最新pcr单链构型多态性分析
如何用PCR法检测基因的多态性
如何用PCR法检测基因的多态性多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。
在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。
这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。
基因多态性的主要检测方法简述如下：1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，钠问亢兔扛銎蔚某ざ染筒煌此降南拗菩云纬ざ榷嗵裕贾孪拗破纬ざ确⑸谋涞拿盖形坏悖殖莆嗵晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。
现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。
2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。
相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。
在电泳时泳动的速度不同。
将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。
3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。
在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。
其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。
突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。
PCR-单链构型多态性分析
0.1%AgNO3 染色 染色10min
dH2O漂洗两次
2.5%碳酸钠 碳酸钠-0.03%甲醛显色 碳酸钠 甲醛显色 1%乙酸终止 乙酸终止 dH2O漂洗 漂洗
影响PCR-SSCP的因素 的因源自 影响1.DNA片段大小 片段大小 2.复制错误发生 复制错误发生 3.电泳条件 :（1）丙烯酰胺的浓度 电泳条件 （ ） （2）交联剂的浓度 ） （3）电泳的物理环境 ） （4）甘油浓度 ）
PCR-SSCP与RFLP比较 与 比较
无需特殊的限制性内切酶作用 可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便， 操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂 改变容易影响SSCP 电泳条件的 改变容易影响
PCR-SSCP 的应用
1.基因点突变的监测 基因点突变的监测 2.多态性检测 多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查 筛查
银染原理
根据核酸分子带有多个氨基和亚氨 一定条件下可以与银离子结合， 基，一定条件下可以与银离子结合， 在甲醛等还原剂的作用下， 在甲醛等还原剂的作用下，形成黑 或褐色的银沉淀条带。 或褐色的银沉淀条带。
银染过程
凝胶 10%乙酸、30%乙醇固定 乙酸、 乙醇固定10min 乙酸 乙醇固定
dH2O漂洗两次
PCRPCR-单链构型多态性分析
Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP
什么是PCR-SSCP？
PCR-SSCP是在完成靶 是在完成靶DNA的PCR扩增 是在完成靶 的 扩增 单链DNA多态性分析的一种新 多态性分析的一种新 之后进行单链 多态性分析 之后进行单链 方法。将单链的扩增DNA或组织基因组 方法。将单链的扩增DNA或组织基因组 DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳， 通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳， 根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱 根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱 基的改变。 基的改变。
单核苷酸多态性分析技术
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SNP表现形式
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SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以 外的非编码序列上。
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cSNPs、基因周边SNPs（pSNPs）以及基因间SNPs （iSNPs）
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)比较少， cSNP) 位于编码区内的SNP(coding SNP, cSNP 因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。 cSNP在遗传性疾病研究中具有重要意义，因此 cSNP的研究更受关注。
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Taqman 法
Minisequencing
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微测序，又称为
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单核苷酸引物延伸( single nucleotide primer extension , SnuPE ) ,SnuPE SnuPE) 引物指导的核苷酸合成(primer guided nucleotide ) incorpration incorpration) TDI ( template directed dye terminator incorpration ) incorpration)
• UGT2B7 • VDR • PGP/MDR1 • PGP/MDR1 • RFC • MTHFR • GSTP1
RFC 80 G→A (R27H)
A/A G/A A/A G/G G/G
Allele frequencies:
A = 43.7% G = 56.3%
MALDITof MALDI-Tof
SNPs检测方法分类
每种SNPs的检测方法都可将之看成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段 两部分组成。
SNPs检测方法的分类
一、区分SNPs 位点的方法 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法 二、检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3. DNA 芯片 4.质谱检测技术
PCR-单链构型多态性分析
银染原理
根据核酸分子带有多个氨基和亚氨 基，一定条件下可以与银离子结合， 在甲醛等还原剂的作用下，形成黑 或褐色的银沉淀条带。
银染过程
凝胶
10%乙酸、30%乙醇固定10min
dH2O漂洗两次
0.1%AgNO3 染色10min
dH2O漂洗两次
2.5%碳酸钠-0.03%甲醛显色 1%乙酸终止 dH2O漂洗
PCR-SSห้องสมุดไป่ตู้P 的应用
1.基因点突变的监测 2.多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查
2. 将提取的DNA在20l变性溶液（95% 甲酰胺、1mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝、 0.05%二甲苯青），95℃ 10分钟，冰浴 3分钟。
3. 将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶 板孔中，在含1xTBE的电泳液中，电泳。
4. 将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄 膜上，烘干后以放射自显影拍摄记录。 或银染色
SSCP原理
在SSCP凝胶中电泳时，单链DNA的泳 动速率主要取决于二级空间结构，因此 若DNA片段中碱基发生突变，将会引起 单链DNA二级空间结构的改变，使 SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带（即 SSCP 阳性）。
PCR-SSCP 操作步骤
1. 常规PCR扩增DNA片段或其他被标 DNA片段的提取。
影响PCR-SSCP的因素
1.DNA片段大小 2.复制错误发生 3.电泳条件 :（1）丙烯酰胺的浓度
（2）交联剂的浓度 （3）电泳的物理环境 （4）甘油浓度
PCR-SSCP与RFLP比较
无需特殊的限制性内切酶作用 可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂 电泳条件的 改变容易影响SSCP
PCR-单链构型多态性分析
生物化学及分子生物学(人卫第九版)-26基因诊断与基因治疗
基因诊断与基因治疗
作者 : 李存保 单位 : 内蒙古医科大学
目录
第一节 基因诊断
第二节 基因治疗
重点难点
掌握
基因诊断与基因治疗的概念
熟悉
基因诊断技术、基因治疗的基本策略和基本程序
了解
基因诊断和基因治疗在医学中的应用
第1节
基因诊断
一、基因诊断的概念与特点
（1） 基因诊断的概念：
是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而 对疾病作出诊断的方法。
（2）直接体内疗法
临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液 和尿液等。
三、基因诊断的基本技术
（一）核酸分子杂交技术
1. Southern 印迹法 其可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。 DNA印迹一般可以显示50 bp～20 kbp的DNA片段，片段大小的信息是该技术诊断基因缺 陷的重要依据。 2. Northern 印迹法 Northern印迹法（Northern blot）能够对组织或细胞的总RNA或mRNA进行定性 或定量分析，及基因表达分析。Northern印迹杂交对样品RNA纯度要求非常高，限制了 该技术在临床诊断中的应用。
是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人 正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因 的治疗方法。它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。
一、基因治疗的基本策略
（一）缺陷基因精确的原位修复
1.基因矫正 gene correction 致病基因的突变碱基进行纠正 2.基因置换 gene replacement 用正常基因通过重组原位替换致病基因 这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治 疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。
PCR-SSCP简介及应用
PCR –SSCP技术综述摘要：聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是基于PCR 的单链构象多态性分子标记技术。
PCR-SSCP作为检测基因突变的方法，自创立以来，经历了自身发展和完善的过程。
刚建立时是将同位素掺入PCR扩增物中，通过放射自显影来显示结果，这给该技术的推广造成一定的困难。
随着DNA银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化，操作更为简单，局限性较小，实验条件要求不高，适合一般临床实验室使用，具有简便、快速、灵敏的特点。
不但被用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还可用于动物育种，微生物，寄生虫研究的多个领域。
由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用。
文章介绍PCR-SSCP的原理和方法，优点与缺点，技术的优化和应用级展望。
关键词：PCR-SSCP；原理；方法；优缺点；展望Abstract：Polymerase chain reaction - single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) is a PCR-based single-strand conformation polymorphism molecular markers. PCR-SSCP as a method to detect gene mutations, since its inception, has experienced its own development and improvement process. When is the isotope incorporation newly created objects in the PCR amplification, by autoradiography to show results, which may cause some difficulty to the promotion of the technology. Silver staining DNA with PCR-SSCP method binding, especially as a direct method of staining with ethidium bromide so that the simplified method, the operation is simpler, less limitations, the experimental conditions do not ask for general clinical laboratory use, with simple, rapid, sensitive features. Not only is used for detection of gene deletions and point mutations and insertion of short sequences, but also for animal breeding, microbes, parasites research in many fields. As the outstanding advantages of SSCP, are extensively used in recent years. This paper introduces the principles and methods of PCR-SSCP, advantages and disadvantages, optimization, and application-level prospect technology.Key word：PCR-SSCP;Principles; method; advantages and disadvantages; outlook基因单核苷酸多态性(SNP)是指基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。
研究生实验PCR检测apoB基因多态性(1)
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（一）原理
PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核
苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖 的酶促合成反应，整个扩增过程分三步。
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变性：加热，模板DNA形成两条单链 退火：降温，模板单链DNA与引物配对
Mg2+有效浓度 如果扩增产物或效率不理想，要注意调整 Mg2+浓度
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精品课件
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（三） PCR反应条件
1.
PCR循环的温度和时间（变性、退火、延伸）
2.
PCR循环的次数和平台效应
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温度和时间
（1）变性温度：94-95℃
Templete：GC比例高、长度很长，则变性时间↑
（2）退火：温度越高，扩增特异性越好
（2）已有商品化的混合液，终浓度一般为20-200umol/L, 高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反 应物的产量。
注意：不稳定，保存时间长会失效
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5. 10×PCR反应buffer
(1) 250~500mmol/L KCl； (2) 100~500mmol/LTris-HAC (pH8.4)； (3) 15~20mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，
如：GGGTCGATTCCTACCCATGC
注意减少Primer间互补序列,导致2个Primer形成dimer ,
一般不要超过 3个互补bp
如：CCCATGC
ATGGAGTC
::::
::::
GGGTCTA
TCAGTAAGC
中原黄牛GHR基因5'端PCR-RFLP多态性分析
１ ． 基 因 组 Ｄ Ａ 的 提 取 及 检 测 ．１ ４ Ｎ
用 酚一 氯仿 方 法 提取 血 样 基 因组 Ｄ Ａ 在 紫 ％保存 备用 。 Ｎ 一０
收稿 日期 ：０ ０ ０ — ２ ２ １— ４ ０
基 金 项 目 ： 徽 省 “ 一 五 ” 技攻 关 项 目 （６ １ ０ ０ ， 安 十 科 ０ ０ ３ ４Ａ） 国家 科 技 支 撑 计 划 项 目（０ ８ Ａ Ｂ Ｂ ３ 资 助 。 ２０Ｂ Ｄ ２ ０ ） 作 者 简 介 ： 黎 鑫 （９ ３ ） 硕 士 研 究 生 ， 究 方 向 为 动 物 遗 传 及 分 子 张 １８ 一 ， 研 育种 。 通 讯 作者 ： 力 生 ， 教授 。 王 副
１ ． ４ 试 验 方 法
增大． 在增 加 经济效益 方 面 已发 挥 了 明显 作用 。
研究和 评估新 品系 的遗 传 多样 性 ． 于新 品系 的培 对 育具有重要 意义 本试 验 以 Ｇ Ｒ基因为候选 基 因 ． 用 Ｈ 利 ＰＲＲ Ｌ Ｃ — Ｆ Ｐ技 术研 究 中原 黄 牛乳 肉兼用 品 系后 代 群 体
有很 大实践 意义『】 １ Ｉ ２
以来 自安 徽 毫州 天达 集 团核 心 牛场 及周 边 散户 的 １６头 中原 西 门塔 尔 杂交 ２代黄 牛为 实验动物 。 ２ 所采 集
的实 验牛健康 状况 良好 ． 品系特征 明显 ， 系谱 清楚 ， 年龄 集 中在 ４月龄＋ ５ ， １ｄ 个体 间无 亲缘关 系 。 用颈静 脉采 利
Ｈ ｒｙ Ｗ ｅ ｂ ｒ 衡 ． 态 信 息 含 量 小 、 ０２ ９ ａｄ — ｉ ｅｇ平 ｎ 多 为 ．２ 。
关键 词 ： 中原 黄 牛 ： Ｒ基 因 ： ＣＲ Ｒ Ｌ ＧＨ Ｐ — ＦＰ
生 长激 素受 体 （ ＨＲ） 泌乳 刺 激素 受体 和 生 长激 Ｇ 是
一种新的细菌学检验与鉴定方法_PCR扩增16S_23SrRNA区间多态性分析
⼀种新的细菌学检验与鉴定⽅法_PCR扩增16S_23SrRNA区间多态性分析从表1⾄表7可见:所测“704”⽟⽶胚芽油中,⽔分及挥发物含量为0.1987%m/m,不超过规定标准0.2%m/m;杂质为0.04922%m/m,不超过规定标准0.05%m/m;酸价为0.535mgK O H/g油,不超过规定标准0.6m gK OH/g油;含皂量为0.0049%m/m,不超过规定标准0.005%m/m;含铅量为0.0982mg/kg,不超过0.1mg/kg;汞为0.0021mg/kg,不超过规定标准0.05mg/kg;铜为0.08mg/kg,不超过规定标准0.4mg/ kg;砷为0.03mg/kg,不超过规定标准0.1mg/kg的要求。
3 结论3.1 经过改良精炼后的“704”⽟⽶胚芽油,上述所测各项指标,基本符合国家及国外参考标准规定,说明该⼚精炼技术已过关。
3.2 ⽤“704”栽培优良⽟⽶品种提取的胚芽油质量⾼,⾷⽤性基本安全可靠。
3.3 因地制宜地扩⼤“704”⽟⽶品种的试种⾯积,以扩⼤⽟⽶胚芽油的⽣产,可使⽟⽶增值,为⼈们提供更多的保健⾷品⽣活⽤油。
参考⽂献1 邹中华⽟⽶及⽟⽶油综述陕西粮油科技1987;(2):43 1987;(4):452 佟屏亚⽟⽶的综合利⽤及其发展策略中国农学通报1985;(2):133 殷耀成国外油脂分析概述(上) 浙江粮油科技1988;(2): 38～444 许海清油脂酸价快速测定法湖南粮油科技1987;(4):42 5 陈煜,等⾷⽤植物油卫⽣检测技术质量调查分析粮油⾷品科技1985;(4):426 植物油⼚检化验编写组编植物油⼚检化验贵阳:贵州⼈民出版社1981:73—997 国家进出⼝商品检验局科学技术委员会编⾷品标准法典北京:中国轻⼯业出版社1993:422～4318 王叔淳编⾷品卫⽣检验技术⼿册北京:北京化学⼯业出版社1994:573综 述⼀种新的细菌学检验与鉴定⽅法——PCR扩增16S～23SrRNA区间多态性分析李君⽂综述 晁福寰审校军事医学科学院卫⽣学环境医学研究所(天津 300050)PCR技术在细菌等微⽣物检测与鉴定领域得到了长⾜的发展,有些技术已应⽤于临床检验和流⾏病学调查,并取得了⼀定的效益。
26SrDNA单链构象多态性分析在临床酵母菌菌种鉴定中的应用
Research Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 49(8):1011-1017;4August 2009ISSN 0001-6209;CN 11-1995 Q http: actamicrocn基金项目:国家自然科学基金面上项目(30770048)*通信作者。
Tel Fax:+86 10 64807406;E mail:baify@i m.ac.c n作者简介:李娟(1977-),女,山东菏泽人,助理研究员,博士,主要从事病原微生物分子流行病学研究。
E mail:lij uan enj oyment@收稿日期:2008 12 09;修回日期:2009 02 1726S rDNA 单链构象多态性分析在临床酵母菌菌种鉴定中的应用李娟1,2,白逢彦2*(1中国疾病控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206)(2中国科学院微生物研究所,真菌地衣系统学重点实验室,北京 100101)摘要: 目的 探讨酵母菌临床分离株26S rDNA D1 D2区序列种内相似性和种间差异性的快速检测方法,为临床酵母菌菌种鉴定方法的改进奠定基础。
调查北京地区临床酵母菌的种群多样性,为国内酵母菌感染的流行病学研究提供新的基础数据。
方法 用5种常见临床酵母菌种的模式和权威菌株作为标准参考菌株,从北京四家综合性医院收集临床酵母菌260余株,PCR 扩增其26S rDNA D1 D2区,对扩增产物进行单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)分析和序列测定分析。
结果 常见病原酵母菌26S rDNA D1 D2区的SSCP 图谱具有明显的种间差异性和种内相似性,可以通过该方法对菌株进行初步的菌种鉴定。
D1 D2 SSC P 和序列分析相结合,对260余株临床酵母菌进行了菌种鉴定,共鉴定有10个属20个种,优势属为念珠菌属(Candida ),优势种及其所占比例分别是:C .albicans (57 7%),C .parapsilosis (10 0%),C .tropicalis (9 2%),C .glabrata (6 7%)和C .krusei (5 8%),并发现过去从未或很少报道致病的酵母菌种,愈来愈多地出现在临床分离菌株中。
分子生物学技术在植物病毒检测中的应用
※农业科学农业与技术2021,%l.41,No.1123分子生物学技术在植物病毒检测中的应用董芳娟魏增云薄一览（忻州师范学院,山西忻州034000）摘要：为了实现植物病毒的预防和控制，需要建立起快速、高灵敏度、高通量的检测技术，对植物病毒进行高精度的检测。
随着分子生物学技术的发展，其在植物病毒检测领域获得了重要应用，当前植物病毒检测领域常用的分子生物学技术包括核酸杂交技术、反转录PCR技术、荧光定量PCR技术和DNA微阵列技术，本文对这几种技术及其在植物病毒检测技术中的应用进行探讨。
关键词：分子生物学；植物病毒；检测；应用中图分类号：S-3文献标识码：A植物病毒在全球范围内的危害越来越大，植物病毒能够导致农作物和经济作物发病，造成产量下降甚至绝收的情况出现，给农业带来极大的损失。
近年来，发现的植物病毒种类越来越多，当前发现的植物病毒分为18个科，共76个属，总数量超过1000种。
随着我国与国际贸易规模不断扩大，境外植物病毒通过口岸的输出风险不断扩大，因此加强植物病毒的检测效率和准确性就显得更为重要。
为了防止植物病毒的危害，需要做好病毒预防和综合防治工作，而建立快速、高灵敏度、高通量的病毒检测体系是做好上述工作的前提。
植物病毒的检测技术经历了多年发展，起初常用的检测技术包括生物学鉴定和电子显微镜技术，随后酶联免疫吸附反应成为植物病毒常用的手段。
随着分子生物学的发展，在植物病毒检测领域，分子生物学方法已经获得了广泛的应用，包括核酸杂交技术、反转录PCR技术、荧光定量PCR技术和DNA微阵列技术等，本文对这几种技术及其在植物病毒检测领域的应用进行介绍。
1核酸杂交技术根据碱基互补配对原理，互补的核酸单链可以相互结合，核酸杂交技术就是利用了这一原理，通过对一段病毒特异的核酸序列进行标记，制成探针，将其和待测样品的核酸进行杂交，若发生杂交则表示病毒存在。
这种方法可以应用于DNA、RNA病毒及类病毒的检测，该方法具有较高的灵敏度，同时还具有特DOI：10.19754/j.nyyjs.20210615007异性强、通量高等方面的优点。
《2024年T4DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测》范文
《T4 DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测》篇一一、引言单碱基突变是DNA序列中的单个核苷酸替换，常为人类遗传学研究的重要关注点，且在许多遗传疾病及基因变异分析中发挥着关键作用。
对于这类突变的精确检测是科研及医学诊断的关键。
传统的检测方法通常需要繁琐的步骤和长时间的验证，效率较低。
因此，发展快速、高效且可靠的检测技术是当务之急。
本文提出了一种T4 DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测方法，并对其进行了深入探讨。
二、T4 DNA连接酶简介T4 DNA连接酶是一种生物催化剂，能够催化DNA链之间的磷酸二酯键的形成，从而修复DNA链的断裂或进行DNA的重组。
在PCR（聚合酶链式反应）中，T4 DNA连接酶可协助构建PCR 产物，对于单碱基突变的检测具有重要的辅助作用。
三、T4 DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测方法本方法通过利用T4 DNA连接酶的高效特性，实现了单碱基突变的快速准确检测。
首先，我们通过PCR技术对DNA样本进行扩增，得到待检测的DNA片段。
然后，利用T4 DNA连接酶的特性，将扩增得到的DNA片段与已知的突变序列进行连接反应。
通过这一步骤，我们可以将单碱基突变的位置和类型进行标记。
最后，通过特定的检测手段（如测序或荧光探针法）对标记的突变进行验证和确认。
四、实验过程与结果分析我们在实验中选取了若干已知单碱基突变的DNA样本进行检测。
首先，我们通过PCR技术扩增了待检测的DNA片段。
然后，利用T4 DNA连接酶将扩增得到的DNA片段与已知的突变序列进行连接反应。
通过电泳实验，我们发现经过T4 DNA连接酶处理的DNA片段在电泳过程中呈现出明显的突变特征。
进一步通过测序和荧光探针法进行验证，我们发现该方法可以准确检测出单碱基突变的位置和类型。
五、讨论与展望T4 DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测方法具有高效、快速和准确的特点，为单碱基突变的检测提供了新的手段。
通过此方法，我们可以实现对单碱基突变的快速识别和定位，为遗传学研究和医学诊断提供了有力的技术支持。
单链构象多态性
利用PCR从提取出的DNA中扩增16S rRNA基因。
利用λ-外切核酸酶消化掉一条链（其中一个PCR引物被磷酸化，这条链将被去除）。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
应用-strand conformation polymorphism, SSCP)是一种分离核酸的技术，可以分离相同长度但序列不同的核酸（性质类似于DGGE和TGGE，但方法不同）。
原理
单链构象多态性（Single-strand conformation polymorphism，SSCP)分析可以检测DNA在低温条件下，单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象，它影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测，然后用DNA自动测序进行分析。用PCR-SSCP 技术可以进行序列差异的测定，而敏感度会随着片段长度的增加而降低。但是只要条带被凝胶电泳分离开就可以进行系统发育的研究。在Schmalenberger 和Tebbe[10]的研究中，测序技术表明一个单链也许包括多种序列，电泳条件也会因此影响基因结构的确定进而影响生物多样性的研究。
PCR技术在突变基因检测中的应用
PCR技术在突变基因检测中的应用基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础，结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因分析途径，并取得了令人瞩目的成果.基因突变是癌基因激活，抗癌基因失活及遗传病发生的根本原因，从广义的角度来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是它仍所涉及的范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中期的染色体而检出.亦可在间期用标记探针检出，点突变通常的涉及的范围较少，它是肿癌和遗传病发生的主要分子改变，因此，它是基因分析的主要研究内容.不同类型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括：应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。
PCR在突变基因检测时的应用利用核酸探针及Southern印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制难以满足这际工作的需要，自从PCR技术问世以来，建立于PCR技术基础上的突变基因检测技术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得极微量的组织亦可经PCR 扩增而进行中种检测，加上PCR技术与探针杂交技术，RFLP技术及PCR直接测序的结合，改换方法得以迅速发展和推广，大大的促进了遗传病及肿瘤有关的基因的研究进展.一、点突变的PCR直接检出(一)用PCR直接检测缺失:当基因内缺失时，可用已知的该基因DNA序列在缺失片段的两侧设计一对引物，然后进行PCR，对其产物行琼糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外检测仪下检测有无特异性的扩增产物，即可非常容易的判断待检称本中有无DNA片段的缺失.1.一对引物PCR检测缺失如果一个基因的DNA序列已经清楚，其缺失部位亦较为固定，即可根据缺失发生区域的DNA序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行PCR，然后琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色，短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段，该方法是检测基因片段缺失最为快速的方法，在实际应用中，为了避光因某些原因引起的扩增失败而导致假阴性结果的出现，常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因引物，同时加以扩增，以确定无特异性扩增带并非因反应体系的原因的引起.如在应用PCR技术进行X地贫Bartα基因胎儿水肿综合征义基因缺失检测时，常用一对引物扩增缺失区域，同时同一对β基因引物扩增β基因的一个片段，然后电泳检测.若同时即有α和β基因的特异性扩增产物，则说明α基因的扩增产物则说明模板DNA中有α 基因的缺失，为Bart胎儿水肿综合征.2.多对引物的多重PCR检测缺失：对于某些遗传病的致病基因来说，其缺失具有明显的异质性，即在不同患者其缺失片段有所不同，因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出，在这种情况下，我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域，即用同一PCR 体系扩增多个外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如，则可判定为该片段的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行的检测途径，目前已用于多种遗传病基因缺的检测.如在DMD/BMD缺失型突变的检测中，用23对引物分为三组进行多重PCR可改98%的缺失得以检出，另外还有人用9对物进行两组多重PCR，大约可检出DMD/BMD92%的缺失型突变.3.用PCR技术进行杂合性丢失的检测：有报道，PCR技术尚可用于检测杂合性丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量技术进行检测.(二)单个碱量置换的PCR直接检出1.直接检测限制性内切酶切点的变化-PCR产物酶解分析PCR产物的酶解分析，主要用于检测可引起酶切位点改变--包括所增加的酶切位点及原有的酶切点消失的单碱是量置换性点突变.当某一点突变引起DNA片段中酶切位点发生改变时，则可用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的DNA片段，然后用相应的内切酶进行处理，电泳检测，与正常的无改变的段进行对片分析即可确定有无酶切位点的改变.比如状细胞贫血的发生即是由一酶切位点的改变的改，正常情况下靶DNA 的扩增产物为294bp，经OxaNI消化后产生191bp和103bp二个片段，但镰状细胞贫血的突变使该切点消失，OxaNI消化后仍为294bp的片段，而杂合子则是有294、191和103 三个片段。
最新SNP检测技术
SNPs高通量的检测方法
另一大类检测方法是近些年来发展起来的, 高通 量、 自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用 的有:
1 . DNA测序法; 2 . DNA芯片检测; 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 4 . 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法等等
DNA测序法
优势
（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一——分子量，不涉及荧 光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本 身出错的概率非常低；
（2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都 能被检测出来；
（3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔； （4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器； （5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应； （6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左
在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。
特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突 变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体 位置。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温 度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开 的电泳技术。
电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分 子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到 达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始 分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电 场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。 由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其 变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条 带。
PCR概述
PCR概述摘要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。
自该技术建立以来，得到了快速发展，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。
鉴于PCR技术的广泛使用，故本文对其原理，操作过程，注意事项等做了简要概述。
关键词：PCR 引物反应体系一PCR的发明PCR技术又称无细胞克隆法，是美国cetus公司人类遗传学研究室科学家K.B.Mullis在1985年发明的一种快速的特定DNA片段体外扩增法。
Mullis等在在建立PCR方法初期，仅采用非常简单的三种温度的水浴实验，应用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段催化引物的延伸反应。
由于该聚合酶不耐热，在1986年Erlich分离并纯化了使用于PCR的TaqDNA热稳定聚合酶，该酶能够在较高的温度下催化DNA合成反应。
1988年Saiki也开始用Taq酶进行PCR，随着第一台PCR热循环仪的推出，使该技术的自动化成为现实。
二PCR技术基本原理PCR是模拟体内DNA复制过程在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。
其特异性由人工合成一对寡核苷酸序列所决定，因此在微量离心管中，除加入待扩增DNA片段两条链两端已知序列分别互补的两个引物外，还需加入适量的缓冲液，微量的DNA模板，四种脱氧核糖核苷酸溶液，耐热的TapDNA聚合酶，Mg2+等。
反应时首先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至中温，在TapDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿分子方向延伸形成新的DNA片段，该片段又可作下一反应的模板，如此反复改变温度，DNA片段的数目可以呈2的指数增加。
从而，使DNA片段的数目快速扩增。
分子生物学技术的分类
分子生物学技术的分类目前，常用的分子生物学技术有如下几种：PCR-单链构象多态性分析(PCR-singlestrandconformationanalysis,PCR-SSCP)是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。
PCR-SSCP技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变,通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。
样品经PCR扩增后，其产物经变性后可以产生2条单链，如果存在基因突变，哪怕是一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR-SSCP分析的主要优点是简易且敏感性较高。
但是该技术不能确定突变的部位和性质。
PCR-SSCP突变检测敏感性随PCR产物长度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。
有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE电泳就可能无法检出，在PCR 产物或待测DNA小于200bp时，PCR-SSCP分析能够检测出70%~95%的突变。
如果以毛细管电泳代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。
Wallace1997年提出将PCR-SSCP和异源DNA双链分析（heteroduplexanalysis,HA)相结合，称之为SSCP/HA，部分PCR产物经变性进行SSCP分析以了解是否具有突变，其余PCR产物直接用于电泳，以检出含有突变的异源DNA双链，电泳凝胶经银染，单链DNA所形成的带为橘黄或棕色，而双链DNA则表现为灰黑色。
该综合手段可以单链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变，是一种经济、迅速的突变检测手段，但无法提供突变位置的信息。
PCR-SSCP有许多改进技术，如RNA单链构象多态性法（PCR-rSSCP）、双脱氧测序单链片段构象多态分析（PCR-ddF）、限制酶指纹技术(PCR-REF)等。
PCR-rSSCP法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理，在PCR引物上加上某类启动子，通过转录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴别。
《2024年T4DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测》范文
《T4 DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测》篇一一、引言在分子生物学和遗传学研究中，单碱基突变（Single-base Mutation）的检测是一个关键的技术手段。
由于这些微小的变化常常与许多遗传疾病和癌症的发生相关联，因此对单碱基突变的精确检测具有重大的科学意义和实际应用价值。
本文将探讨T4 DNA连接酶辅助的PCR（多聚酶链式反应）技术在单碱基突变检测中的应用。
二、T4 DNA连接酶与PCR技术概述1. T4 DNA连接酶：T4 DNA连接酶是一种广泛使用的生物催化剂，能够在特定的条件下将DNA链进行互补性结合，生成完整的双链DNA分子。
它被广泛应用于DNA克隆、测序、基因修饰等分子生物学实验中。
2. PCR技术：PCR（多聚酶链式反应）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
通过PCR技术，可以实现对DNA 的快速复制和大量扩增。
三、T4 DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测原理在单碱基突变检测中，T4 DNA连接酶与PCR技术相结合，可以实现对突变位点的精确检测。
具体原理如下：首先，通过PCR技术对包含突变位点的DNA片段进行扩增。
然后，利用T4 DNA连接酶的特性，将扩增后的DNA片段与已知序列的DNA片段进行互补性结合。
在结合过程中，如果存在单碱基突变，则会导致连接反应的效率降低或无法进行。
通过检测这一过程的结果，可以判断是否存在单碱基突变及其位置。
四、实验方法与步骤1. 提取待测DNA样本并进行纯化处理。
2. 设计特异性引物，以包含突变位点的DNA片段为模板进行PCR扩增。
3. 将扩增后的DNA片段与已知序列的DNA片段进行混合，并加入T4 DNA连接酶。
4. 进行连接反应，观察反应结果。
若连接效率降低或无法进行，则说明存在单碱基突变。
5. 对结果进行数据分析与解读，确定突变类型及位置。
五、实验结果与讨论通过T4 DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测方法，我们可以精确地检测出待测DNA样本中的单碱基突变类型及位置。