第八章分子标记及其应用

第八章分子标记及其应用

分子标记的种类与特点

1. 遗传标记的种类与特点

遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。

Minisatellites：小卫星序列

遗传标记的种类与特点

1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。

2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。

4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。

2. DNA分子标记

DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。

2.1 分子标记的优点

1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限；

2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制;

3）多态性高，自然存在，无须专门创造；

4）表现为“中性”，即不影响性状的表达；

5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。

2.2 分子标记的类型

分三大类:

基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length polymorphism ），限制性片段长度多态性

基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SCAR、STS等

基于DNA测序: 第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等

第三节分子标记的应用

1. RFLP标记

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。

关键因素：

限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。

探针：常用单拷贝或低拷贝gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。RFLP标记的优缺点

优点：

1）共显性；

2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座；

缺点：

1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针；

2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。

2. RAPD 标记

RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。1990年提出。

基本原理: 单引物PCR标记；不同基因组DNA在随机引物Arbitary primer （8~10bp）结合位点以及2个结合位点之间的距离可能不同，导致扩增片段数目和长度不同，经电泳分离显示出来，反映基因组相应区域DNA的多态性。

步骤：退火温度36℃左右，其余同普通PCR。

RAPD 标记的优缺点

优点：

1）简单快速，模板用量少，无需同位素；

2）无需基因组序列信息，引物通用；

3）成本低。

缺点：

1）显性标记，不能鉴别杂合子与纯合子；

2）稳定性和重复性较差；受很多因素影响：退火延伸温度，模板浓度，Mg2+浓度，试剂污染，应舍重复

3）序列不同但长度相同的片段共迁移，使多态性检测受限制.只能分开片段长度不同的dna 片段，对于长度相同但碱基组成不同的就分不出来

3. AFLP标记

AFLP (Amplified fragment length polymorphism)：扩增片段长度多态性，1992 年提出，RFLP 与PCR相结合的产物。

基本原理: 基因组DNA限制酶切（1种为常见6碱基切点，另1种为4碱基稀有识别位点，常为EcoRI（6）/MseI（4）），酶切后DNA片段连接双链人工接头（14~18bp，核心顺序+限制酶识别序列，随机设计），以接头和相邻的限制酶位点作为引物结合位点，进行双引物PCR 扩增，产物用高分辨力测序胶分离。此多态性主要来自引物3`端选择性核苷酸的变化。AFLP关键技术：引物的设计与组合。

引物由三部分组成:

1) 5`端与人工接头互补;

2) 中间部分与限制酶识别位点互补;

3) 3`端为1~3个选择性核苷酸。

AFLP 图谱

常用2~3个选择性碱基，每个泳道50~100条带

AFLP标记的优缺点

优点：

1）兼具PCR的高效性与RFLP的准确性；

2）常扩增50~100条带，多态性高，信息量大；

3）通过设计不同接头就可得到不同的引物，无需基因组序列信息。

缺点:

1）步骤多，流程长，重复性不够好；

2）需放射性同位素或荧光素等标记引物，但目前已发展银染技术；

3）显性标记。

4. SSR标记

SSR（simple sequence repeat）：简单序列重复，也称微卫星(microsatelite) DNA，真核基因组中普遍存在，随机分布，主要位于非编码区；重复单元2~5 bp，串联重复10~60次，多态性主要来自串联重复次数的不同。

SSR标记的原理: 不同基因型某一特定位点的SSR长度不同, 但其侧翼序列往往是保守的单一序列，据此侧翼序列设计双引物，经PCR扩增即可得到长度不同的SSR片段，产物经PAGE 或高浓度琼脂糖凝胶电泳，即可显示不同基因型在此位点的多态性。

注：一般检测的是单一位点的复等位基因，农作物中多数SSR位点的复等位基因数多达十几甚至几十个，多态性高。

SSR侧翼序列的获得：

（作为设计引物的模板）

一般程序：

1）建立基因组DNA的质粒文库；

2）根据预得到的SSR类型设计并合成探针，如预获得(AT)n/(TA)n，则合成(AT)n探针；

3）用探针筛库，获得阳性克隆；

4）对阳性克隆DNA插入序列进行测序。

SSR标记的优缺点

优点：

1) 序列短，多数小于200bp，易扩增；

2) 有高度多态性，信息量大；

3) 共显性。

缺点：

须获得侧翼序列设计引物，步骤多、费用高；

引物具有物种特异性。

5. SNP标记

SNP (single nucleotide polymorphism)：单核苷酸多态性，指不同基因组DNA中某一特定位置上单个核苷酸的差异，包括单碱基的转换、颠换、插入和缺失等，而且其在群体中出现的频率大于1%（如低于1%，则视为点突变，不可能作为标记）。

SNP的分布与遗传效应

1）分布于编码区：即cSNP，功能性变异，可能会影响蛋白产物的氨基酸序列和功能。2）分布于非编码区：即调节区/基因周边SNPs，可能影响基因的表达水平。

SNP是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素，有些疾病和性状与SNP有关，如人镰刀型细胞贫血症。

SNP的检测方法：

有近百种，包括杂交法、熔解法、电泳法、酶学法、化学法、物理法、测序法（最直接）以及它们的组合方法，综合利用纳米材料技术、多重PCR技术、各种荧光探针设计技术和各种荧光标记技术等。

DNA芯片技术在高通量检测SNP方面显示出独特的优势，最理想、最具有发展潜力，但仍存在成本高、重复性不够好等问题。

SNP标记的优缺点

优点：

是覆盖全基因组、标记数量最大，多态性最高的标记，

缺点：

SNP技术主要建立在基因组测序基础之上，尚难在未测序生物上应用。

6. ISSR

ISSR：（inter-simple sequence repeat, ISSR）：区间-简单重复序列。以加锚SSR寡聚核苷酸作引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行扩增，而不是扩增SSR本身，反映SSR 区间多态性。