生物工程专业毕业论文

生物工程专业毕业论文
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脂质体介导的CHO细胞转染
——脂质体介导的基因真核细胞转染专业：生物工程专业
摘要
CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。

真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。

脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。

根据膜的融合及内吞作用，可用作外源物质进入细胞的载体。

在对生物大分子的传递过程中，脂质体是十分有效的载体，无论对微生物还是对植物细胞或对哺乳动物细胞导入外源DNA，脂质体的包裹都能对抗核酸酶的消化。

脂质体的制备主要有超声波法、磷脂酰丝氨酸Ca2+离子融合法和逆相蒸发等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。

脂质体介导转染法的改进方法包括促进转染的脂类、增加转染效率的添加剂、DNA与脂质体最佳比率的确定。

本实验将携带绵羊P基因的绿色荧光蛋白真核表达载体转入中国仓鼠卵巢细胞，得到稳定表达绵羊PrP基因的CHO细胞系。

得出外源导入CHO的绵羊PrP可以在CHO中稳定表达的结论。

关键词：CHO细胞、脂质体、转染
Abstract
CHO cells of Chinese hamster ovary cells, biological engineering is currently widely used cell lines. Eukaryotic cells in CHO cells is currently restructuring glycosyl protein of choice for the production system.
Exogenous genes into cells mainly has four kinds of methods: electric shock method, calcium phosphate and mediated by liposome and virus mediated method.
Liposome is a phospholipid dispersed in water is formed when the lipid bilayer, also known as the artificial biological membrane. According to the membrane fusion and endocytosis, can be used as exogenous substances into the cell carrier.
On biological macromolecules in the transfer process, liposomes are very effective carrier, regardless of the microorganism or plant cell or mammalian cells for introducing exogenous DNA, liposome encapsulated can against nuclease digestion.
Preparation of liposomes are ultrasonic method, phosphatidylserine Ca2+ ion fusion method and reverse phase evaporation, using ultrasonic method to prepare monolayer or multilayer lipid globules to intracellular introduced mass is less, so commonly used two methods for preparation of large liposomes. Liposome mediated transfection method improvement methods include promoting transfection lipids, increase in transfection efficiency additives, DNA and liposome best rate determine.
This experiment will carry sheep P gene green fluorescent protein eukaryotic expression vector was transfected into Chinese hamster ovary cells, stable expression of PrP gene in sheep in the CHO cell line. Draw foreign import CHO sheep PrP can CHO stable expression of the conclusion.
Key words: CHO cells, liposomes, transfection
引言
Lipofectamine™ 2000转染试剂是一种阳离子脂质体,在体外可以转染许多种哺乳动物细胞，对各类细胞系都可提供最高的转染效率，具有高效性和操作步骤简单的优点。

其转染效率以及细胞活性取决于许多实验因素,如细胞密度、脂质体和DNA的浓度、脂质体2DNA 复合物的作用时间以及是否有其它介质成分如抗生素和血清。

使用Lipofectamine™ 2000试剂，可以获得：在多种细胞系中具有极高地转染效率和较高水平地重组蛋白表达；传输siRNA的优异性能；在有血清存在的情况下可保证转染效力——转染后无需更换培养基；保证可以用于高通量应用的试剂；用于建立稳定细胞系的可靠试剂Lipofectamine™ 2000试剂为大多数细胞提供了最高的转染效率和活性。

当存在血清或用于进行蛋白表达的细胞系(如COS-7，CHO和293)时，Lipofectamine™ 2000尤为有效，效率可超过90%。

本实验将构建了CHO细胞培养基及CHO细胞的培养，并利用脂质体转染试剂转染CHO细胞中，观察全长的重组绵羊EGFP-PrP是否表达，能否得到稳定表达绵羊PrP基因的CHO细胞系。

1 实验综述
1.1 细胞转基因的研究进展
数百万年来原核生物如大肠杆菌经常相互分享它们的遗传物质，人们受到自然的启发出现了将DNA导入培养细胞的技术。

随着这种技术的不断进步，人们可以在培养细胞中进步各种外源基因的表达，生产制备大量经过真核细胞翻译后加工的特有的活性蛋白，研究基质的功能，表达蛋白的结构、生化特性和基因表达的调控机理等。

1.2 细胞的转染方法
转染就是让外源核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要阶段。

如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。

核酸转染技术在21世纪60年代末和70年代初期已经建立，最早使用的方法是磷酸钙法和用DEAE一dextran 乙胺乙基葡聚糖)作为载体使DNA吸附于细胞表面的方法。

至今己经有多种方法可以用于转染。

常用的转染方法有:磷酸钙法、DEAE一葡聚糖法、电穿孔法(电击基因导人法)、脂质体转染法，另外还有细胞核的直接微注射法、Pol沙rene介导的转染法、基因枪法。

转染技术的广泛使用促进了该领域及相关领域的发展。

从磷酸钙到脂质体，到多胺，可用转染的细胞种类己越来越多。

转染己不再仅限于将DNA转入细胞中，RNA、siRNA、蛋白质等生物大分子也进入了转染的行列。

在细胞中表达外源基因有两个关键的因素:一个是选择构建合适的表达载体和表达细胞株，另一个就是选择合适的方法将克隆的基因导入培养细胞中进行
表达。

针对不同的细胞株和不同的实验目的，需要选择合适的表达细胞株及转染方法。

（1）D EAE一葡聚糖法
是在1965年出现的古老的转染方法之一，到现在只有少数人坚持采用带正电的DEAE一葡聚糖或Pol沙rene多聚体可以结合带负电的DNA分子，形成的DNA复物结合在带负电的细胞表面，通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克或细胞内吞作用，使DNA复合体进入细胞。

DEAE一葡聚糖仅限于瞬时转染，重复性好，转染时需要去除血清。

（2）磷酸钙共沉淀法
该方法最早是在1973年开始采用，氯化钙十DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混合，形的极微小的磷酸钙一DNA复合物沉淀粘附到细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。

沉淀颗的大小和质量对于转染的成功至关重要，pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响，所以重复性不佳。

在己经很少有人采用这种方法。

此法比DEAE法更容易得到稳定转染，但是转染原代细胞较困难。

（3）电穿孔法
通过短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜暂时穿孔，穿过孔扩散到细胞内。

电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。

理论上说电穿孔法可用于各种细胞，是这种方法需
要昂贵的设备，而且由于细胞死亡率高，每次转染需要更多的细胞和DNA，这种细胞电转的条件都需要进行多次优化。

新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因双筛选标记的人胰岛素乳腺特异表达载体转入体外的牛胎儿成纤维细胞，获得了用于转基因克隆牛的核供体转基因细胞，为高效率、低成制作转基因克隆牛奠定了基础。

（4）脂质体法
中性脂质体(liPid)是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA 导入细胞膜内。

带正阳离子脂质体(Catin正cliposomes)则不同，在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，以形成微小的(平均大小约loo400nm)单层脂质体，这些脂质体带正电，可以靠静电作用合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。

因此使用阳离子脂质体转染的原理与利用中性脂质体转染的原理不同，使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成阳离子脂质体/DNA复合物。

阳离子脂质体/DNA复合物进入细胞是阳离子脂质体移基因的第一步，以前通常认为脂质体与细胞膜间的融合是脂质体转移DNA进入细胞的机制，而现有证据表明复合物的整体缓慢内嗜作用才是主要的机制，这种作用通过多糖相互作用调控。

阳离子脂质体心NA复合物进入细胞虽然比较慢，但效率较高。

不过，不是所有进入的基因都会发生作用。

（5）非脂质体的脂质法
这是新一代的转染技术，代表着脂质体技术的未来发展方向。

革新配方成分形成结构而非简单的双层膜结构，令核酸传递更有效率而
且细胞毒性也显著降低。

化的树状聚合物(Activateddendrimers)属于纳米技术，高度树状分枝形成球形结构有着的大小和形状，借助每个球体无数活化的氨基末端凝聚在DNA上形成较为致密的结构，附在细胞膜上，经过内吞进入细胞。

活化的氨基可以调节胞内融酶体的pH值，抑制降解活使得DNA稳定存在。

此方法转染的效率高，毒性低，可重复性好。

血清的存在能显著提高转染效率。

1.3 外源基因导入细胞的类型
根据不同的实验目的，外源DNA导入培养细胞可分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染指的是外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到染色体只是短暂的高水平表达，可在转染24一%h后收获转染细胞对转染基因的转录和复制进行分别检测表达效果。

表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。

超螺旋质粒转向于瞬时表达，瞬时表达适合研究启动子等调控元件瞬时表达分别需的人力和时间比稳定表达少，但是DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，时间短且不稳定。

稳定转染，是外源基因整合于细胞染色体从而得到稳定的转染细胞株，使得转染的长期表达。

质粒整合到染色体上的几率很小，平均只有万分之一的几率。

1.4 转染细胞常采用的报告基因
目的基因导入宿主细胞，不仅是导入外源基因，而且要求正确表达。

选择合适的报告基因能灵敏地、非介入性地“报告”外源基因的
导入、表达过程。

报告基因即完整编码区的DNA片段，当它与外源基因被导入细胞或成体后，表达产物具有容易检测和别的特点，或者可以简便、快速地间接检测到目的基因的表达及调控状况。

在转基因细胞研究中常用的报告基因主要有:荧光标记、NcoR、CAf等。

（1）绿色荧光蛋白(GreenFluoreseentProtein，GFP)
绿色荧光蛋白编码238个氨基酸，最初是从多管母中发现的一种受蓝色光的激发可产生绿色荧光的蛋白。

荧光持续时间较长，并且不需要任何其他辅助因子的作用，能够自身催化形成发色结构，因而是一种全能的报告基因，已广泛应用于基因的组织特异性表达、细胞分化研究、转基因动植物阳性克隆的筛选等领域的研究。

（2）红色荧光蛋白(RedFluoreseentProtein，RFP)
最早报道珊瑚动物能提供各种类似GFP的荧光蛋白现己探明DsRed红荧光发色团单体的形成过程及单体发生有利于聚合的变化，即过程需要分子氧，在成熟的最后一步发生了66位氨基酸残基Gh的a位碳氮键的氧化形成氮化合物，并进一步扩展连接成红荧光发色团。

（3）新霉素抗性基因(Neomycinresistaneegene，NeoR) 新霉素抗性基因有两种，分别来自细菌转座子，编码素氨基糖普磷酸核糖转移酶的基因，均可对氨基糖普类抗生素产生抗性。

1.5 影响阳离子脂质体转染细胞转染效率的因素
很多因素会影响阳离子脂质体转染细胞的转染效率，如被转染细胞株种类，细胞培养环境，转染的DNA、RNA或者蛋白的质量和特性等。

（1）被转染细胞
被转染细胞的种类会影响到阳离子脂质体介导的基因转染效率，但引起这种影响的目前并不清楚。

脂质体复合物越易进入细胞，基因转染效率就越高。

转染前细胞最好经过1次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。

贴壁细胞生长到活率为80%时就要进行下一次传代，否则细胞就会出现接触抑制，从而降低细胞转染活力。

转染时细胞密度对转染效率影响非常显著。

不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型而异。

转染时过高或者过低的细胞密度致转染效率降低，甚至表达水平偏低。

因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，需进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等。

转染时贴壁细胞铺平率为40%一80%，但这个需要参考所选转染试剂的种类而定。

阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要90%的铺平率或者更多的悬浮细胞数;而有些多胺或者脂质体的配方则要求在40%一80%之间。

不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度。

（2）培养基种类
健康细胞的培养是一切成功转染的基础。

不同的细胞类型有不同的特性，需要特定培养基、血清、补充添加剂等。

血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗涤细胞在无血清培养基条件下转染，这对于某些对血清要求敏感的细胞来说是个难题。

对于主流的转染试剂来说，血清的存在
己经不会影响转染效率。

对于多数可以在血清条件下工作的转染试剂来说，血清的存在会影响脂质体心NA复合物的形成，但只要在NA复合物形成时用无血清培养基来稀释DNA和转染试剂就可以了，在转染过程中是使用血清的。

不过对于RNA转染，如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。

另外新培养基的预热对细胞转染很有帮助。

支原体、细菌、真菌污染，无论对于细胞培养或者转染都会严重影响转染结果，细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染。

但是这些添加剂可能对转染造成麻烦这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

这可能间接导致细胞死亡，转染效率低。

所以，对于选择脂质体转染试剂的实验，要特别注意在转染培养基中不用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。

这样，在转染前也润洗细胞。

（3）转染混合物中DNA与阳离子脂质体的量
阳离子质脂体具有细胞膜活性，因此可能对细胞膜或亚细胞结构的膜结构的完整功能产生影响，从而形成细胞毒性。

脂质体/质粒复合体是阳离子脂质体进行基因转染的关键一步，两者的比例对基因转率有重要的影响。

不同的阳离子脂质体有其最佳的DNA结合量比。

有作者认为阳离子脂质体正电荷与核酸的负电荷在1:1或以上时，核酸转运的效果最佳，在体外转染中，优化的电率常常大于1，而体内转染时其比率接近1较好。

体外转染试验表明，阳离子脂质体Dosper与DNA，LIPofectamine
与DNA比例为7.5:1(均为重量比)时，可获得最高的转染效率，用量高非但不会提高转染率，还会增加细胞毒性。

2 研究目的和原理
2.1 朊蛋白研究目的和意义
传染性海绵状脑病的病原是朊病毒，它一种具有传染性、抗蛋白酶水解的、含有GPI锚定位点的糖蛋白，同时还具有同普通病原微生物不同的理化和生物学特性．朊蛋白基因结构及其编码蛋白的序列在不同哺乳动物之间高度保守，由此看出机体正常的朊蛋白具有重要的生理作用．研究表明，机体正常的朊蛋白参与神经系统功能的维持、参与铜离子的代谢等重要作用．朊病毒是由机体正常的朊蛋白转化而来，其理化和生物特性恰恰与正常朊蛋白相反，因此研究机体正常朊蛋白的结构功能和Pr萨转变为prpsc的机理已经成为研究传染性海绵状脑病的热点。

另外研究发现，朊病毒存在种间屏障现象，表现为致病性朊病毒在繁殖过程中存在种属特异性和株系特异性的现象，而且朊蛋白基因的多态性与动物对海绵状脑病的易感性相关．动物传染性海绵状脑病如疯牛病的全球暴发给人类健康和食品安全带来极大的隐患，各国科学家致力于该病的发病机理的研究，但是到目前为止，科学界仍然没有确定机体正常朊蛋白的生理作用和异常朊蛋白的致病机理。

2.2国内外研究现状
传染性海绵状脑病或朊蛋白疾病包括人的克一雅氏病、致死性家族火眠、吉斯综合征、库鲁病、牛的海绵状脑病、羊的痒病、鹿的慢
性消耗性疾病及水貂的传染性水以貂脑病等。

这是一组或一类疾病，其共同特征是：潜伏期长达数月至数年，甚至致十年或几十年；机体感染朊病毒后不发热，不产生炎症，无特异性免疫应答；这类疾病可分为家族性、散发性、医源性三种类型，且均可由人工感染实验动物，但大多数朊病毒病在自然条件下不能进行水平传播；这类疾病的共同症状是；临床上呈现进行性共济失调、震颤、姿势不稳、痴呆、知觉过敏、行为反常等神经症状，病程发展缓慢，但最终以死亡告终。

组织病理学变化主要集中在中枢神经系统，主要表现为神经元空泡化，灰质海绵状病变、神经元丧火、星形胶质细胞增生，朊病毒蓄积和淀粉样蛋白斑块。

传染性海绵状脑病已经给人类生命安全、食品安全和世界畜牧业的生产带来极大的威胁．
3 脂质体介导CHO细胞转染
3.1 材料
3.1.1细胞系
中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)
3.1.2质粒
表达载体pBac[A3Neo十A3EGFP]、辅助质粒pHA3PIG
3.1.3主要试剂、药品、培养基
试剂：脂质体LipofectaminerM2000，购白北京拜尔迪生物工程公司；G418，Amresco公司产品，贿自北京索莱宝公司；
红0．029；调节pH7．2～7．4，过滤除菌备用。

台盼蓝：
购自中国农业大学供应科，储存浓度4％，使用浓度
0．4％．固定液：4％多聚甲醛甘氨酸漂洗液：IOOmM／L，
用DPBS配制冲洗液：DPBS，每升溶液中含CaCl2 O．109、
KCl 0．209、MgCl2·6H20 O．109，NaCl 8．009、Na2H·71120
2．169调节pH7．4，4"C保存．封闭液：5％正常山羊血清
抗荧光淬灭封片剂：碧云天公司
培养基：DMEM培养基，无血清opti．MEM，Gibeo
药品：①青霉素、链霉素购自jB京博大泰克公司．②胎牛血Hyclon 公司产品；③D-Hank’s：每升溶液中含NaCI 89、KCl0．49、
Na2HP040．069、l(IL]2P040．069、NaHC030．359。

④
双抗：以PBS或D-Hank's配制，过滤除菌。

⑤储存浓度为
lO万u，使用浓度为IOOU／mL；⑥抗体稀释液：含50／,
山羊血清的DPBS；⑦抗PrP单抗BEl2，英国TSE Research
Center。

⑧羊抗小鼠IgG，罗丹明标记，购自北京中衫生
物工程技术公司。

3.1.4主要仪器设备
①细胞用倒置显微镜(重庆光学仪器厂)
②医用超净工作台(HDL)；
③C02细胞培养箱(日本三洋)；
④OliymptB倒置荧光显微镜；激光共聚焦扫描显微镜(FV500)
⑤超低温冰柜：．80 CULT Freezer 702
⑥高速离心机：Beckman产品
⑦冷冻台式离心机：Eppendorf产品
⑧全自动高压锅：AUTOCLAVEMLS-3750
⑨DK．8D电热三相恒温水槽，上海跃进医疗器械厂
3.2 材料制备方法和步骤
3.2.1CHO细胞制备
（1）CHO细胞简介
CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。

真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系：因为与其他表达系统相比，它有许多优点：
①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分
子结构、理化特性和生物学功能方面接近于天然蛋白分
子。

②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化
③具有重组积阴德高效扩增和表达能力
④具有贴壁生长特性，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以
进行悬浮培养，表达水平较高
⑤C HO细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外
源蛋白的分离
CHO细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，
对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；培养过程需氧量少（氧传质系数kla大于10h-1即可满足每毫升107个细胞的生长）；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。

（2）培养基的组成
DMEM培养基组成
将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。

加注射用水（水温20~30℃）到950毫升，轻微搅拌溶解。

①加入2.438克碳酸氢钠
②轻微搅拌溶解，加注射用水至一升
③用1mol\L氢氧化钠溶液或1mol\L盐酸溶液调ph至所需值
④用0.2um滤膜正压过滤除菌
⑤溶液应在2℃~8℃下避光保存
（3）培养皿处理
玻璃器皿一般需用清洁液浸泡1~7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水洗两次，烤干备用。

用前160℃高温消毒2小时后使用。

96孔或24孔塑料板一般用2﹪NaOH浸泡4小时后，清水洗净再用1N HCL浸泡4小时，用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37℃干燥后，紫外线灯照射消毒。

新橡皮塞须用1/2NAOH煮沸15分钟，洗后再用4﹪HCL煮沸15分钟，清水冲洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压锅灭菌。

（4）CHO细胞培养
细胞培养方法包括固定化培养方法、微载体细胞培养法，本实验用微载体培养
微载体细胞培养法是一种用于培养依赖性细胞的大规模培养技术。

这种技术在生物反应器内加入培养基和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒（微载体），使细胞在微载体表面附着和生长，并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。

原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。

细胞只有附着在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面
的贴附是进一步铺展和生长的关键。

粘附主要是靠静电引力和范德华力。

细胞能否在微载体表面黏附，要取决于细胞与微载体的接触概率和相容性。

（5）CHO细胞无血清驯化
取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95﹪，开始进行无血清驯化。

细胞驯化在转瓶中进行。

将无血清细胞培养基和韩雪晴培养基的按1:1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2×105cells/ml的细胞，在37％、5％CO2培养箱进行培养。

根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一个阶段可稳定传代1-3代，接种密度维持在2×105cells/ml，逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例，即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为2-3×105cells/ml，直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2％，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在CHO无血清无动物组分培养基中。

在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO 种子细胞库。

具体操作如下：
①以2倍正常接种密度接种生长活跃物到75％有血清培养基：
25％SAF-CHO-G-004细胞培养基中，传代培养。

②当细胞密度大于5×105cells/ml时，有血清培养基
SAF-CHO-G-004细胞培养基为50:50的混合培养基中传代培养。

③以2×106到3×106cells/ml，25％有血清培养基和75％。