骨桥蛋白基因对大肠癌细胞增殖、侵袭及Akt磷酸化的影响

2012年12月第9卷第35期

·实验研究·

CHINA MEDICAL HERALD 中国医药导报大肠癌（包括结肠癌和直肠癌）近年来在我国发病率逐年增高。由于诊疗技术限制级人群忽视，很多患者发现时即有转移。转移的方式主要有血行转移、浸润种植、淋巴结转移等，主要转移至肝脏、淋巴结、肺部、脑部、及骨等部位。如何从分子水平进行大肠癌转移机制的研究，可为干预阻断大肠癌转移提供一定的理论基础。近年发现，骨桥蛋白（osteopontinin ，OPN ）与许多恶性肿瘤的侵袭转移的关系具有重要的相关性[1-2]。但是目前尚不完全清楚该基因在人大肠癌细胞侵袭过程中的机制。2012年1月~2012年6月，本课题组借助于RNA 干扰（RNA interference ，RNAi ）技术，以大肠癌Colo205细胞为模型，对其采用OPN 基因小干扰RNA （small interfering RNA ，siRNA ）转染处理，探讨了对癌细胞生长和侵袭的作用，并从信号转导通路（Akt ）方面探讨了分子机制。

1材料与方法1.1材料

人大肠癌细胞Colo 205购自美国ATCC 公司，本院组织细胞生物库冻存。OPN 基因siRNA 的正义链序列：GAA ACU CCC UGU AAA CUA A dTdT ；反义链序列：UAA GUU UAC AGG GAG UUU C dTdT ，由美国Dharmacon 公司合成。Akt 及磷酸化抗体购自美国Santa Cruz 公司。其他RNA 提前试剂（Trizol ，RNase 抑制剂），和逆转录试剂（SSRT Ⅱ、Taq 酶）及转染试剂Oligofectamine 购自美国Invitrogen 公司。1.2细胞培养及转染处理

人大肠癌Colo 205细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃、5%CO 2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1天，将浓度为1.0×105/mL 的细胞接种于24孔培养板24h 后，待细胞长满60%~70%时进行转染。细胞分组：①空白对照组（Con-A ）：未经任何处理的大肠癌细胞；②脂质体对照组（Con-B ）；③错配siRNA 体对照组（Con-C ）；④不

骨桥蛋白基因对大肠癌细胞增殖、侵袭

及Akt 磷酸化的影响

毛镇伟朱灵范钰▲

江苏大学附属人民医院肿瘤研究所，江苏镇江

212002

[摘要]目的探讨骨桥蛋白（osteopontin ，OPN ）基因对大肠癌细胞侵袭的影响及机制。方法以人大肠癌Colo 205细胞为模型，应用OPN 基因小干扰RNA （small interfering RNA ，siRNA ）转染处理后，采用荧光实时定量PCR 检测OPN 基因mRNA 水平，采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖能力，采用Boyden 小室模型方法检测癌细胞侵袭能力，采用蛋白质印迹检测癌细胞Akt 磷酸化水平。结果OPN 转染组癌细胞OPN mRNA 和蛋白水平明显被抑制，且与时间和浓度相关。与空白对照组比较，OPN 转染组细胞所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性。蛋白质印迹检测发现，OPN 转染组细胞Akt 磷酸化水平明显下调。结论OPN 基因转染可明显下调大肠癌细胞的增殖和恶性侵袭能力，下调Akt 磷酸化水平，是OPN 基因转染下调癌细胞的增殖和恶性侵

袭能力重要机制之一。

[关键词]大肠肿瘤；骨桥蛋白；侵袭；Akt ；磷酸化[中图分类号]R735.3+4[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2012）12（b ）-0055-03

Effects of osteopontin gene on prolireation and invasion and Akt phosphory -lation of human corectal cancer cell

MAO Zhenwei ZHU Ling FAN Yu ▲

Cancer Institute,the People ′s Hospital Affiliated to Jiangsu University,Jiangsu Province,Zhenjiang 212002,China

[Abstract]Objective To study the effects of osteopontin (OPN)gene on invasion and it ′s mechanism of human colon can -cer cell.Methods After human colon cancer Colo 205cell were transfected by OPN small interfering RNA (siRNA),the expression of OPN mRNA and protein were exmined by real-time PCR and western blot respectively,and anchorage-inde -pendent growth was exmined by clon formation in soft agar,and invasion ability was determined by boyden chamber model,and Akt phosphorylation was evaluated by Western blot assay.Results The level of mRNA and level of OPN of group transfectd with siRNA decreased mard in a time-dependent and dose-dependent pared with control group,both colony formation in soft agar and cells traversed membrane reduced significantly in a dose-dependent manner.The re -sults from western blot showed that there were significant phenomenon of inhibition,which was in a dose-dependent man -ner.Conclusion Knock-downing OPN with siRNA can inhibit and invasion ability of colon cancer through induing Akt phosphorylation.

[Key words]Colon carcinoma;Osteopontin;Invasion;Akt;Phosphorylation

[基金项目]江苏省镇江市科技计划项目（SH2009014）。

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