PCR-单链构型多态性分析

0.1%AgNO3 染色 染色10min
dH2O漂洗两次
2.5%碳酸钠 碳酸钠-0.03%甲醛显色 碳酸钠 甲醛显色 1%乙酸终止 乙酸终止 dH2O漂洗 漂洗
影响PCR-SSCP的因素 的因源自 影响1.DNA片段大小 片段大小 2.复制错误发生 复制错误发生 3.电泳条件 :（1）丙烯酰胺的浓度 电泳条件 （ ） （2）交联剂的浓度 ） （3）电泳的物理环境 ） （4）甘油浓度 ）
PCR-SSCP与RFLP比较 与 比较
无需特殊的限制性内切酶作用 可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便， 操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂 改变容易影响SSCP 电泳条件的 改变容易影响
PCR-SSCP 的应用
1.基因点突变的监测 基因点突变的监测 2.多态性检测 多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查 筛查
银染原理
根据核酸分子带有多个氨基和亚氨 一定条件下可以与银离子结合， 基，一定条件下可以与银离子结合， 在甲醛等还原剂的作用下， 在甲醛等还原剂的作用下，形成黑 或褐色的银沉淀条带。 或褐色的银沉淀条带。
银染过程
凝胶 10%乙酸、30%乙醇固定 乙酸、 乙醇固定10min 乙酸 乙醇固定
dH2O漂洗两次
PCRPCR-单链构型多态性分析
Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP
什么是PCR-SSCP？
PCR-SSCP是在完成靶 是在完成靶DNA的PCR扩增 是在完成靶 的 扩增 单链DNA多态性分析的一种新 多态性分析的一种新 之后进行单链 多态性分析 之后进行单链 方法。将单链的扩增DNA或组织基因组 方法。将单链的扩增DNA或组织基因组 DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳， 通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳， 根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱 根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱 基的改变。 基的改变。
SSCP原理 原理
凝胶中电泳时， 在SSCP凝胶中电泳时，单链 凝胶中电泳时 单链DNA的泳 的泳 动速率主要取决于二级空间结构， 动速率主要取决于二级空间结构，因此 片段中碱基发生突变， 若DNA片段中碱基发生突变，将会引起 片段中碱基发生突变 单链DNA二级空间结构的改变，使 二级空间结构的改变， 单链 二级空间结构的改变 SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带（即 凝胶上出现异常移动的电泳带（ 凝胶上出现异常移动的电泳带 SSCP 阳性）。 阳性）。
PCR-SSCP 操作步骤
1. 常规 常规PCR扩增 扩增DNA片段或其他被标 扩增 片段或其他被标 DNA片段的提取。 片段的提取。 片段的提取 2. 将提取的 将提取的DNA在20µl变性溶液（95% 变性溶液（ 在 µ 变性溶液 甲酰胺、 溴酚蓝、 甲酰胺、1mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝、 溴酚蓝 0.05%二甲苯青）， ℃ 10分钟，冰浴 二甲苯青）， 分钟， 二甲苯青），95℃ 分钟 3分钟。 分钟。 分钟 3. 将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶 板孔中，在含1xTBE的电泳液中，电泳。 板孔中，在含 的电泳液中，电泳。 的电泳液中 4. 将凝胶中 将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄 片段转移到硝酸纤维薄 膜上，烘干后以放射自显影拍摄记录。 膜上，烘干后以放射自显影拍摄记录。 或银染色