农作物种子转基因检测技术

实时荧光PCR示意图
实时荧光PCR原理
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
确定检测标准和参数 试样制备 DNA提取与质量检测 PCR体系配置与扩增 电泳检测 结果分析 结果报告
检测参数要有覆盖性（对现有的商业化品系进行系
统分析） 先筛查后定性。
外源元件 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 转基因玉米转化体 CBH-351 MS3 MS6 NK 603 Bt11 LY038 MON 80100 MON 802 MON 809 MON 832 MON 88017 MON 863 MON89034 DBT418 B16 Bt176 MON 810 676, 678, 680 59122 T14 T25 TC1507 GA 21 MIR604 3272 DAS-06275-8 P-CaMV35S + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + T-NOS + + + + + + + + + + + + + + + + BAR + + + + + + + + + PAT + + + + + + + + CP4EPSPS + + + + + + -
抗除草剂类：CP4 EPSPS、PAT/BAR 抗生素抗性：NPTII 多重试纸条：同时检测多种外源蛋白质

优点：快速、简便、准确、不容易污染。
缺点：仅适用外源蛋白质；检测靶标种类少；灵 敏度有限，非深加工产品；无相应国家标准；


应用：现场检测，样品复查、验证。
转基因检测方法--基因检测法
Nucleus
BT基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)晶体蛋白基因的简称。 对鳞翅目鞘翅目昆虫（比如小菜蛾）有很强 的杀伤作用。 转Bt基因作物，其中 以玉米、马铃薯和棉花 为主。在我国，转Bt基 因的抗虫棉花已得到了 商品化生产。
抗除草剂类的基因 抗草丁膦、双丙氨酰膦： PPT乙酰转移酶基因（bar） 膦丝菌素N-乙酰转移酶基因（PAT） 抗草甘膦： cp4-epsps基因 草甘膦氧化—还原酶基因 （ Gox）
核酸物质 （DNA）
转基因检测方法--基因检测法
转基因成分检测阶段和要求
判断样品中是否含有转基因成分（筛查）
高覆盖率、简便、快速、经济、样品高通量 判断样品中含有的转基因成分是什么（鉴定） 准确
判断样品中含有的转基因成分是否需要标识（定量） 精确
PCR检测法（普通PCR和实时荧光PCR法）
终止子(terminator T)是给予RNA聚合酶转录终
止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在构基
因群最后一个基因的后面有一个终止子。
NOS终止子、7S 3’终止子
内标准基因是指具有植物物种专一性且拷贝数恒 定、不显示等位基因变化的保守DNA序列。 转基因大豆：lectin（凝集素）基因 转基因玉米：invertase（转化酶）基因或zein （玉米醇溶蛋白）基因 转基因水稻：sps（蔗糖磷酸合酶）或 gos （一个水稻根部表达的基因）基因
基因芯片检测法
环介导等温扩增检测法
5’ 3’
3’ 5’
Mg++
Mg++
Mg++
普通PCR示意图
实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧
光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知
模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量 PCR 所使用的化学物质可分为两种：荧光探针和





抗除草剂的转基因植物（最早进入田间生产，目前栽培面积最 大）如孟山都的抗除草剂草甘膦大豆

抗虫转基因植物 如先正达的Bt176抗虫玉米


抗病转基因植物
（抗病毒，抗真菌，抗细菌）
植物发育调节基因工程 （控制果实成熟，雄性不育，改良植物 品质）

医药领域中的转基因植物（利用植物作为生物反应器，生产药 用蛋白、食用疫苗等）
转化事件 指在把外缘 DNA 导入植物细胞的过程中，特 定的外缘 DNA与受体 DNA在特定染色体、特定位 点结合的事件。
目的基因 DNA 载体 DNA 重组 DNA
内切酶
连接 酶
二、转基因作物发展
1983年 第一例转外源基因植物（烟草 ）获得成功。 1987年 第一例转基因植物(抗虫西红柿)田间试验在美国 进行。


一、转基因相关术语
二、转基因作物发展现状

三、转基因成分检测技术
染色体
细胞核
DNA超螺旋
细胞
DNA
基因：本质是一段有表达功能的DNA序列。
转基因生物（Genetically Modified Organisms GMO)，
就是利用DNA重组技术，将外源目的基因转移到受体生物中
去，使之产生定向的、稳定的改变，以满足人类的需要。

作物：11类，玉米、大豆 、油菜、棉花、甜菜、苜蓿、南瓜、木瓜、 甜辣椒、白杨、茄子。其中玉米、大豆和棉花种植面积排在前三位。 品种：147个，其中玉米最多，已批准上市的45个。 获得批准最多的转化体： 抗除草剂大豆事件GTS 40-3-2（26个国家＋欧盟28个成员国的52次 批准） 抗除草剂玉米事件NK603（25个国家＋欧盟28个成员国的52次批准） 抗虫玉米事件MON810（25个国家＋欧盟28个成员国的50次批准） 抗虫玉米Bt11（24个国家＋欧盟28个成员国的50次批准） 抗虫玉米TC1507（22个国家＋欧盟28个成员国的47次批准）
我国科学家独创的方法，将目的基因涂抹在柱头上， 或注射进子房内，使外源基因随受精作用进入卵细胞。
DNA重组过程
目的基因 DNA
内切酶
连接 酶
载体 DNA
重组 DNA
基因结构
基因
表达区域 启动子 终止子
启动子：启动子是基因的一个组成部分，控制 基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。
CaMV35S启动子、 FMV35S启动子

检测种子数（粒） 转基因种子含量（%） 95% 2995 99% 4603
0.1
0.5
1.0 2.0 5.0 10.0
598
299 149 59 29
919
459 228 90 44

干种子粉碎（细度为0.5mm以下） 幼苗液氮研磨 直接切种子胚（大粒种子，如玉米）
提取方法


常规方法（SDS法，CTAB法）： 优点DNA提取量大，质量好；缺点：过程繁琐，时间长，工 作量大，接触有毒有害试剂。 商业提取试剂盒：优点：质量好，快捷；缺点：费用高。 快提法（热碱法）：优点：快捷、费用低；缺点：质量不高， 保存时间短。适合幼苗、种子胚，用于多样品快速检测。
荧光染料。
实时荧光定量PCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且比
常规 PCR 相比，它具有特异性更强、自动化程度高、不使用溴 化乙锭、不污染环境等特点，目前已得到广泛应用。
SYBR荧光染料
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染 料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，双链越多， 嵌入的SYBR染料越多；而不掺入链中的SYBR染料分子不会 发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物 的增加完全同步。 用SYBR染料比较方便而且成本低，但在模板浓度较低时， 引物二聚体作用影响较大。目前主要采用的还是TaqMan荧 光探针。
检测元件
参数名称
通用元件 CaMV35s启动子、CaMV35s终止子、NOS终止子、NOS启动子、FMV35s启动子 目的基因 Bt、Bar、Barbase、Pat、NptII、Gus、EPSPS、GFP、PMI、HPT 玉米（24）：BT11、BT176、GA21、MON810、MON863、TC1507、NK603、 T25、CBH351、MIR604、59122、BT10、DAS-40278-9、MON87460、 MIR162、3272、MON89034、BVLA430101、IE09S034、双抗12-5 大豆(12)： A5547、A2704、MON89788、GTS40-3-2、MON87769、 MON87705、356043、305423、CV127、FG72、MON87701、MON87708 油菜(8)：GT73、MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、OXY235、T45、MON88302 转化体事件 棉花(4)：MON15985、MON88913、MON1445、LL25、GHB614、
《生物技术通报》 2013年01期

根据检测的目的，分离足够量的样品进行试验样品的制 备。 假设送检样品中转基因种子含量为V，应从送验样品中 分取适量种子作为试验样品，试验样品数量参照下面公 式进行: n = log [1-(P/100)]/log[1-(V/100)] n：试验样品种子数量，V：转基因种子含量，P：置 信率

抗环境胁迫转基因作物 （温度、水分、化学物）
1： 已经批准商业化
1997年 耐储存番茄
抗虫棉花 1999年 改变花色矮牵牛 抗病辣椒 2006年 抗病番木瓜
2： 发放安全证书
2009年 抗虫水稻 转植酸酶玉米
截止到2015年5月，农业系列标准共有171件，涉及转基 因成分检测，食用安全性检测，环境安全性检测和安全管理 4类。转基因成分检测标准88件，包括通用标准（如抽样， DNA提取）、筛查检测标准，基因特异性检测标准、转化 事件特异性检测标准。涉及作物8种。 截止到2015年5月，质检总局发布的标准全部是转基因成 分检测标准，共计59件，其中植物类47件，涉及作物12种。
它克服了天然物种生殖隔离的屏障，可以按照人们的意愿 使生物体的遗传性状发生改变，创造出自然界中原来并不存
在的新的生物功能和类型。
控制苹果 颜色的基因 基因工程技术 转入香蕉
苹果
香蕉
有苹果色的香蕉
•基因枪法
将基因（外衣）包在 “子弹”外，用强大的压 力使子弹穿过植物细胞， 同时脱下“外衣”
•花粉管通道法
水稻(5)：TT51、M12、 KMD1、科丰2号、G6H1
苜蓿(2)：J101、J163 番茄(1)：D2 其他转基因：H7甜菜等 内标准基因 水稻SPS、大豆Lectin、油菜HMGI/Y、棉花SadI、小麦Waxy、番茄LAT52、
表型检测法 蛋白检测法 基因检测法
表型测定是通过检测转基因作物某一特性（性状）的缺失 或存在，来判断样品是否为转基因产品。
1994年
1996年 1998年 2009年
美国第一例转基因食品-延熟番茄上市
转基因作物种植面积达到170万公顷 转基因作物的安全性在世界范围内引起争议 中国批准了抗虫转基因水稻和转植酸酶玉米
2006年 全球转基因农作物年种植面积达1亿公顷
2014年 全球转基因农作物年种植面积达1.815亿公顷
美国以7310万公 顷的种植面积(占全 球的40%)仍然遥遥 领先，其主要作物 的采用率为90%， 其中玉米采用率为 93%、大豆94%、 棉花96%。而巴西 种植面积的同比增 长最近5年保持第 一。
试纸条检测流程
批样(10吨) 送检样品(3kg)
检测样品(0.2g)
检测样品
试纸条检测
control
test
阳性结果
阴性结果
适合于田间、仓库现场检测

抗虫类：Cry1Ab/Ac、Cry2Ab、Cry1F、
Cry3A、Cry3Bb、Cry34Ab1、Vip3A、Cry9C、
Cry1C

幼苗喷洒试验
逆境发芽试验
利用抗原与抗体的特异性结合的免疫分析法，是检测外源基
因表达蛋白最常用的方法，主要分为酶联免疫分析(ELISA)
和侧向流动免疫试纸两种。
酶联免疫吸附法 (ELISA)
农业部1485号公告-14-2010 转基因植物及其产品成分检 测 抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范
质量检测：
玉米种子DNA快速提取过程
设置对照
在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性
对照和空白对照。
用该作物非转基因材料中提取的DNA作为阴性
对照；用含有检测对象的转基因作物DNA作为阳性
对照（外源基因拷贝数要一样），一般含量为0.1%；
用无菌重蒸水作为空白对照。

反应体系 反应体系参照标准要求进 行配置，可以根据试验条 件的不同做适当调整。试 验样品和各种对照的反应 体系要一起制备，每个反 应至少设来自百度文库个平行重复。