大肠杆菌测定
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
大肠菌群的测定
大肠菌群:一群能发酵乳糖,产酸产气, 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽 孢杆菌. 分布：分布较广，多存于温血动物粪便，
人类粪便中或者被其污染的地方
测量意义：该菌源于粪便,故
以此作为粪便污染指标来评价食 品的卫生质量,推断食品中是否 有污染肠道致病菌的可能
.
检测方法
国家标准检验方法（乳糖发酵法）
快速测定方法
• 最可能数法 • 平板法
步骤与乳糖法相似。培 养条件相同
最可能数（MPN)法
• 原理：大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶。分解 液体培养集中的酶底物MUGal,使4-甲基伞形 酮游离，在336nm的紫外光灯下呈现蓝色荧 光。可根据产生状况结合MPN表对大肠菌群 进行测定
平板法
• 原理：大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶。分解 液体培养集中的酶底物 —— Aliz-gal ，使茜 素有了并与固体培养基中的铝 铁 钾 铵离 子结合形成紫色（或红色）络合物，使菌 落呈现相应颜色
倒平板
熔化已灭菌的培养基并冷却至45℃左右 倒平板，每种培养基每个稀释度各三只 平板。
菌落类型
wenku.baidu.com
D.证实实验(复发酵)
在上述平板上,挑选典型菌落接种在乳糖发酵 管中,置36±1oc培养箱内,培养24±2h,观 察产气情况. • 凡乳糖产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆 菌,即可报告为大肠菌群阳性.
双 料l
双 料
双 料
单 料
单 料
单 料
单 料
单 料
单 料
盐 水
稀 释 液
10*0.1 1ml
1*0.1 0.1ml
1*0.01 0.01ml
0.01
0.1
36±1 C培养箱内.培养24±12h 如发酵都不产气,则报告大肠阴 性如发酵有产气进行下步试验
O
C.分离培养
将产气的样品接种伊红美兰培养基 上,36±1OC培养箱内培养,18±24h 观察菌落形态,并做革兰氏染色证实实验 菌落形态:①深紫黑色,具有金属光泽的菌落 ②紫黑色,不代或略带金属光泽的 菌落 ③淡紫黑色,中心色较深的菌落 (可疑菌落)粉红色,中心色无较深的菌落
无荧光 报告 阴性
其他检验方法
• • • • • • • LTSE快速检测法 疏水网膜法 TTC显色法 DC(去氧胆酸法)半固体试管法 纸片法 显色荧光法 PCR法
注意事项
(1).初发酵和证实试验:乳糖发酵实验系样品 发酵,不是纯菌的发酵实验,所以初发酵阳性 并不代表大肠菌群阳性,因此,必须做进一步 证实实验.
(2).产气量与倒气管:
① 用于初发酵或复发 酵的导气管内应无
气泡, 作空 白对照
②应以产气为主,产酸仅作参考
③导气管口被样品颗粒封住,影响结果
• 3)挑选菌落:在平板呈黑色,有或无金属光泽, 检出率最高,粉红色,粉色检出率最低.只挑选 一个菌落影响大肠菌群的检出率,当菌落不 典型时,应挑选2~3个菌落作证实试验,以免 出现假阴性. • (4) MPN检索表:本表采用3个稀释度,即 1ml(g),0.1ml(g), 0.01ml(g) 若改用10ml(g),1ml(g), 0.1ml(g)时,表内数 字应相应降低10倍. 若改用0.1ml(g),0.01ml(g), 0.001ml(g)时, 表内数字应相应增加10倍.
大肠菌群检验步骤
大肠菌群的检验步骤为检样稀释.依据国标 检样稀释 初发酵(乳糖发酵) 五步 分离培养 证实实验(复发酵) 结果报告
大肠菌群检测流程图
A.检样稀释
• 1)---以无菌操作将检样25g/ml接种在
装有 225ml灭菌生理的盐水或其它稀 释液的灭菌玻璃瓶内.充分混合,制成 1:10的均匀稀 • (2)---用1ml灭菌吸管,吸取1:10稀释液 注人含有9ml灭菌生理的盐水或其它稀 释液的灭菌试管内,混匀,制成1:100稀 释液
无菌取样
样液稀释
充分振摇或研磨
25g或25ml 检样
1:10稀释液。
225mL稀释液 1ml 含有玻璃珠的灭菌玻璃 瓶或乳钵
1ml
1ml
9ml水 1:100
9ml水 1:1000
9ml水 1:10000
B.初发酵(通常说的假定试验,目的在于检查样品中有
无发酵产气的细菌)
将待检样品接种于乳糖胆发酵管内.接种量在 1ml以上者,用双料管,1ml 及1ml以下者,用单料 管.每一种稀释液接种3管.
计数
• 当平板上的紫色（或红色）菌落不高于150个， 且其中至少有一个平板紫色（或红色)菌落不 少于15个则可按下式计数
N
( n1 n 2 ) d
C
快速测定流程
检样 稀释 MUGal肉汤 （MPN)法 336nm紫外灯下暗 处观察 有荧光 阳性 报告 Aliz-gal琼脂 （平板法） 计数紫色（或红色） 菌落
原理：1 一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧
和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌. o o +2 C能在有胆 2 大肠菌群在36 C 盐存在下生长
MPN:最大可能数的简称.表示样品中活菌的 密度.是用概率论来推算样品中菌数近似的 数值. 常用的单位: 涂抹大肠实验------MPN/100cm2 液体大肠实验------MPN/100ml 固体大肠实验------MPN/100g 大肠空白没有单位,不用出结果
大肠菌群:一群能发酵乳糖,产酸产气, 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽 孢杆菌. 分布：分布较广，多存于温血动物粪便，
人类粪便中或者被其污染的地方
测量意义：该菌源于粪便,故
以此作为粪便污染指标来评价食 品的卫生质量,推断食品中是否 有污染肠道致病菌的可能
.
检测方法
国家标准检验方法（乳糖发酵法）
快速测定方法
• 最可能数法 • 平板法
步骤与乳糖法相似。培 养条件相同
最可能数（MPN)法
• 原理：大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶。分解 液体培养集中的酶底物MUGal,使4-甲基伞形 酮游离，在336nm的紫外光灯下呈现蓝色荧 光。可根据产生状况结合MPN表对大肠菌群 进行测定
平板法
• 原理：大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶。分解 液体培养集中的酶底物 —— Aliz-gal ，使茜 素有了并与固体培养基中的铝 铁 钾 铵离 子结合形成紫色（或红色）络合物，使菌 落呈现相应颜色
倒平板
熔化已灭菌的培养基并冷却至45℃左右 倒平板，每种培养基每个稀释度各三只 平板。
菌落类型
wenku.baidu.com
D.证实实验(复发酵)
在上述平板上,挑选典型菌落接种在乳糖发酵 管中,置36±1oc培养箱内,培养24±2h,观 察产气情况. • 凡乳糖产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆 菌,即可报告为大肠菌群阳性.
双 料l
双 料
双 料
单 料
单 料
单 料
单 料
单 料
单 料
盐 水
稀 释 液
10*0.1 1ml
1*0.1 0.1ml
1*0.01 0.01ml
0.01
0.1
36±1 C培养箱内.培养24±12h 如发酵都不产气,则报告大肠阴 性如发酵有产气进行下步试验
O
C.分离培养
将产气的样品接种伊红美兰培养基 上,36±1OC培养箱内培养,18±24h 观察菌落形态,并做革兰氏染色证实实验 菌落形态:①深紫黑色,具有金属光泽的菌落 ②紫黑色,不代或略带金属光泽的 菌落 ③淡紫黑色,中心色较深的菌落 (可疑菌落)粉红色,中心色无较深的菌落
无荧光 报告 阴性
其他检验方法
• • • • • • • LTSE快速检测法 疏水网膜法 TTC显色法 DC(去氧胆酸法)半固体试管法 纸片法 显色荧光法 PCR法
注意事项
(1).初发酵和证实试验:乳糖发酵实验系样品 发酵,不是纯菌的发酵实验,所以初发酵阳性 并不代表大肠菌群阳性,因此,必须做进一步 证实实验.
(2).产气量与倒气管:
① 用于初发酵或复发 酵的导气管内应无
气泡, 作空 白对照
②应以产气为主,产酸仅作参考
③导气管口被样品颗粒封住,影响结果
• 3)挑选菌落:在平板呈黑色,有或无金属光泽, 检出率最高,粉红色,粉色检出率最低.只挑选 一个菌落影响大肠菌群的检出率,当菌落不 典型时,应挑选2~3个菌落作证实试验,以免 出现假阴性. • (4) MPN检索表:本表采用3个稀释度,即 1ml(g),0.1ml(g), 0.01ml(g) 若改用10ml(g),1ml(g), 0.1ml(g)时,表内数 字应相应降低10倍. 若改用0.1ml(g),0.01ml(g), 0.001ml(g)时, 表内数字应相应增加10倍.
大肠菌群检验步骤
大肠菌群的检验步骤为检样稀释.依据国标 检样稀释 初发酵(乳糖发酵) 五步 分离培养 证实实验(复发酵) 结果报告
大肠菌群检测流程图
A.检样稀释
• 1)---以无菌操作将检样25g/ml接种在
装有 225ml灭菌生理的盐水或其它稀 释液的灭菌玻璃瓶内.充分混合,制成 1:10的均匀稀 • (2)---用1ml灭菌吸管,吸取1:10稀释液 注人含有9ml灭菌生理的盐水或其它稀 释液的灭菌试管内,混匀,制成1:100稀 释液
无菌取样
样液稀释
充分振摇或研磨
25g或25ml 检样
1:10稀释液。
225mL稀释液 1ml 含有玻璃珠的灭菌玻璃 瓶或乳钵
1ml
1ml
9ml水 1:100
9ml水 1:1000
9ml水 1:10000
B.初发酵(通常说的假定试验,目的在于检查样品中有
无发酵产气的细菌)
将待检样品接种于乳糖胆发酵管内.接种量在 1ml以上者,用双料管,1ml 及1ml以下者,用单料 管.每一种稀释液接种3管.
计数
• 当平板上的紫色（或红色）菌落不高于150个， 且其中至少有一个平板紫色（或红色)菌落不 少于15个则可按下式计数
N
( n1 n 2 ) d
C
快速测定流程
检样 稀释 MUGal肉汤 （MPN)法 336nm紫外灯下暗 处观察 有荧光 阳性 报告 Aliz-gal琼脂 （平板法） 计数紫色（或红色） 菌落
原理：1 一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧
和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌. o o +2 C能在有胆 2 大肠菌群在36 C 盐存在下生长
MPN:最大可能数的简称.表示样品中活菌的 密度.是用概率论来推算样品中菌数近似的 数值. 常用的单位: 涂抹大肠实验------MPN/100cm2 液体大肠实验------MPN/100ml 固体大肠实验------MPN/100g 大肠空白没有单位,不用出结果