第三节 动物细胞工程

第三节 动物细胞工程【学习目标】1、简述动物细胞培养的过程、条件及其应用2、简述克隆动物的概念含义和基本原理3、简述体细胞核移植技术和动物克隆技术，以及应用前景4、简述动物细胞融合的方法和过程5、简述单克隆抗体的制备过程及其应用【课前预习】一、动物细胞与组织培养1、概念：是指在体外模拟动物体内环境，将动物的 在 的条件下培养，使其继续生长、增殖并维持原有结构和功能的技术。

2、条件：动物细胞培养的环境条件，包括 ； 动物细胞与组织培养的培养基，可分为 和 。

动物细胞与组织培养的细胞，一般为 、 或 。

二、细胞核移植与动物体细胞克隆动物体细胞克隆：是将供体体细胞的 与受体 进行人工组合，借助于 的发育能力，经过培养发育成胚胎进而形成个体的技术。

细胞核移植技术：是一种利用显微操作技术将某种动物细胞的 移入 或 动物的 内的技术。

三、细胞融合和单克隆抗体1、细胞融合概念：是指在一定的条件下将 细胞融合为 的过程。

2、诱导细胞融合的方法有： 法（如 ）、 法（如 ）；和 法（如 ）。

3、单克隆抗体制备：给小鼠注射特定的 ，从 中分离B 淋巴细胞（即浆细胞）与 细胞融合，经培养，筛选出 细胞，使其在 或 培养，迅速增殖，分泌出 ，即为单克隆抗体。

【共同探究】一、动物细胞与组织培养1、概念：2、动物细胞培养的过程：【思考题1】为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。

分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困取动物 用 酶处理 单个细胞 形成 转入培养液 培养进行 培转移到新培养液中难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。

同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。

用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。

胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。

胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。

多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。

3、动物组织培养的过程：【思考题2】动物组织培养与动物细胞培养的过程有何不同？【思考题3】幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。

所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。

同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。

【思考题4】动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。

但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。

一般而言，动物细胞培养不需要经过脱分化过程，因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完成个体的能力。

要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。

【小知识】细胞贴壁、细胞的接触抑制将细胞悬浮液置于适宜环境的培养瓶中培养，悬液中分散的细胞很快贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。

当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

4、动物细胞培养的条件：①对培养液和所有培养用具进行无菌处理。

（为什么？）②营养（培养基）。

根据营养物质的来源，一般将培养基分为天然培养基和合成培养基；天然培养基主要取自、和等；合成培养基是人工配制的，包括多种营养物质如等，合成培养基中仍需加入动物血清，为什么？。

细胞外培养所需营养与体内基本（相同、不同）。

定期更换培养液，以便。

③环境条件：温度。

一般与动物的，如哺乳动物多为℃。

pH。

多数细胞生存的适宜pH为。

气体环境。

O2是所必需的；CO2的主要作用是。

O2和CO2的含量不仅影响环境的，还直接影响。

【思考题5】为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。

氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。

血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。

因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。

5、原代培养与传代培养：原代培养：是指从培养，一般指10代以内的细胞培养。

传代培养：将原代培养的细胞继续培养，这样的培养叫传代培养。

一般说来，细胞在传至10～50代左右时，增殖就会逐渐缓慢至完全停止，这时有部分细胞的细胞核型可能会发生变化，当继续培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。

【思考题6】动物细胞培养与植物组织培养的比较植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞的增殖培养基固体：营养物质、激素等液体：营养物质、动物血清等过程脱分化、再分化原代培养、传代培养结果完整植株动物细胞培养目的快速繁殖，培育无病毒植株等获得细胞的产物或细胞本身，而非动物体。

【思考题7】某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。

供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。

（1）将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于条件适宜且相同的培养瓶中培养。

一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量。

（2）细胞培养应在含有5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是。

（3）为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的。

（4）已知基因X表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗癌药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A、B两组，A组细胞培养液中加入药物Y，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，培养一段时间后，从A、B两组收集等量细胞，通过分别检测基因X在A、B两组细胞中的或合成水平的差异，确定Y的药效。

【思考题8】某研究小组对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行动物细胞培养。

下列说法正确的是（多选）A．在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理B．细胞培养应在含5％CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激细胞呼吸C．为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素D．在相同适宜条件下培养等量的甲、乙细胞，一段时间后，甲细胞数量比乙多二、细胞核移植和动物体细胞克隆技术1、概念：动物体细胞克隆：是将供体体细胞的与受体去核卵细胞的进行人工组合，借助于的发育能力，经过培养发育成胚胎进而形成个体的技术。

体细胞克隆的关键是。

【思考题9】为什么不能用单独的动物体细胞发育成新个体，而必须借助于细胞核移植技术？细胞核移植：是一种利用显微操作技术将某种动物细胞的移入同种或异种动物的去除内的技术。

方法：显微操作技术2、过程：【思考题10】用于核移植的供体细胞一般选用传代10代以内的细胞是 为了保证 。

用体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？3、意义：克服动物种间杂交障碍、创造新物种；大量复制实验动物；利用异种动物借腹妊娠挽救珍稀动物；利用患者自身的细胞培育新的组织或器官用于组织器官的移植。

【思考题11】下图为克隆羊“多利”的培育过程示意图：下列各项有关表述错误．．的是 A ．克隆羊“多利”的主要性状与甲羊一致，因为其细胞核基因来自甲羊B ．克隆羊“多利”的培育过程中采用的生物技术有核移植和胚胎移植C ．乙羊的去核卵细胞为重组细胞基因表达提供了细胞内的环境条件D ．此过程说明高度分化的动物细胞具有全能性三、细胞融合和单克隆抗体（一）细胞融合1、概念：是指在一定的条件下将 细胞融合为一个细胞的过程。

诱导细胞融合的方法有： 法（如 ）、 法（如 ）；和 法（如 ）。

【思考题12】杂交细胞是指融合后形成的具有 细胞遗传信息的 细胞。

杂交细胞形成过程中，细胞膜的融合依靠 等方法，而细胞核的融合在 时形成。

2动物细胞融合的过程收集动物卵巢，采集卵细胞 去除卵细胞的 生出与基本相同的动物 优良品种动物的身体某一部分体细胞（供体）供体细胞 培养 通过 使两细胞融合 将胚胎移入受体母体内激活融合细胞，使其完成 核移植 植入丙羊子宫 发育、分娩 适宜 条件 重组 细胞 甲羊的乳 腺细胞核 乙羊的去核卵细胞 早期 胚胎 克隆羊 “多利”【思考题13】在动物细胞融合的实际操作过程中是用单个的两种细胞来融合吗？ 。

为什么？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。

仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。

更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。

目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。

我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。

我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B 淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。

3、意义：细胞融合技术突破了 方法的局限，使 杂交成为可能。

4、应用：动物细胞融合的用途：制备单克隆抗体5、动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 细胞膜的流动性细胞融合的方法 酶解法去除细胞壁后诱导原生质体融合 胰蛋白酶处理使细胞分散后诱导细胞融合 诱导手段 物理法：离心、振荡、电刺激等 化学法：聚乙二醇等 物理、化学法：同左生物：灭活的病毒主要用途 克服远缘杂交不亲和，获得杂种植株制备单克隆抗体的技术之一 （二）单克隆抗体制备：【思考题14】过程①的目的是 。

抗体是由 细胞产生的、可以与 结合并进一步发生变化，形成 ，进而被 吞噬消化。

一个B 淋巴细胞只分泌 特异性抗体。

传统的获得抗体的方法是向动物体内反复注射 ，使动物产生抗体。

由于从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差，所以常用 的方法来制备。