
药物种类：不 同药物对血清 碱性磷酸酶活 性的影响不同
碱性磷酸酶Km值的测定-毕业论文-
12
mmol/L
78
16
0
1/[S] 1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 1/OD
2、作图
■ 以 [s ]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km值
■ 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图 观察曲线形状；查Km值
■ 比较两个值的差异.
OD510
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0
(0.04M)
碳酸缓 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0
液(pH=10)
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1
■ 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O Fra bibliotekKP OH- 苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
■ 1 . 了解酶的Km值测定原理和方法
■ 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性 测定的原理和方法
【实验原理】
■ 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
1/OD510
VMAX
碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。
测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。
2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。
测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。
血清中碱性磷酸酶的测定
• 测定ALP的方法主要分为二种，一是测定底物 解离下的磷酸根来计算酶活力，如β-甘油磷酸 钠法，但存在血清本身有磷酸根及磷酸化的缺 点；二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物， 这种方法又可分为：1，酚化合物在显色剂的 作用下显色比色测定。2，生成的酚化合物本 身在一定的条件下就可显色，如磷酸对硝基酚 法。
当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由 于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升 高。
碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因，具 体讨论如下：
1、生理性原因 儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情 况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，所以检测时值会偏高。
2、病理性原因 当人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性 肝癌、胆汁淤积性肝炎等时，肝细胞过度制造ALP，经淋巴道和肝
1．生理性增高：儿童在生理性的骨骼发育期，碱性磷酸酶活力可 比正常人高1～2倍。处于生长期的青少年，以及孕妇和进食脂肪含量 高的食物后均可以升高。
2．病理性升高： (1)骨骼疾病如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等； (2)肝胆疾病如肝外胆道阻塞、肝癌、肝硬化、毛细胆管性肝炎等； (3)其他疾病如甲状旁腺机能亢进。 3．病理性降低：见于重症慢性肾炎、儿童甲状腺机能不全、贫血 等。
• （二）试剂
（1）0.1mol/L碳酸缓冲液（pH=10.0)：称取无水碳酸钠6.36g、碳酸氢 钠3.36g、4-氨基安替比林1.5g，溶于800ml蒸馏水中，定容至1L,置于 棕色瓶内储存。
（2）20mmol/L磷酸苯二钠溶液：先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸 苯二钠2.18g（磷酸苯二钠如含2分子结晶水，应称取2.54g)，冷却后加 氯仿2ml防腐，在4℃冰箱内保存。用剩的溶液不应再倒回瓶中。
血清碱性磷酸酶活性测定
优选血清碱性磷酸酶活性测定
主要内容：
⑴ 实验目的 ⑵ 实验原理
⑶ 实验器材与试剂 ⑷ 实验操作 ⑸ 计算 ⑹ 临床意义 ⑺ 注意事项
基本概念
酶活力：称酶活性，是表示催化某一特定反应 的能 力。可以用在一定条件下所催化的某一特 定化学速度表示。
酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈 低。
底物液
铁氰化钾溶液 血清
4．酚标准工作液（0.05mg/ml） 购买合格的二级 标准品。
实验操作
取4支试管，如下操作：
血清（ml） 酚标准液 蒸馏水
测定管 0.100 —— ——
pH10碳酸盐缓冲液 1.00
标准管 —— 0.100 —— 1.00
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水 煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防 腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）
3．显色液（铁氰化钾的硼酸溶液） 称取铁氰化 钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混 合后，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现 蓝绿色即弃去)。
试剂与仪器
器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液 器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴
试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 无水碳酸钠
6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。
思考
如何测定酶活力的大小？
血清碱性磷酸酶活性测定 ppt课件
————磷酸苯二钠法
血清碱性磷酸酶活性测定
主要内容：
⑴ 实验目的 ⑵ 实验原理
⑶ 实验器材与试剂 ⑷ 实验操作 ⑸ 计算 ⑹ 临床意义 ⑺ 注意事项
血清碱性磷酸酶活性测定
基本概念
酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应 的能 力。可以用在一定条件下所催化的某一特 定化学速度表示。
4．酚标准工作液（0.05mg/ml） 购买合格的二级 标准品。 血清碱性磷酸酶活性测定
实验操作
取4支试管，如下操作：
血清（ml） 酚标准液 蒸馏水
测定管 0.100 —— ——
pH10碳酸盐缓冲液 1.00
标准管 —— 0.100 —— 1.00
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
血清碱性磷酸酶活性测定
试剂与仪器
器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液 器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴
试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 无水碳酸钠
6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。
碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
血清碱性磷酸酶活性测定
实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之 水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替 比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物， 其颜色深浅与ALP活性成正比。
磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+磷酸氢二钠
pH=10
苯酚+4-氨基安替比林 铁氰化红钾色醌亚胺衍生物
碱性磷酸酶检测
计算酶促反应的平均速度，得到酶活性值。
• 连续监测法: 每隔一定时间(2-60s)，连续测定产物量随时间变 化的情况，求出酶反应初速度，间接得到酶活性值。该方法适用 于自动生化分析仪，成为临床测定酶活性浓度最常用的方法。
3
酶活性检测的影响因素
合适的底物与最适底物浓度，[S]>>[E总]
理想的缓冲液与最适离子强度
K3Fe(CN)6
金氏单位(King’s unit): 在37℃条件下，每100 mL血清与底物作用15分钟，产
生1mg酚的ALP活性为1个金氏单位。
7
实验步骤
T S B C
血清 (mL)
酚标准液 (mL) 蒸馏水 (mL) 碳酸盐缓冲液 (mL) 底物液 (mL)
0.1
— — 1.0 1.0
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
1
实验目的
• 熟悉酶活性检测的意义 • 熟悉血清ALP活性测定方法(磷酸苯二钠法) • 掌握血清ALP活性测定的临床意义
2
实验原理
• 酶活性：酶催化某一化学反应的能力，常用单位时间内产物的 生成量(即酶促反应速度)来表示酶活性大小。 • 终止测定法(或定时法): 在酶作用一段时间后，加入强酸、强 碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内产物的生成量，
病理性增加: (1) 肝胆疾病。阻塞性黄疸、黄疸性肝炎和肝癌等，尤以癌性梗阻最明显。 (2) 各种骨骼疾病。佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复
愈合期等。
病理性降低: 呆小症、磷酸酶过少症等。
6
磷酸苯二钠法
在pH=10条件下，ALP可催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二 钠。苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生 成醌衍生物，根据红色深浅可测定酶活性的大小。
血清碱性磷酸酶的活性测定
实验原理
三.核心原理 ALP催化磷酸苯二钠转变成苯酚的速率 可用分光光度计监测，从而计算ALP活 力的大小 ALP 磷酸苯二钠+H2O----------苯酚+磷酸氢 PH 10 二钠 苯酚+4-氨基安替比林--铁氰化钾---红色醌 亚胺衍生物
试剂
碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替比 林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。棕 色瓶贮存。 磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。 显色液 铁氰化钾K3[Fe(CN)6]2.5g、硼酸 17g，各溶于400ml蒸馏水，混合后加蒸馏 水至1L，棕色瓶避光保存。 酚标准工作液0.05mg/ml
实验操作
试剂/ml 血液 酚标准液 蒸馏水 PH10碳酸盐 缓冲液 底物液 铁氰化钾溶 液 血清 测定管（T） 0.100 ----1.00 标准管（S) --0.100 --1.00 空白管（B） 对照管（C） ----0.100 1.00 ------1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物液预热
临床意义
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高 2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄 疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
生化试验第三组
实验目的
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。
其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。
一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。
2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。
将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。
3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。
将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。
二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。
2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。
将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。
注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。
3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。
综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。
碱性磷酸酶值测定实验报告
碱性磷酸酶值测定实验报告一、实验目的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，简称 ALP）是一种广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
本次实验的目的是测定样本中碱性磷酸酶的活性，以评估相关生理或病理状态。
二、实验原理碱性磷酸酶在碱性环境下能够催化磷酸酯的水解反应，生成无机磷和醇。
通过测定生成的无机磷的量，可以间接反映碱性磷酸酶的活性。
本实验采用磷酸苯二钠法，磷酸苯二钠在碱性条件下被碱性磷酸酶水解生成苯酚和磷酸氢二钠。
苯酚与 4-氨基安替比林反应生成红色醌亚胺衍生物，在 510nm 波长处有最大吸收峰。
通过测定吸光度值，并与标准曲线对照，即可计算出碱性磷酸酶的活性。
三、实验材料与设备1、材料血清样本磷酸苯二钠溶液碳酸盐缓冲液（pH 100）4-氨基安替比林溶液铁氰化钾溶液酚标准液2、设备分光光度计恒温水浴锅移液器试管、刻度吸管等四、实验步骤1、标准曲线的绘制取 6 支干净试管，分别编号为 0、1、2、3、4、5。
按表 1 向各试管中加入试剂，混匀。
置于 37℃水浴中保温 15 分钟。
加入铁氰化钾溶液 30ml，立即混匀。
用分光光度计在 510nm 波长处，以 0 号管调零，读取各管的吸光度值。
以酚含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
表 1 标准曲线绘制的试剂加入量｜试管编号|0|1|2|3|4|5|｜｜｜｜｜｜｜｜｜酚标准液（ml）｜0|005|010|020|030|040|｜蒸馏水（ml）｜10|095|090|080|070|060|｜碳酸盐缓冲液（ml）｜30|30|30|30|30|30|｜4-氨基安替比林溶液（ml）｜10|10|10|10|10|10|｜铁氰化钾溶液（ml）｜30|30|30|30|30|30|2、样本测定取 3 支干净试管，分别编号为测定管、对照管和空白管。
按表 2 向各试管中加入试剂，混匀。
置于 37℃水浴中保温 15 分钟。
碱性磷酸酶米氏常数及活性的测定
[结果与计算] 在37℃保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶 活性单位，以标准曲线查出释放酚量(μg)即可 算出酶活性。
100mL血清中酶活性 = 释放的酚量×（1/0.1）×100× （1/1000）=释放的酚量（μg） （释放酚量（μg）、1/0.1--0.1为实际取血清0.1ml、 100为100ml血清、1000为μg变为mg。）
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐 标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方 向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以 正确求得该酶的Km值，如图所示。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度 的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算 其Km值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反 应的酶对于不同的底物有不同的Km值。本实验以磷 酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游 离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林 作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜 色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以 计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含 量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：
三、[试剂与器材] 1．0.04mol/L 基质液 2．0.1mol／L碳酸盐缓冲液pH10(37℃) 3．碱性溶液 4．0.5％铁氰化钾 5．0.3％ 4-氨基安替比林 6．酚标准液(0.1mg/mL) 7．37℃恒温水浴锅 8．可见光分光光度计
四、[操作步骤] 1．酚标准曲线的绘制 ：
酚含量（μg）：
(4)各管分别加入0.3％ 4-氨基安替比林 1.OmL，0.5％ 铁氰化钾2.0mL，充分混 匀，放置10分钟，以6号空白管作对照， 于510nm波长处比色测定，根据酚标准 曲线计算酶活性。 (5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐 标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性 单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出Km 值。
碱性磷酸酶km测定实验报告
碱性磷酸酶km测定实验报告碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，简称ALP）是一种存在于人体组织和体液中的酶类，其活性的测定对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。
本文将对碱性磷酸酶的KM测定实验进行详细介绍和分析。
一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶的KM值，以了解其底物浓度对酶活性的影响，并探讨酶底物的亲和力。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种催化磷酸酯水解的酶，其底物为磷酸酯类物质。
当底物浓度较低时，酶活性会受到限制，因此，通过测定不同底物浓度下的酶活性，可以得到碱性磷酸酶的KM值。
KM值是酶与底物结合的亲和力指标，数值越小表示酶对底物的结合越紧密。
三、实验步骤1. 准备实验所需材料和试剂，包括碱性磷酸酶酶液、磷酸酯底物、缓冲液等。
2. 制备一系列不同浓度的磷酸酯底物溶液，如0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM等。
3. 将不同浓度的磷酸酯底物溶液分别与碱性磷酸酶酶液混合，使其反应一定时间。
4. 停止反应，并加入一定量的酶抑制剂，以停止碱性磷酸酶的活性。
5. 使用特定的检测方法，如比色法或荧光法，测定反应液中产生的产物浓度。
6. 根据不同底物浓度下产物浓度的变化，绘制酶活性与底物浓度的曲线。
7. 通过曲线拟合，计算出碱性磷酸酶的KM值。
四、实验结果与分析根据实验数据绘制的酶活性与底物浓度曲线，可以观察到酶活性随着底物浓度的增加而逐渐增加，但增加速率逐渐减缓。
这是因为底物浓度增加，酶与底物的结合也增加，但当底物浓度达到一定程度时，酶的活性已经接近饱和状态，进一步增加底物浓度对酶活性的影响较小。
通过对曲线的拟合，可以计算出碱性磷酸酶的KM值。
KM值表示酶与底物结合的亲和力，数值越小表示酶对底物的结合越紧密。
在实验中，我们可以通过计算得到不同底物浓度下的KM值，从而了解碱性磷酸酶与底物之间的亲和力变化情况。
五、实验误差与改进在实验过程中，可能存在一些误差，如底物溶液的制备误差、酶活性的测定误差等。
碱性磷酸酶比活性测定实验报告
碱性磷酸酶比活性测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶（ALP）的比活性，了解其在生物体内的作用和活性水平。
通过实验，掌握碱性磷酸酶比活性测定的基本原理和方法，培养实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化磷酸酯的水解反应。
在本实验中，以对硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在碱性条件下，碱性磷酸酶能够将 pNPP 水解生成对硝基苯酚（pNP）和磷酸。
pNP 在碱性溶液中呈黄色，其在 405nm 波长处有最大光吸收。
通过测定反应体系在405nm 处的吸光度变化，可以计算出碱性磷酸酶的活性。
比活性是指每毫克蛋白质所含的酶活性单位数，通过测定蛋白质含量和酶活性，即可计算出碱性磷酸酶的比活性。
三、实验材料与仪器1、实验材料碱性磷酸酶标准品对硝基苯磷酸二钠（pNPP）碳酸钠碳酸氢钠缓冲液（pH 100）氢氧化钠溶液（1mol/L）考马斯亮蓝 G-250 试剂牛血清白蛋白标准品待测样品（组织提取液或细胞培养液）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器容量瓶试管四、实验步骤1、标准曲线的绘制配制不同浓度的对硝基苯酚（pNP）标准溶液：分别吸取 0、01、02、03、04、05ml 的 1mmol/L pNP 标准溶液，加入到 10ml 容量瓶中，用碳酸钠碳酸氢钠缓冲液定容至刻度，得到浓度为 0、10、20、30、40、50μmol/L 的标准溶液。
长处测定各标准溶液的吸光度。
绘制标准曲线：以 pNP 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）配制考马斯亮蓝 G-250 试剂：将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶解于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1000ml。
配制牛血清白蛋白标准溶液：将牛血清白蛋白标准品用蒸馏水配制成 0、01、02、03、04、05mg/ml 的标准溶液。
碱性磷酸酶活性测定
碱性磷酸酶活性测定磷酸酶磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。
试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。
土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。
基本原理：土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。
应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。
当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。
因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。
这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。
该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）试剂配制：1）甲苯2）0.5% 磷酸苯二钠3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液标准曲线绘制：取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。
操作步骤：1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。
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碱性磷酸酶活性测定
磷酸酶
磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。
试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。
土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。
基本原理：
土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。
应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。
当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。
因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。
这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。
该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）
试剂配制：
1）甲苯
2）0.5% 磷酸苯二钠
3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml
4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液
标准曲线绘制：
取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。
操作步骤：
1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理
2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠
3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。
4) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照
5)无基质对照：对每个土样，设置以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
6）比色程序：
取滤液3ml置于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。
结果计算:
磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示：
酚（mg）=a×8
式中，a——从标准曲线上查得的酚毫克数
8——换算成1g土的系数
以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。
磷酸酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m
式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示烘干土重。