HUVEC 分离培养

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HUVEC原代分离

HUVEC 原代分离准备工作：1，10×D－Hanks 500ml（A+B）A：450ml：KCl 2g 湿灭KH2PO4 0.3gNaCl 40gNaHCO3 1.75gNa2HPO4.12H2O 0.67gB：50ml：Glycose 5g 抽滤灭菌2，4－5瓶ddiH2O,450ml/瓶3，1×D－Hanks 500ml 4-5瓶450ml ddiH2O45ml 10×D－Hanks5ml 10×Glycose500ul 1：1000双抗分装部分至一个广口瓶中（用于贮存脐带），500ml瓶子盛300ml左右，100ml瓶子盛60ml 左右，4度放置4，另准备小锥形瓶3－4个，大烧杯1个，泡酸，湿灭准备大培养皿，注射器、离心管、六孔板/小培养瓶，培养基5，胶原酶（0.1%）分离实验：1，将脐带置于盛有D－Hanks的广口瓶中（4度保存）；2，预热胶原酶和1瓶D－Hanks（用于消化）；3，准备无菌台，将大烧杯（封口），锥形瓶，剪刀镊子，三个大培养皿，以及废液缸等置于超净台中，紫外灭菌30min；4，将脐带分成20cm长的两段分别分离；5，倒适量D－Hanks至大培养皿中，将脐带洗净，换2－3皿；6，剪开脐带一端，辨认动、静脉，动脉两根，壁厚且略硬，静脉一根，内腔较大。

取一根粗针头插入到静脉中，用止血钳夹住，固定脐带与针头，用针筒向静脉中注入D－Hanks，观察是否通畅（应有血液从另一端流出），然后再用D－Hanks继续冲洗至流出液无色（约70－80ml）；7，用空气将脐带静脉内残留的D－Hanks排净，加入数ml预热的胶原酶平衡一下静脉腔中的液体，用另一把止血钳夹住脐带底端，注入胶原酶，直至液体溢出，再用第三把止血钳在针头下方一点的位置夹住脐带，使其中的胶原酶不会回流出来。

（注意止血钳方向尽量一致，易于弯曲后放入烧杯中）；8，向大烧杯中注入200ml左右D－Hanks（预热），将脐带连同止血钳全部放入溶液中，盖上大培养皿盖，37度，15min;9，取锥形瓶，注入15ml左右的DMEM＋10％FBS＋双抗培养基；10，15min消化结束后取出脐带，将底端插入到锥形瓶内（但不能触及液面），松开下部止血钳，再松开上部封口用的止血钳，留有针头和固定用止血钳；11，用D－Hanks，继续冲洗脐带静脉，约30ml，最后用空气将残余液体挤出，弃去脐带；‘12，将锥形瓶内细胞悬液分装到离心管中离心，1200rpm 5min;13，DMEM＋10%FBS＋双抗培养基洗一遍后用M200＋2％LSGS＋双抗重悬后种板（六孔板），显微观察，成片的团块细胞是内皮细胞，而游离的单个细胞大多是血细胞（注意，不同根脐带来源的细胞应分开处理）；14，培养约16hr后用DMEM＋10％FBS＋双抗培养基冲洗已贴壁生长的HUVEC，可以洗去游离的血细胞；15，待孔内细胞长满后消化传代至大瓶培养，标记传代；16，细胞鉴定，用因子VIII抗体进行细胞免疫检测，计算阳性率（种板密度高一些，以IgG为阳性对照）。

huvec小管生成实验方法

huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验是一种常用的细胞实验方法，旨在研究人体血管内皮细胞（HUVEC）在体外形成管状结构的能力。

本文将介绍HUVEC小管生成实验的整体流程和关键步骤。

一、实验前准备在进行HUVEC小管生成实验之前，需要准备以下实验材料和设备：1. HUVEC细胞系：HUVEC细胞系是由人体血管内皮细胞培养而成的细胞株，可通过购买或实验室培养获得。

2. 培养基：HUVEC细胞的培养基通常为含有生长因子和营养物质的培养基，如EGM-2培养基。

3. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。

4. 细胞培养条件：实验室内需要提供恒温恒湿的培养箱，并保持细胞培养条件稳定。

二、实验步骤1. HUVEC细胞的处理将培养好的HUVEC细胞从培养瓶中取出，用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基中的残留物。

然后加入胰酶等胰蛋白酶类物质，使细胞与培养瓶底分离，放置一段时间，使细胞形成单细胞悬浮液。

2. 细胞计数和制备细胞悬液用显微镜和细胞计数板对HUVEC细胞进行计数，以确定细胞的浓度。

根据所需实验的细胞密度，将细胞悬液稀释至适当浓度。

3. 细胞培养和形成小管将稀释后的HUVEC细胞悬液均匀地加入预先涂覆有基质（如Matrigel）的培养皿中，使细胞悬液均匀分布。

然后将培养皿置于培养箱中，保持适宜的温度和湿度进行培养。

在一定时间后，通过显微镜观察细胞是否形成管状结构。

4. 小管形成的评估使用显微镜观察和拍摄HUVEC细胞形成的小管结构，并记录相关数据。

可以通过图像处理软件对小管网络的形态参数进行分析，如长度、分支数等。

5. 对实验结果的统计分析根据实验数据，使用统计学方法（如t检验、方差分析等）对不同处理组的小管生成能力进行比较和分析，以获得可靠的实验结果。

三、实验注意事项1. HUVEC细胞的培养条件和培养基的配方需要根据实验目的和相关文献进行优化选择。

2. 在实验过程中应注意细胞的无菌操作，避免细胞受到污染。

人脐静脉血管内皮细胞HUVEC

第三：铺板加样方法错误。
• 6孔、12孔、24孔、48孔与96孔的细胞接种铺板过程中，你的加样方式是哪种？你觉得加样方式对后期的接种均匀度影响大吗？例如你是否有过垂直加入96孔板的经历？是不是有的孔就比较均匀，而有的孔就聚集在了一起？六孔板怎么摇晃也不均匀？其实也许你离铺好板就差一种适合你的方法。
• 2、不是所有细胞消化后都会变成圆形
• 有些细胞(比如U87，U251)消化好了也不会变成圆形，只是呈半沙状。
• 3、有些细胞即使变圆，也有脱落的细胞，但还是没消化好 • 比如7860，要等到大部分细胞脱落培养皿底部才可以停
止消化，否则很难吹打下来，这种情况一般发生于难以消化的细胞。
• 4、对于一些特殊的细胞需要消化过一点 • 有些细胞吹成单个细胞反而对细胞的状态会好一点，一
6孔板、12孔板或24孔板
• 为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象。通常每孔首先滴加少量培基，轻轻晃动浸润整个孔底以保证板子的孔底都是湿润的，这样加液后细胞悬液会平铺在整个孔底，可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象，细胞分散会较均匀。注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下（5-10分钟）。镜下观察细胞均匀度，如不均匀可采用以下8字法、十字法及震荡法等方法进行细胞均匀度处理
• HUVEC细胞培养难度较高，建议使用内皮细胞专用培养基，选用优质胎牛血清。细胞推荐传代比例为1:2-1:3，胰酶消化室温1-2分钟，传代周期通常为3-4天。需要注意的是，如 HUVEC出现聚团生长，可能由于培养板亲水性差或者血清中促贴壁因子不足，可考虑用人纤维粘连蛋白包被培养板，能有效预防细胞聚团。
第二：细胞吹打次数不够，细胞悬
液密度不均匀。

huvec小管生成实验方法

huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验方法引言：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的体外模型系统，用于研究血管生成和血管内皮细胞功能。

HUVEC小管生成实验是一种常见的方法，用于评估血管形成的能力和细胞迁移的能力。

本文将介绍一种常用的HUVEC小管生成实验方法及其步骤。

材料与试剂：1. HUVEC细胞系：通过细胞培养技术获得。

2. 培养基：使用适合HUVEC细胞培养的培养基，如DMEM/F12。

3. 培养皿：使用96孔板或24孔板。

4. 载玻片：用于观察和分析小管生成。

5. Matrigel：一种基质蛋白，用于模拟细胞外基质环境。

实验步骤：1. HUVEC细胞的培养a. 将HUVEC细胞解冻并在培养基中孵育。

b. 细胞密度达到80-90%时，用PBS洗涤细胞。

c. 使用细胞消化酶（如胰酶）消化细胞。

d. 将细胞重新悬浮在培养基中，并计数细胞数目。

2. Matrigel涂层a. 在载玻片上滴加2-3滴Matrigel。

b. 使用移液器均匀涂覆整个载玻片表面。

c. 在37摄氏度下孵育30分钟至凝胶化。

3. 细胞接种a. 将预定细胞数目的HUVEC细胞悬浮在培养基中。

b. 将细胞悬浮液加入预先涂有Matrigel的孔板孔中。

c. 将培养皿放置在37摄氏度的细胞培养箱中，孵育24-48小时。

4. 观察和图像获取a. 使用显微镜观察HUVEC细胞在Matrigel上的小管生成。

b. 使用图像采集系统捕获并保存小管生成的图像。

5. 分析小管生成a. 使用图像处理软件对图像进行分析，包括测量小管长度、分支点数目等。

b. 统计和比较不同处理组的小管生成结果。

结果与讨论：通过HUVEC小管生成实验，可以评估细胞的血管生成能力。

实验结果显示，HUVEC细胞在Matrigel上能够形成分支的管状结构，模拟血管形成的过程。

小管长度和分支点数目可以作为评估血管生成能力的指标。

此外，通过比较不同处理组的结果，可以进一步研究各种因素对血管生成的影响。

HUVEC培养步骤

HUVEC原代培养方案1 实验材料1.1实验器材广口瓶（250ml）1个，注射器（30ml,20ml各2个），灌胃针头3个，止血钳3把，离心管（10ml）4根，铝饭盒1个，烧杯4个，橡胶塞4个，细胞培养箱，莱卡倒置显微镜。

1.2实验试剂I型胶原酶（Gibco 批号：1344183），PBS 自制，M199（Sigma lot No 083K83581），胎牛血清（Gibco）2 实验方法1）从无菌的广口瓶中取出新生脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉，在脐静脉的一端插入带钝头的灌胃针，用止血钳固定。

2）30ml注射器吸取温PBS后接灌胃针头，反复冲洗至流出的液体无色。

3）冲洗干净后，挤压去掉脐静脉内的PBS，另一端插入灌胃针头并用止血钳固定。

4）向脐静脉内注入0.1%的I型胶原酶，使之充盈，用橡胶塞封闭两端的灌胃针头，再将脐带放入37度孵箱中温育适当时间并不时摇动以促进消化。

5）无菌条件下取出脐带，取出橡胶塞，将含有内皮细胞的胶原酶液注入10ml的锥形离心管中。

6）用止血钳轻轻挤压脐静脉管壁后，再用20ml注射器吸取PBS冲洗，流出液一并收集于10ml的离心管中。

7）1200RPM离心10分钟，弃上清，加入完全培养基，充分混合制成细胞悬液。

3 注意事项1）实验前准备充分，取脐带时一定要注意无菌。

2）实验时不要说话，注意无菌操作，并且要规范。

3）把握好胶原酶消化时间，不同批次胶原酶活性不一样，消化能力不一样，所以换酶时需要重新掌握好消化时间。

试剂配制：1）I型胶原酶溶液称取I型胶原酶适量，用PBS配制成浓度为0.1%的溶液，过滤后分装，-20℃保存，临用时融化并预热。

2）M199培养液M199 9.8g 青霉素 60mg链霉素 100mg 碳酸氢钠 2.2g肝素 50mg 谷氨酰胺 293.2mg共配成1000ml 过滤后放冰箱备用。

HUVEC培养过程

HUVEC培养过程（Human Umbilical V ein Endothelial Cells）1.细胞名称：人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells）2.购买公司：Cascade Biologics （Invitrogen公司），Catalog Number: C-023-5C；3.试剂及培养液配制注：此处所用TTrypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution为培养HUVEC细胞用专有的消化、中和液，切勿用其他代替。

M200+LSGS：4.培养过程（简略）HUVEC为原代细胞，除复苏、冻存过程中与常规细胞系如293T等贴壁细胞雷同外，需主要注意的是培养液放置温度、Trypsin消化细胞过程。

1）培养液放置温度：细胞代理销售公司技术推荐在使用前30min室温（25-27℃）中放置配制好的培养液，用脸贴培养瓶而感觉到不冷（即接近人体温）即可使用。

Trypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution可同样处置。

2）Trypsin消化细胞过程：加入4mL Trypsin/EDTA solution/ 25cm2 flask后晃动3次，吸弃3mL Trypsin/EDTA，室温中作用1-3mins，显微镜下观察细胞变圆、脱离培养皿即可加入3mL Trypsin Neutralizer solution进行终止作用。

3）转移细胞至15mL离心管中，1000rpm 离心5mins，弃上清，加入新鲜的培养液转移至新的培养皿/瓶。

4）复苏、冻存雷同其他细胞操作，细胞复苏、传代后不可多次传代，一次复苏的细胞尽量满足连续性试验需要。

5）可参考Cascade Biologics公司的操作。

原代HUVECs分离培养关键影响因素分析

种方法容易混杂其他血管壁细胞，已逐渐被酶消化法替代．本文在诸多实验研究基础上建立起一种改良
的原代ＨＵＥｓＶＣ的培养方法，并探讨影响脐静脉内皮细胞分离培养成败的关键因素．
１实验材料
１１材料．
２１０１年２月
中央民族大学学报（自然科学版）
ＪｕｎｌｆＣ（ａｕａＳｉｃｓＥｉｏ）ｏｒａｏＭＵＮｔｒｌｃｅ０１
Ｖｏ＿０１２Ｎｏ１．
第２０卷
第１期
脐带由北京市海淀区妇幼保健院手术室提供，选择羊水无污染的健康新生儿脐带．
１２试剂．
胎牛血清（ｙｌｎ，国）内皮细胞生长因子（ｎｏｅａｃｌｇｏｔｃｒＥＧ，ｏｈ，国）明Ｈｃｅ美ｏ；ｅｄｔｌｌｅｒｗｈｆｔ，ＣＦＲｃｅ美ｈｉｌａｏ；胶（ｉａ美国）Ｓｇ，ｍ；Ｍ１９培养基、９高糖ＤＭ培养基（ｉｃＭＥＧｂｏ美国公司）Ｉ型胶原酶（ｎｉｏｅ，国）；ｖｒｇｎ美Ｉｔ、胰酶、ＤＡ（ｍｅｃ，国）兔抗人 Ⅷ 因子抗体、ＩＣ标记的羊抗兔二抗（ａｔｒｚ美国）ＥＴＡｒｓｏ美；ＦＴＳｎＣｕ，ａ．
原代ＨＶＣ分离培养关键影响因素分析ＵＥｓ
朱丹，丽丽，秀兰古黄
（央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京１０８）中００１

huvec的分离及培养

（一）脐静脉内皮细胞原代培养1.1 取材与接种（1）取产后6 h内的健康新生儿脐带10-15ml,立即放入灭菌的PBS缓冲液中, 4 ℃保存（2）在超净工作台内,剪除破损或有夹痕及血肿的部分,脐带一端插入去掉针尖的16号注射针头,止血钳固定,使用预冷的PBS缓冲液冲洗至无血迹（3)将脐带另一端扎紧,从针头一端向静脉内灌注0.1% I型胶原酶,使静脉完全充盈,并夹闭两端（4）将盛有脐带和PBS液的烧杯放入37 ℃水浴中孵育15 min。

孵育完毕后放出脐静脉内液体,用PBS液反复冲洗脐静脉,一并收集到50ml离心管（5）1000r/min,离心10min,弃上清液,向沉淀中加入含20%胎牛血清的L-DMEM培养液(10ng/LVEGF、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、200mmol/L L-谷胺酰胺) 用吸管轻轻的吹打制成均匀的细胞悬液,接种于25cm的培养瓶,放入37℃,5%CO2培养箱,24h换相同培养液1次,以后每2～3d换液1次。

1.2 内皮细胞传代培养（1）原代培养的内皮细胞80%以上融合时,弃去培养液后,用PBS液冲洗2～3遍,（2）然后加入0.25%胰蛋白酶常温下消化1min,轻轻摇动,当见细胞出现皱缩,细胞间隙增宽,并有少许细胞脱落时立即停止消化，加入含血清的培养液灭活胰蛋白酶,用吸管轻轻的吹打使仍贴壁的细胞脱落下来,（3）收细胞- 酶溶液, 1000r/min,离心10min,弃上清液,用吸管轻轻的吹打制成均匀的细胞悬液,计数、并按( 0.5 ～1 ) ×105密度接种于25 ml的培养瓶中继续培养。

1.3 鉴定(1)人脐静脉内皮细胞形态鉴定用倒置显微镜每天镜下观察细胞形态。

(2)内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原检测①在6孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片,待内皮细胞生长至单层,用镊子轻轻取出盖玻片,用PBS洗3遍,晾干②用中性缓冲福尔马林固定30min,蒸馏水冲洗③加3%H2O2 ,作用10min,蒸馏水冲洗④加pH 6.0枸橼酸缓冲液,高压灭菌3min,冷却后,PBS洗3 遍⑤加入兔抗人第Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体, 4 ℃过夜,同时以磷酸缓冲盐替代一抗做阴性对照,具体步骤参照，即用型SABC免疫组化染色试剂盒使用说明书。

HUVEC细胞培养心得

HUVEC 培养交流讨论：各位仁兄，我查了一下，关于HUVEC 的贴子有几千篇，不知有那位知道的多的能给总结一下？我想应该有以下几1、讲清HUVEC 与ECV304区别2、HUVEC 原代与细胞株的关系、区别问题3、能否总结一下国内有哪些单位可以买到HUVEC ？是原代还是细胞株？4、培养中到底添加ECGS 还是ECGF ？5、有些推荐细胞的应该讲清自己的是原代还是细胞株，能养多少代。

希望能抛砖引玉。

票数+收藏2回帖16浏览2686我也要发帖举报∙浙江医院招聘浙江省老年医学研究所（临床医学） ∙请教关于HUVEC 细胞的培养 ∙求购HUVEC ∙【互助小组】正在养或已经养过HUVEC 的请进。

docter_zhao∙0 2004-08-03 15:14 消息引用分享 huvec 必需加ECGS 及肝素，否则很难生长增殖举报 ∙zjqlucky∙15 ∙ 5∙7 2004-08-03 17:27 消息引用分享docter_zhao wrote: huvec 必需加ECGS 及肝素，否则很难生长增殖这个好像也未必吧，我养的原代的huvec 只用20％胎牛血清的RPMI1640也长的很好呀，只是传ecgs 能传这么多代吧票数+收藏1举报 ∙2004-09-08 00:20 消息引用分享我们曾试过用m199或DMEM 加20％胎牛血清原代培养，感觉效果不佳，后来加了ECGS 及肝素，发现细胞长得能有改变票数+收藏1举报引用分享huvec 是脐静脉内皮细胞,不是那么难养,细胞可以从脐带自己提取,卖现成的细胞株也不贵,用内皮细胞的配套培email-sinian19988@∙∙细胞系查询培养基培养用常用试剂各品牌评定cairuiyanzi入门站友 ∙积分 ∙得票 ∙3粉丝加关注 2012-08-16 10:02 消息引用分享哪位大虾知道HUVEC 加肝素的目的？谢谢了！我现在养着HUVEC ，第二代是用新配的GIBCO 的M19培养两天发现细胞状态不好，似大面积凋亡，并伴有部分脱落。

原代huvec细胞培养注意事项

原代huvec细胞培养注意事项
原代HUVEC细胞是一种常用的血管内皮细胞模型，主要用于研究血管生物学和心血管疾病的发生机制。

在进行HUVEC细胞的培养时，需要注意以下几点。

选择适当的培养基。

常用的HUVEC细胞培养基包括EGM-2和M199等，可以根据实验需要选择合适的培养基。

在培养基中添加适量的胎牛血清或人血清，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子。

维持适宜的培养条件。

HUVEC细胞对温度和CO2浓度较为敏感，一般在37摄氏度、5% CO2下培养。

此外，保持培养皿内的湿度也很重要，可以在培养皿内加入一些水或PBS来增加湿度。

注意细胞的传代和增殖。

HUVEC细胞在培养过程中会不断增殖，当细胞密度达到80%到90%时，应及时进行传代。

传代前要用PBS 洗涤细胞，然后使用胰酶将细胞从培养皿上剥离下来，最后用新的培养基重新培养。

注意细胞的纯度和鉴定。

HUVEC细胞的纯度对实验结果的准确性有重要影响，因此需要对细胞进行鉴定。

常用的方法包括免疫细胞化学染色和流式细胞术等。

注意细胞的保存和储存。

HUVEC细胞可以冷冻保存，使用液氮保存细胞可以延长细胞的保存时间，并且可以避免细胞的突变。

在冷冻
保存之前，需要将细胞用含10% DMSO的培养基悬浮，并分装到冻存管中，再放入液氮中保存。

HUVEC细胞的培养需要严格控制培养条件，注意细胞的传代和纯度鉴定，以及细胞的保存和储存。

只有做好这些注意事项，才能保证细胞的正常生长和实验结果的准确性。

HUVEC分离方法

HUVEC细胞分离方法
1、清洁脐静脉：取20cm左右脐带，输液针（带套管）插入脐静脉，用血管钳连同脐带输液针套管一起夹住，注射器取20ml Hank’s液由输液针注入脐静脉，将脐静脉内血块冲洗干净，并尝试夹闭脐静脉另一端，检查脐静脉密闭性，最后注入空气，将Hank’s液全部排出。

2、酶解HUVEC细胞：取0.1%（1mg/ml）I型collagenaseHank’s液20ml，由输液针注入脐静脉，开始可将脐带另一端提起，排出气泡，当酶液溢出时用血管钳夹紧脐带，封闭脐静脉，然后将酶液全部注入，可见脐静脉膨胀，再次检查密闭性后，将整跟脐带放入无菌的37℃PBS中孵育15-20分钟(一定不能超过25分钟)，取出脐带，用手沿静脉方向按摩，帮助细胞下来。

在脐带末端血管钳内侧剪断，收集酶液至50ml离心管中，再用25mlHank’s冲洗脐静脉，将酶解下来的HUVEC全部冲出，一并收集至离心管中。

3、收集、培养HUVEC细胞：将收集到的HUVEC混悬液至离心机中离心（1500rpm 5min），倒去上清，注意勿将下层絮状物倒出，加内皮细胞生长培养基8ml至离心管中，重悬HUVEC，分于两个大皿培养。

24小时后换液。

huvec细胞鉴定方法-概述说明以及解释

huvec细胞鉴定方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的细胞模型，在很多生物医学研究中被广泛应用。

正确认识和鉴定HUVEC细胞的方法对于确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。

然而，由于其细胞特性的多样性和相似性，准确地鉴定HUVEC细胞一直是一个具有挑战性的课题。

目前，主要的HUVEC细胞鉴定方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等。

形态学观察是最直观的方法，通过观察细胞的形态、大小、颜色等特征来初步鉴定。

然而，形态学观察仅仅是最初的鉴定步骤，无法提供确凿的证据。

免疫细胞化学染色是一种常用的鉴定方法，通过使用特异性的抗体标记HUVEC细胞所表达的特定蛋白，如血管内皮细胞相关抗原（CD31）、血管内皮细胞黏附分子（VCAM-1）等。

这种方法能够在细胞水平上确定细胞的身份，并且具有较高的特异性和敏感性。

另外，遗传学分析也是一种重要的HUVEC细胞鉴定方法。

通过检测HUVEC细胞中特定基因的表达情况或突变情况，如内皮细胞特异性基因（von Willebrand因子、血管内皮生长因子等）的表达，或特定突变基因（如朊病毒受体Eynoltin-2的突变）等，可以进一步确定细胞的身份。

综上所述，准确鉴定HUVEC细胞的方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等多种方法的综合应用。

在进行HUVEC细胞相关研究时，应充分考虑综合运用这些方法来确保实验结果的准确性和可靠性。

未来的研究可以进一步改进和发展更加精确、高效的HUVEC细胞鉴定方法，以满足不断深入的实验需求。

1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在向读者介绍本篇文章的整体结构，以帮助读者更好地理解和阅读文章。

本文分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分包括概述、文章结构和目的三个方面。

在概述中，将简要介绍HUVEC细胞的重要性和研究价值。

文章结构部分将向读者展示本文的整体框架，以便读者在阅读过程中能够有条不紊地理解文章内容。

HUVEC-原代培养步骤

人脐静脉内皮细胞培养1 材料1.1 取材新鲜脐带(无菌的广口瓶，内装预冷的PBS，并加上200 U/ml 青链霉素)，产后4 h 内最佳，一定不要超过24 h，实验前保存在4℃冰箱中。

1.2 试剂0.1%的I型胶原酶(用培养基配成，如DMEM、M199 均可)；培养液(M199、50 μg/ml ECGF、20%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2 mmol⋅L-1谷氨酰胺、100 U/ml肝素钠)，也可以选择其它的生长因子。

平衡盐液(生理盐水或者PBS或者D-hanks’液)；1%明胶。

1.3 器械烧杯(脐带数＋2)、止血钳(脐带数×2＋2)、镊子2 把、手术直剪(脐带数×1)、12 号粗针头(去尖，打磨光滑，脐带数×1)、玻璃培养皿。

2 方法2.1 明胶包被培养瓶过夜，取出明胶，用2 ml培养液(含10%血清的普通培养液)冲洗培养瓶一遍，放置超净台中。

2.2 去妇产科取当天新鲜脐带。

2.3 将取出的脐带放在盛有含双抗PBS 的玻璃培养皿中，洗净脐带表面的残留血液，将脐带两端各剪去一部分；更换一个新的玻璃培养皿，辨别脐带静脉(粗大的那根)，顺着静脉插入大针头，注入含双抗PBS，充分冲洗脐静脉，至流出液体中无可见血液；再更换一个培养皿，加少许PBS，把脐带放在培养皿中，从针头打入胶原酶(37℃预温)，当胶原酶从另一头流出少许的时候，用止血钳夹闭，继续注入胶原酶使脐带充盈后也封闭，37℃消化15 min(室温30℃ 20 min)。

消化结束后收集所有消化液，吸取PBS 冲洗脐带，合并到消化液中，1000 rpm 离心5 min，弃上清，加入4 ml 培养液悬浮细胞，接种到明胶包被的塑料培养瓶中，12-24 h 后换液一次。

一般一根脐带消化下来的细胞可以培养一个培养瓶，如果细胞少就六孔板一个孔，细胞不能太稀疏，否则生长缓慢。

2.4 3-4 天长满后用胰酶(含EDTA)消化以1:2 传代时。

huvec细胞成管原理

huvec细胞成管原理HUVEC细胞成管原理主要涉及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在体外形成管腔结构的过程。

HUVEC细胞是一种源自人体脐静脉内皮的细胞，常被用于体外实验研究。

成管过程是指HUVEC细胞在特定条件下形成管状结构，模拟人体内血管系统的形成。

成管的过程经历几个主要阶段。

首先，HUVEC细胞被培养在含有特定细胞培养基的培养皿中。

接着，经过一定时间的培养，HUVEC细胞开始发生形态改变，从扁平的形态转变为柱状形态。

这个阶段被称为上皮细胞向内突出。

细胞内的特定信号逐渐调节细胞的粘附性，促使细胞集结在一起。

接下来，HUVEC细胞开始形成单层的圆形管腔结构。

这是通过细胞间的细胞黏附分子和细胞外基质分子之间的相互作用实现的。

这些分子在特定时间和位置上被调控，从而使细胞形成管状结构。

同时，细胞内的信号通路被激活，导致细胞内的分化和生长。

最后，一系列的信号通路和细胞间相互作用促使管腔的进一步扩张和稳定。

这个过程涉及到细胞分化和新的基质分子的合成和分泌。

细胞继续增殖、迁移并形成分支，最终形成完整的管腔结构。

HUVEC细胞成管的研究对于了解血管系统的形成和发展具有重要意义。

这种体外实验方法可以帮助科学家们研究和理解细胞间的相互作用、信号通路的调控以及基质的重要性。

通过研究HUVEC细胞成管原理，我们可以更好地了解血管疾病的发生机制，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。

总而言之，HUVEC细胞成管原理是关于人脐静脉内皮细胞在体外形成管腔结构的过程。

这一过程涉及到细胞的形态改变、信号通路的调控以及细胞间和细胞与基质之间的相互作用。

研究HUVEC细胞成管原理有助于我们更好地理解血管系统的形成和发展，并为血管相关疾病的治疗提供新的方向。

细胞说明书（huvec）

细胞说明书（HUVEC）
细胞名称：HUVEC（中文名称：人脐静脉内皮细胞）
细胞简介：HUVEC细胞为人脐静脉内皮细胞，来源于人脐静脉，中文名为人脐静脉内皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。

培养方法：
冻存方法：
For research use only
T25瓶细胞处理方法
收到细胞后，检查外包装是否完整，细胞培养瓶是否完好。

如有破损漏液等问题，请即时联系
我们。

1.75%酒精棉球擦拭T25细胞培养瓶外部。

2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（40
×,100×,200×各一张）。

3.将细胞放入37度培养箱中预温1-2小时后再做处理，以稳定细胞状态。

4.预热培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）。

5.若细胞密度较小，无菌操作，去掉培养基。

每瓶添加第四步中准备的5-6ml培养基。

放
到37度培养箱培养。

待细胞密度达到80%以上，进行传代。

6.若细胞密度较大，达到80%以上，将细胞传到10cm培养皿培养。

7.传代时，T25瓶里保留部分细胞，同步培养，直到能确保10cm培养皿中的细胞状态良
好。

huvec 提取我的详尽版

原代HUVEC的分离与培养准备材料：高压过的器械（包括止血钳，剪刀，镊子），滤嘴，50ml离心管，高压过的锡箔纸，20ml注射器，无菌治疗巾，无菌手套，无菌剪刀（病区可获取）胶原酶：1mg/ml加入培养基中，配10ml左右，后用注射器经滤嘴过滤后放入离心管保存培养基：ECM培养基+双抗（5ml/500ml）[自己配置-42ml ECM + 7ml FBS +500μL ECG，500μL PBS]药物：高压过的PBS，肝素钠，双抗，胶原酶，ECM培养基脐带保存用PBS：高压消毒后的PBS，预冷，加入肝素钠及双抗，放入冰盒（肝素钠浓度：查阅书，15μg/ml；美国ATCC说明书，0.1mg/ml；另有50U/ml）。

1.无菌止血钳夹闭脐带两端，剪断收集20～30cm脐带，放入盛有4℃PBS的饭盒内运输（不超过6小时）2.请助手打开装有期待的PBS铺无菌治疗巾，戴无菌手套，请助手打开铝制饭盒，取全部器械置于治疗巾上，用消毒过的长镊子自PBS瓶中夹出脐带置于无菌弯盘中，用无菌剪刀将两端有破损、夹痕、血肿部分剪去。

3.PBS冲洗脐带残端，找到脐静脉（根据脐带1静2动结构），轻柔赶出静脉内残液，PBS冲洗脐静脉至无肉眼血液残留。

4.用止血钳夹闭一端，用注射器自另一端注入37℃预热的胶原酶6-8ml，充盈后夹闭脐带，放入饭盒内，置于37℃培养箱消化15～20min。

5.消化期间，配置ECM培养基，在培养皿中加入5ml培养基预热培养基。

6.消化完毕后，挤出脐静脉中液体至50ml离心管中，加入适量配置好的培养基，终止消化。

20-25℃1000rpm离心5-10分钟。

7.弃去上清液，加入2mL的培养基使细胞重悬并计数，要求>1×10个/mL。

8.移至大皿，加配置好的完全培养基到10mL，移至培养箱后立即水平十字架摇动使细胞均匀贴壁。

静置培养24h后换液1次，以除去未贴壁的细胞和红细胞。

以后每隔2d换液1次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。

简便高效的原代HUVECs培养

简便高效的原代HUVECs培养路静;赵军;杨洪艳;黄幼田;郑智敏;赵明耀;董子明【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2009(029)001【摘要】目的建立简便高效的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外分离、培养、冻存方法 ,以获得大量HUVECs为相关医学基础研究及组织工程学提供良好细胞来源.方法新鲜脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶消化,获得HUVECs,内皮细胞培养基(ECM)进行培养.倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学、RT-PCR检测VWF、CD144的表达.HUVECs加入10%甘油的冻存液,置于液氮保存4周,冻存复苏后Western blot检测VWF、CD144蛋白水平的表达.结果 HUVECs体外生长2～3 d可铺满单层,细胞呈梭形,漩涡状排列牛长,传代后可见管腔样结构;高表达VWF和CD144;冻存后复苏的细胞分裂增殖旺盛,蛋白水平高表达VWF、CD144.结论脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可获取大量高纯度的内皮细胞,可作为相关研究良好的细胞来源.【总页数】4页(P78-81)【作者】路静;赵军;杨洪艳;黄幼田;郑智敏;赵明耀;董子明【作者单位】郑州大学,基础医学院,病理生理教研室,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,病理生理教研室,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,病理生理教研室,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,病理生理教研室,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,病理生理教研室,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,病理生理教研室,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,病理生理教研室,河南,郑州,450052【正文语种】中文【中图分类】R322.12【相关文献】1.一种高效简便的原代神经元培养方法 [J], 张涛;胡怀强;王旭辉;牛兵;陶珍;曹秉振2.一种简便有效的小鼠子宫内膜细胞原代培养方法 [J], 赵瑾瑶;王波;郝立宏;燕秋3.原代HUVECs分离培养关键影响因素分析 [J], 朱丹;古丽丽;黄秀兰4.一种简便的皮层神经元原代培养方法的建立及其培养结果分析 [J], 唐仕军;赵冬;朱立仓;李晓天;朱文学;杨鹏;王业忠5.简便人大肠癌原代细胞培养方法的探讨 [J], 蔡慧云;于波;白雪;杜茜;杜峻峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

HUVEC培养过程

Trypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution可同样处置。

3）转移细胞至15mL离心管中，1000rpm 离心5mins，弃上清，加入新鲜的培养液转移至新的培养皿/瓶。

4）复苏、冻存雷同其他细胞操作，细胞复苏、传代后不可多次传代，一次复苏的细胞尽量满足连续性试验需要。

5）可参考Cascade Biologics公司的操作。

实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养

实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。

注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml 无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。

6.倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。

注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。

）7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。

9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10.倒掉造就基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，插手2-3ml消化液（0.25%胰酶0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下窥察，一旦细胞变圆，即插手2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中。

2000转/分，离心3分钟。

12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。