SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳

SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳

一．原理

SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济快速而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。蛋白质在一定浓度的SDS中与SDS 分子按比例结合，SDS能破坏蛋白质分子间的非共价键，使蛋白质变性并失去原有的空间构型，形成带负电荷的SDS一蛋白质复合物。这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子，从而降低和消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。这样各种SDS一蛋白质复合物在电泳中不同的泳动仅反应了分子量的不同，且蛋白质分子量的对数同其相对迁移率呈直线关系。根据此原理可以制成各种参考蛋白质分子量的对数和它的相对迁移率的标准曲线，从而求得被测蛋白质的分子量。

二．材料及试剂

1．Pharmasla电泳仪EPS500／400

2．垂直板状电泳装置（Bio－RAD MiniPROTEAN 11 CELL）

3．本室常用蛋白质MARKER。

低分子量---97,400kd 66,200kd 43,000kd 31,000kd 20,100kd 14,400kd

中分子量---66,000kd 45,000kd 36,000kd 29,000kd 24,000kd 20,100kd 14,200kd

4·30％凝胶贮液

单体丙烯酰胺29．2g

双体N，N’-甲叉双丙烯酰胺0．8g

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加双蒸水至100ml

过滤后棕色瓶4℃保存

5．分离胶缓冲液

1．5mol Tris-Hcl PH8.8

Tris－Base 18.17g

加双蒸水50ml，完全溶解后缓慢加入浓HCL至PH为8．8，加双蒸水定容至100ml

6、浓缩胶缓冲液

1.0mol Tris－Hcl PH6．8

Tris－Base 12.1g

加双蒸水50ml，完全溶解后缓慢加入浓HCL至PH为6.8，加双蒸水定客至100ml

7、10%SDS（W／V）100ml 室温保存

8、10％过硫酸铵（W／V）l－5ml，4摄氏度存放（过硫酸铵会缓慢分解，每次配液量不宜多，隔周新鲜配制）

9、N，NNN一四甲基乙二胺（TEMED）

10、Tris一甘氨酸电泳缓冲液

5x储存液：在900ml去离子水中溶解

Tris-碱15.1g

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甘氨酸94g 72g

SDS 5g 用去离子水补至1000ml

11、2X样品缓冲液（室温储存）

0.5M Tris-HCL,Ph6.8 2.0ml

冰醋酸10ml

甲醇20ml

去离子水70ml

脱色液

冰醋酸：甲醇：去离子水1：2：7

三、操作步骤：

l、准备好用于灌胶的玻璃板和间隔片。用去污剂温溶液洗涤玻璃板和间隔片，用自来水彻底冲洗，再用去离子水洗净。用乙醇冲洗玻璃板，并置于一旁晾干。

2、组装凝胶模具（可按厂家说明书）装配好灌胶用的模具，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触，防凝胶渗漏

3．、按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液，依次混合水、30％丙烯酰胺、1.5M Tris-HCI pH8.8、10%SDS、10％过硫酸铵，一旦加入TEMED马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作；

4、迅速在两块玻璃板的间隙灌注丙烯酰胺溶液（3.2ml），留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再Icm）。用移液器小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层无水乙醇或去离子水。将凝胶垂直放置于室温下。

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5、分离胶聚合完全后（30-40分钟），吸出覆盖层液体再用纸条的边缘吸净残留液体。

6、配制一定体积一定浓度的浓缩胶溶液，依次混合水、30％丙烯酰胺、l.0M Tris-Hcl PH6．8、10％SDS、10％过硫酸铵，一旦加入TEMED马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作；

7、在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡在加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下；

8、当浓缩胶发生聚合时，可把样品置于lxSDS凝胶加样缓冲液中，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性（必须将分子量已知的标准参照蛋白质样品同时变性）；

9、浓缩胶聚合完全后（约30分钟），小心移出梳子，立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。

10、把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液；

11、按预定顺序加样，每样品加15ul，最后在所有不用的样品孔中加上等体积的IXSDS凝胶加样缓冲液

12、将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm．当染料前沿进入分离胶后，把电压调为15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，然后将电压调至零，关闭电源。

13、从电泳装置上卸下玻璃板放在纸巾上用垫片撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位

14、染色：将凝胶放入平皿中，加入4-5倍体积的考马司亮蓝染色液，放在平缓的摇床上于室温染色4小时以上。

15、脱色：将凝胶放人平皿中，加人4-5倍体积的脱色液，置于平缓的摇床上于室温脱色4-8小时。期间更换脱色液3-4次。直到电泳图谱清晰为止。

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16、脱色后将凝胶用去离子水冲洗后置于电泳图象分析系统拍照并分析。

四、注意事项：

1．制备凝胶用的玻板用前要保持洁净。

2．过硫酸铵溶液使用期不宜超过两周。

3．10％SDS室温存放（低温时易析出）。

4．丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性，故操作时应带手套。

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