人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化

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人源细胞色素C在大肠杆菌中的重组表达和分离纯化

１５００
ＯＯ
５
１０
（ｍ１）
围３细胞色素ｃ在ｐＨ８．Ｏ条件下的层析围
Ｃｈｒ帅ａｔｏｇｒａｐｈｙＦｔｇ３
ｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｕｎｄｅｒｐＨｄ．Ｏ
万方数据
圈４不同ｐＨ条件（５．４，７．５·８．Ｏ）下纯化的细胞色素ＣＦｉｇ４ＳＤＳ—ＰＡＧＥｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｐｕｒｉｆｉｅｄｕｎｄｅｒｐＨ５．４（Ｉａｎｅ１），
万方数据
万方数据
生物医学工程学杂志
第２４卷
或含血红素蛋白的底物‘８３检测。取１０弘ｌ不同浓度的蛋白加入９６孔板中，再加入１００肛ｌＴＭＢ显色液，３７℃孵育１０ｍｉｎ，５０ｐｌ１ＭＨ２ＳＯ．终止反应，然后于４５０ｎｍ测定吸收值。以溶于相同缓冲液中的牛血清白蛋白为对照。
３结果
２ＮａｔｉｏｎａｌＰｈａｒｍａｃｏｐ∞ｉａＣｏｍｍｉｔｔ％Ｐｌｌａｒｍａｃｏｐｏｅｉ矗ｏｆＴｈｅＰｅｏｐｌｅ’ｓＲｅｐｕｂＩｉｃｏｆＣｈｉｎａ。２０００．ＢｅｉｊｉｎｇＩＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙＰｒｅ３ｓ，２０００ｔ４４１．４４３［国家药典委员会编．中华人民共和国药典．第二部．北京ｔ化学工业出版社．２０００．。４４ｌ－４４３］
由于细胞色素Ｃ的等电点较高，用阳离子交换分别为５．４，７．５和８．Ｏ时，获得样品的Ａ。。咖／２８咖
纯化是比较好的方法。但是，从图２ＳＤＳ—ＰＡＧＥ的的比值分别为１．９４６，３．３４１和３．６３７。如图４所示，
结果可以看出，经过一次离子交换柱后的细胞色素
用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件（Ｂｉｏ—Ｒａｄ）对电泳图谱进行分
交换的方法分开。虽然从电泳图谱上无法分辨用溶菌酶破菌后获得的蛋白与另两组有明显差异，但从获得样品Ａ。。嘶／Ａ。。嘶的比值来看，直接超声破碎和冻融联合超声破碎组相近，分别为１．５９和１．６７；而溶菌酶破菌组的比值为１．１２，明显比前两组低。这表明用溶菌酶处理的样品中含有的杂蛋白多，可能是因为残留了部分溶菌酶所致。

CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化【关键词】 CGGBP1；基因表达；纯化0引言脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最多见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳固扩增及其CpG岛异样甲基化致使. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏致使FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方式材料大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保留. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司；限制性内切酶BamH I 和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术.方式表达载体的构建依照CGGBP1基因起始密码子和终止子临近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物别离加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部份). PCR反映以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR 扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反映缓冲液μL，25 mmol/L MgCl2 μL，DMSO μL，4× dNTP混合物（每种 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板μL（50 ng/μL）， Taq DNA （5 μ/μL）聚合酶μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在Ｔ4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培育基平板并挑取单菌落.融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培育基中， 37℃振荡培育12 h，按10 mL/L比例转接于新鲜培育基，37℃振荡培育至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培育4 h，离心搜集菌体，SDS PAGE分析重组蛋白的表达.蛋白表达形式的分析取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH ）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后别离将上清和沉淀进行SDS PAGE分析.融合蛋白的纯化将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱终止后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH ），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 通过2次漂洗后再用 mL洗脱液(250mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步搜集. 取搜集液，进行SDS PAGE 分析.与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L Tris HCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组别离加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组别离再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl， mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，滚水煮10 min，进行SDS PAGE 分析.2结果原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观看到一条约504 bp的条带（图1）；重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A别离用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，别离为 ku和504 bp（图2），均与估量结果相同. 的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，挑选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的 BL21(DE3)菌株，经IPTG 诱导后，在Mr 约25 000处显现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体那么无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部份. 经SDS PAGE分析说明，CGGBP1部份存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）.蛋白纯化在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游，插入有持续6个组氨酸的序列—(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag 能够和外源插入片段一起表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方式，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方式. SDS PAGE显示，CGGBP1取得较高程度的纯化（图4）.与5′d（CGG）293′重复序列双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′ d (CGG）293′重复序列双链DNA 结合的蛋白也被洗脱（图5）.3讨论关于微卫星的产生机制，普遍以为是DNA复制进程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，致使一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发觉微卫星可能是一种超级活跃的碱基序列，通常各类简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，那个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中超级复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等进程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报导的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义.本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式取得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，取得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.【参考文献】［1］Wells RD, Warren ST. Genetic Instabilities and Hereditary Neurological Disorders ［M］. Academic Press, San Diego,1998:46-96.［2］Cleary JD, Nichol K, Wang YH, et al. Evidence of cis acting factors in replication mediated trinucleotide repeat instability in primate cells［J］. Nat Genet, 2002, 31(1)：37-46.［3］Deissler H, Wilm M, Genc B, et al. Rapid protein sequencing by tandem mass spectrometry and cDNA cloning of CGGBP1［J］.Biol Chem, 1997,272(27):.［4］Sinden RR, Potaman VN, Oussatcheva EA, et al. Triplet repeat DNA structures and human genetic disease: Dynamic mutations from dynamic DNA ［J］. Bioscience, 2002,27(1 Suppl 1):53-65.［5］Wahls WP. Meiotic recombination hot spots: Shapping the genome and insight into hypervariable minisatellite DNA change［J］.Curr Top Dev Bio1, 1998,37:37-75.［6］Wahls WP, Moore PD. Recombination hotspot activity of hypervariable minisatellite DNA requires minisatellite DNA binding proteins［J］.Somat Cell Mol Genet, 1998,24(1):41-51.［7］Igarashi S, Tsuji S. The molecular mechanisms of the instability of the CAG repeat［J］. Nippon Rinsho,1998,56(4):1064-1073.［8］Deissler H, Behn Krappa A, Doerfler W. Purification of nuclear proteins from human HeLa cells that bind specifically to the unstable tandem repeat (CGG)n in the human FMR1 gene［J］. Biol Chem, 1996,271(8):4327-4334.。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

HTPP-MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

期研究中将肝靶向穿膜肽（ｐｔｃｔ— ｒｅｉｇａｄＨｅａｏｙｅｔｇｔｎａｎ
ｐｎｔａｉｇｐｐｉｅＨＴＰ）家蝇抗菌肽天蚕素ｅｅｒｔｅｔ，Ｐ与ｎｄ
（ｓｏｓｃｅｒｐ，Ｃ融合，建的肝靶ＭｕｃｄｍｅｔａｃｃｏｉＭＤ）ａｉｎ构
物学活性研究及产业化开发奠定了基础。
关键词：靶向穿膜肽 பைடு நூலகம் 肝家蝇天蚕素；融合基因；核表达原
中图分类号：８Ｑ７６文献标识码：Ａ文章编号：６２４５２１）５０６３１７ —５２（０２０ —０１ —０
摘
要：过双酶切、接、化等方法将肝靶向穿膜肽一家蝇天蚕素（Ｐ — Ｃ融合基因克隆至原核表达栽体通连转ＨＴＰＭＤ）
ｐＴ２（），建重组表达质粒ＨＴＰＭＤ／Ｅ３ａＥ３ａ＋上构Ｐ－ＣｐＴ２。重组质粒转化ＥｃｌＢ２（Ｅ），ＩＴ诱导，Ｄ．ｏｉＬ１Ｄ３后以ＰＧｓＰＧＥ分析表明重组融合蛋白得到了可溶性表达，ｓｅｎｂｔ交证实了表达蛋白的抗原活性。为ＨＰＭＤ的生ＡＷｅｔｒｌ杂ｏＴＰ — Ｃ
２１，ｏ２Ｎ．０２Ｉ９ｏ５亿与生物互程Ｖ．
Ｃｈｍｉｔｙ＆Ｂｉｅｇｎｅｉｇｅｓｒｏｎｉｅｒｎ
ｄｉ１．９９ｊｉｎ１７ — ５２．０２０．０ｏ：０３６／．ｓ．６２４５２１．５０５ｓ

如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体

争鸣如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体余砚笈由外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理，可以从启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数等方面进行改善构建。

一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。

2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。

而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。

3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。

4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。

5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。

6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。

二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。

启动子是在转录水平上影响基因表达。

转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。

也就是说启动子会有强弱之分。

要获得高效表达必须选择强启动子。

由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。

通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λp L等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。

三、终止子有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，因为它们具有极其重要的作用。

贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。

这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。

同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录。

四、核糖体结合位点1、Shine-Dalgarno（SD）序列一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。

人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化

人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化吕欣;方海亮;姚敏;尹文;雷迎峰;杨敬;康健【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2008(21)10【摘要】目的:构建人CD81-LEL基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达. 方法:通过PCR扩增得到CD81-LEL基因编码区片段,与pMD18-T载体连接,经序列测定后,再将该扩增片段亚克隆入原核表达载体pET32a(+)中.酶切鉴定正确的表达载体pET32a-CD81-LEL转化表达菌BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白. 结果:成功构建了原核表达载体pET32a-CD81-LEL;SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达且呈可溶性状态,Western-blot显示目的蛋白正确表达,并用镍离子亲和层析法获得纯化的重组蛋白. 结论:CD81-LEL可以在大肠杆菌中表达,为进一步研究CD81与丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E2的结合提供了有用的研究资料.【总页数】4页(P1011-1013,1017)【作者】吕欣;方海亮;姚敏;尹文;雷迎峰;杨敬;康健【作者单位】第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,药学系,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建及表达 [J], 李文秀;周凤云;毛伟平;潘杨滨;何志娟;徐翀;刘宣宣2.人类神经型一氧化氮合酶原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的表达 [J], 付捷;周羽竝;赵迎社;管志文;井柳尧3.人红细胞生成素受体胞外区在大肠杆菌中的表达及纯化 [J], 马姜林;华子春4.人Fcγ RIIb胞外区原核表达载体的构建及表达 [J], 张雷;曹秀琴;杨志伟5.人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达 [J], 史晓文;刘德敏;孙颖;张捷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备作者：陈章权*, 黄震, 梁晓东, 陆田田, 何天文【摘要】目的: 原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体。

方法: 用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因, 将其克隆入原核表达载体pET28中, 转化大肠杆菌BL21（DE3）, 用IPTG 诱导重组蛋白的表达, 用亲和层析法纯化重组蛋白, 以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体, 并以ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体。

结果: 在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白, 用其免疫小鼠, 获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体, 免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。

结论: 成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体, 为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础。

【关键词】 CD1d 基因表达抗体制备CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子, 分为CD1-I和CD1-II两组, 前者包括CD1a、 CD1b、 CD1c和CD1e等4个分子, 后者只有CD1d分子［1］。

CD1d分子由胞内区、跨膜区和胞外区组成, 胞外区又由α1、α2和α3等3个结构域组成, 它主要提呈糖脂抗原, 在免疫调节及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的发生发展过程中起重要作用［1, 2］。

在CD1d基因克隆过程中, 我们发现在某些疾病患者体内存在α3结构域或跨膜区缺失的变异体, 跨膜区缺失的变异体的存在提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。

为此, 我们拟建立双抗体夹心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测, 但目前尚未见有其商品化ELISA检测试剂盒。

特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键所在, 在成功制备兔抗人CD1d分子α3结构域抗体［3］的基础上, 我们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达, 并制备了其鼠源性抗体。

人脂联素原核表达载体PQE30ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达

天津医药２００８年１１月第３６卷第１Ｉ期人脂联素原核表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ的构建及在大肠杆菌中的表达幸史晓文刘德敏孙颖张捷８４３摘要目的：构建人脂联素重组表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白。

对表达产物进行鉴定。

方法：将构建好的人脂联素克隆载体ＰＵＣ５７／ＡＤＰＮ与原核表达载体ＰＱＥ３０通过双酶切方法位点特异地连接在一起，再转化人大肠杆菌ＪＭｌ０９感受态细胞中。

通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，并用ＩＰＴＧ在大肠杆菌Ｍ１５中诱导表达。

结果：ＰＣＲ获得长度为７５３ｂｐ目的片段，经ＰＱＥ３０原核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与Ｃ，ｅｎＢａｎｋ检索的人脂联素ｅＤＮＡ序列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ一００４７９７）１００％匹配；含重组Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ质粒的大肠杆菌经０．４ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导６ｈ后有表达。

结论：应用并成功构建了人脂联素原核表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，且在大肠杆菌中获得有效表达。

关键词胞间信号肽类和蛋白质类基因表达大肠杆菌遗传载体脂联素ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＰＱＥ３０／ＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒａｎｄＩｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉＳＨＩＸｉａｏｗｅｎ，ＬＩＵＤｅｔａｉｎ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｅＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｅＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅＰＱＥ３０／ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ（ＡＤＰＮ）ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（Ｅ．）ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：．ｎｌｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮｇｅｎｅＷａＳｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄＰＵＣ５７／ＡＤＰＮ．Ｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｔｏｄｉｇｅｓｔｐｌａｓｍｉｄｓ，ｔｈｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮｇｅｎｅＷ＊ｔ８ｌｉｇａｔｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＱＥ３０．Ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｔｗａ￥ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＪＭｌ０９ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒｃｈｏｏｓｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒＰＱＥ３０／ＡＤＰＮｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＬＰＴＧ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ７５３ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｗａｇｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲｃｌｏｎｅ．Ａｆｔｅｒｂｌｏｔｔｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｍａｔｃｈｅｄｔｏｔｈｅｅＤＮＡｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮ，ｗｈｉｃｈａｃｃｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＧｅｎＢａｎｋＷａＳＮＭＪＩ叫１７９７．ＡｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＷ８８ｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ０．４ｍｍｏｌ／ＬＩＰＩ．ＧｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｉｎＥｃｏｌｉＭ１５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉＰＱＥ３０／ＡＤＰＮｖｅｃｔｏｒｗａｓｆｉｒｓｔｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｌｌｇｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌｇｅｎｅｔｉｃｖｅｃｔｏｒａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ＡＤＰＮ）是脂肪细胞特异性分泌的一种血浆激素蛋白，在循环血液中大量存在，约占人体血浆总蛋白含量的０．０１％ｔ１Ｉ。

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化

引物在目的基因３端添加ＨｉＴｇ以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Ｔｉｇｒａ— ｓａ — ｒｅｃｇＦ
ｔｒＴ）ｏ（Ｆ助溶蛋白的去除．用ｐ１８对人膜蛋白Ｃ８进行原核表达与纯化，应Ｌ１Ｄ１并使用Ｆｃａ—
ｒｐｌｃｎｈｅＨｉ— ａｅｕｎｃｆｔｒｇｉｌｖｃｏｉｈｔｅｔｉｔｏｎｚｍｅｓｔｅａｉｇｔｓＴｇｓｑｅｅｏｈｅｏｉｎａｅｔｒｗｔｈｅｒｓｒｃｉｎｅｙｉｅｏｆＳｐｅＩｉｏｅｕｌｒｎｍｌｃａｂｏｏｃｌｍｅｈｏｓＨｉ— ａｅｅｃａｎｔｏｕｃｄｔｈｅ３ｅｆｔｒｅｅｈｒｕｇｉｌｇｉａｔｄ．ｓＴｇｓｑｕｎｅｗｓｉｒｄｅｏｔｎｄｏａｇｔｇｎｅｔｏｈＰＣＲｒｍｅｐｉｒ，
ｔｒＸｏａ蛋白酶去除ｃ８Ｄ１融合蛋白中的ＴＦ助溶蛋白，获得３端含有ＨｉＴｇ的Ｃ８ｓａ — Ｄ１蛋
白．人膜蛋白Ｃ８Ｄ１的表达纯化，Ｃ８为Ｄ１靶向药物筛选、抗体制备及深入研究Ｃ８Ｄ１的功能
摘要：以高效原核表达载体ｐｏｄＴＣｌＦ为载体骨架，用ＰＲ、应Ｃ限制性酶切、连接等分子生物学方法，ｐｏｄＴ中的六聚组氨酸（ｓｇ序列替换为限制性酶切位点Ｓｅ将ＣｌＦＨｉＴａ） — ｐＩ序列ＡＴＡＧ构建不合ＨｉＴｇ序列的新载体ｐ１８以此载体表达蛋白时，过ＰＲＣＴ，ｓａ－Ｌ１．通Ｃ

胸腺肽αl原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

胸腺肽αl原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达崔雪志;马凤龙;乔彦良;刘焕奇;任庆娜;刘焕珍【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2008(24)7【摘要】构建胸腺肽αl(Thymosinαl,Tαl)基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,为大量获得胸腺肽αl打下基础。

将人工合成的Tαl三串体基因插入到表达载体pET32a后,CaC12法转化大肠杆菌BL21,经氨苄青霉素筛选后用IPTG 诱导表达,SDS-PAGE检测BL21中胸腺肽αl的表达。

大肠杆菌中检测到与目的蛋白相对分子量(31kD)相符的条带。

成功构建了Tαl原核表达载体,该蛋白能在大肠杆菌中表达。

【总页数】4页(P22-25)【关键词】胸腺肽αl;表达载体pET32a;SDS—PAGE【作者】崔雪志;马凤龙;乔彦良;刘焕奇;任庆娜;刘焕珍【作者单位】青岛农业大学动物科技学院;山东信得科技股份有限公司【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定 [J], 邵敏;王新颖;刘星;王燕;周鹤峰;葛正龙2.蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化 [J],乔鑫;王妍;李俊杰;段翠密;王海滨;周瑾;杜芝燕;王常勇;3.蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化 [J], 乔鑫;王妍;李俊杰;段翠密;王海滨;周瑾;杜芝燕;王常勇4.铜绿假单胞菌外膜蛋白Opr Ⅰ原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 刘潇;李文桂;罗广旭5.中介蝮蛇毒纤溶酶基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 刘玉芬;于德涵;刘鹏;陈辉;赵文阁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

DOC-1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

ＤＯＣ－1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化目的：克隆DOC一1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。

方法：从人胎脑组织中提取总RNA，经逆转录－聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增DOC －1的CDS序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1，经酶切、测序鉴定后，用该重组质粒转化E.coliBL21，用IPTG诱导表达，OlutathioneSepharose 4B 柱亲和层析纯化重组蛋白。

结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC－1长度一致，测序结果与GenBank公布的DOC－1基因序列完全一致，IPTG诱导后经SDS—PAGE电泳分析表明，在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带，经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。

结论：成功构建了pGEX-4T-1－DOC－1原核表达载体，表达并纯化出GST－p12重纽蛋白，为进一步研究p12DOC-1蛋白打下了实验基础。

标签：p12DOC-1；蛋白；口腔癌缺失；基因克隆；基因表达癌症作为一类严重威胁人类生命的疾病，已成为医学研究关注的重要课题。

口腔癌和身体其他部位癌一样，其发生、发展亦涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。

DOC－1基因是Todd等(1995)利用叙利亚仓鼠口腔颊癌模型分离的正常和恶性角化细胞进行细胞杂交实验分离和证实的一个候选抑癌基因，作为一个候选抑癌基因它具有以下几个特点：恶性角化细胞杂合性缺失；与正常上皮相比恶性上皮中DOC－1表达降低；DOC－1的转入抑制肿瘤细胞的生长；经转染DOC －1 cDNA的恶性角化细胞在动物模型中逆转了恶性表型。

p12蛋白作为其编码的蛋白因子，具有抑制DNA复制，从而抑制恶性角化细胞的生长，使其表型改变的功能，近来已逐渐成为研究的热点。

为了开展对DOC－1的研究，进一步了解其功能及其在口腔鳞状细胞癌中表达缺失机制中的作用，本实验通过RT—PCR获得DOC－1的eDNA编码区序列，并且构建了其克隆表达载体，在大肠杆菌中实现了p12DOC－1重组蛋白的高表达，为以后的工作打下了实验基础。

生物大分子的高效表达和纯化技术方法

生物大分子的高效表达和纯化技术方法生物大分子包括蛋白质、核酸等，它们是生命体系中非常重要的组成部分。

在研究生物大分子的结构、功能和应用方面，高效的表达和纯化技术是必不可少的。

本文将介绍一些常用的生物大分子表达和纯化方法。

一、蛋白质表达1.原核表达系统原核表达系统是最早被广泛使用的表达系统之一。

它利用细菌如大肠杆菌等在短时间内大量生产蛋白质的特性。

在原核表达系统中，利用载体将目标基因转入到细菌中，并通过诱导蛋白质表达的信号来促进蛋白质的表达。

常用的载体包括pET、pBAD等，其中pET系统是目前应用最广泛的表达载体之一。

它具有高效的启动子和调控子，可促进目标基因的表达。

另外，还可以通过对表达条件的调节，如诱导温度、工艺时间等，提高蛋白质表达量和纯度。

2.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统被广泛应用于生产大规模、高纯度的蛋白质。

这种表达系统利用哺乳动物细胞的生物学特性，如正确的折叠、翻译和修饰等，确保产生的蛋白质与天然的同源物具有相同的结构和活性。

在哺乳动物细胞表达系统中，最常用的载体是pcDNA3.1和pCDNA4。

这些载体中包含了强有力的启动子、Augustus、poly A位点等元素，保证了表达的高效性和稳定性。

另外，还可以通过转染病毒等方法提高蛋白质表达水平。

3.细胞外表达系统细胞外表达系统利用细胞外分泌蛋白质的特性，通过对介质成分的调节实现目标蛋白质的表达。

这种表达系统适用于生产大规模、高质量的蛋白质，尤其是包括人源蛋白质在内的复杂蛋白质。

常用的细胞外表达系统包括言酵母表达系统、巨细胞病毒表达系统等。

在这些系统中，通过调节胞外环境、添加营养物质、选择高产菌株等方法，可以提高蛋白质产量和纯度。

二、蛋白质纯化1.亲和层析法亲和层析法是一种高效的分离纯化方法，它利用具有选择性的亲和剂结合目标蛋白质，从而实现蛋白质的高度分离和纯化。

常用的亲和剂包括Ni-NTA、Protein A、GST等。

原核表达载体构建步骤

原核表达载体构建步骤构建原核表达载体就像是在微观世界里盖房子，而且是给那些超级小的生物分子住的。

咱得先找好“建筑材料”，也就是目的基因啦。

这目的基因就像是一颗特别的种子，我们要把它种到原核生物这个小花园里。

找目的基因有时候就像大海捞针，在基因的海洋里翻来翻去，直到找到那一颗闪闪发光的“金种子”。

然后呢，要有合适的“地盘”，这就是原核表达载体。

这个载体就像是一块神奇的土地，不过它可不是随随便便的土块，而是经过精心设计的，上面有各种功能区域，就像土地上划分好了不同的功能区一样，有启动子区，这就像是房子的大门开关，决定着基因能不能开始工作，还有终止子区，那是工作结束的信号，就像下班的铃声。

接下来要把目的基因和载体连接起来，这过程就像是用超级胶水把种子粘到土地上。

这个胶水就是连接酶啦，它特别神奇，能准确地把基因和载体紧紧地连在一起，就像把两根细细的线完美地缝起来一样。

在这之前，还得对载体和目的基因进行处理，就像给土地松松土，给种子去去壳。

我们要用限制酶在载体和目的基因上切出合适的口子，这限制酶就像一把超级小但无比锋利的剪刀，精确地剪出想要的形状。

构建好之后，还得检查一下有没有问题呀。

这就像是房子盖好了要验收一样。

要看看基因有没有正确地连接，就像检查房子的结构有没有稳固。

有时候如果出了差错，那就像盖歪了房子，一切就得重新来啦。

把构建好的原核表达载体送进原核细胞这个小家园，就像把种好种子的花盆放到温室里。

原核细胞会像勤劳的小园丁一样照顾这个载体，让目的基因开始表达，生产出我们想要的蛋白质。

这蛋白质就像是花朵或者果实，是我们精心构建载体的最终收获。

整个过程充满了各种惊喜和挑战，有时候一个小失误就像在蛋糕里放错了盐，整个味道就全变了。

但当一切顺利的时候，就像是在微观世界里创造了一个小奇迹，那些小小的分子按照我们的意愿开始工作，感觉自己就像一个微观世界的大魔法师呢。

原核表达载体构建虽然复杂又繁琐，但就像一场充满乐趣的微观冒险，每一步都充满了未知和期待。

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化朱海珍;雷少华;刘春艳;焦宇;于晓妍;高益敏【摘要】Based on prokaryotic expression vector pCold TF, a new vectorpL118 was constructed by replacing the His-Tag sequence of the original vector with the restriction enzyme site of Spe I in molecular biological methods. His-Tag sequence was introduced to the 3' end of target gene through PCR primer, and this method facilitated the expression of fusion protein and the removal of solubilization tag from the target protein. The fusion protein human CD81-Trigger Factor (TF) was expressed and purified. Human CD81 protein was obtained by removing the TF solubilization tag by proteinase Factor Xa. The purified human CD81 protein laid the foundation for the selection of targeted drugs, making antibody and exploring the function of CD81. The construction of the new expression vector pL118 and the expression and purification of human CD81 protein have provided a new method for obtaining insoluble protein based on the prokaryotic expression system.%以高效原核表达载体pCold TF为载体骨架,应用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法,将pCold TF中的六聚组氨酸(His-Tag)序列替换为限制性酶切位点Spe Ⅰ序列ACTAGT,构建不含His-Tag序列的新载体pL118.以此载体表达蛋白时,通过PCR引物在目的基因3 '端添加His-Tag 以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Trigger Factor(TF)助溶蛋白的去除.应用pL118对人膜蛋白CD81进行原核表达与纯化,并使用Factor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白,获得3 '端含有His-Tag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化,为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81的功能奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.【期刊名称】《湖南大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(039)008【总页数】5页(P52-56)【关键词】载体;人CD81;蛋白表达;纯化【作者】朱海珍;雷少华;刘春艳;焦宇;于晓妍;高益敏【作者单位】湖南大学生物学院,湖南长沙410082;湖南大学生物学院,湖南长沙410082;湖南大学生物学院,湖南长沙410082;内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头 014000;湖南大学生物学院,湖南长沙410082;湖南大学生物学院,湖南长沙410082【正文语种】中文【中图分类】Q816pCold TF原核表达载体是一种插入蛋白可溶性标签的融合型冷休克表达载体，空载体融合表达的顺序为六聚组氨酸（His－Tag）、Trigger Factor（TF）、蛋白酶切位点和多克隆位点序列.蛋白酶切位点依次为HRV 3Cprotease，Thrombin 和Factor Xa，用于去除融合蛋白的可溶性标签.TF是一种原核的核糖体结合伴侣蛋白，相对分子质量约4.8×104，它能够促进新生肽链的共翻译折叠，与目的蛋白融合表达，提高目的蛋白的可溶性.载体上带有冷休克表达系统，严格控制载体在低温条件下才能表达目的蛋白，进一步促进了目的蛋白的可溶性表达.人CD81是一种四跨膜的非糖基化膜蛋白，由胞内的N端和C端、4个跨膜结构域、胞外小环和胞外大环4部分组成，相对分子质量约2.6×104，在B细胞、T细胞、肝细胞等多种细胞中均有表达.CD81参与细胞的粘附和信号转导，具有影响细胞增殖和分化等生物学功能［1］，是细胞表面的免疫调节分子［2］，并参与丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染宿主细胞，作为HCV的一个受体介导病毒颗粒进入宿主细胞［3］，HCV包膜蛋白E2与CD81胞外大环相互结合实现HCV的感染［4－5］.针对CD81的靶向药物及特异性抗体具有抑制HCV感染的潜在功能［6－7］，人膜蛋白CD81的原核表达与纯化，为今后靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81与HCV之间的关系奠定了基础.pET28b是一种常规的原核表达载体，含有T7启动子、乳糖操纵子和多克隆位点序列等基本功能元件，在蛋白原核表达与纯化实验体系中应用广泛.在预实验中，将人cd81基因克隆到pET28b载体中尝试原核表达，发现没有可溶性目的蛋白的表达.pCold TF不仅有pET28b中的基本功能元件，还包含了冷休克表达系统和TF助溶蛋白，通过严格控制目的蛋白低温表达，以及TF的可溶性标记功能和分子伴侣作用，可以使一些表达困难的基因获得更高概率的可溶性表达.本课题改造pCold TF载体，在保留冷休克及融合表达系统的前提下，去除原载体上的His－Tag序列，一方面提高了人CD81蛋白融合表达的效率和可溶性，另一方面有利于融合蛋白中的TF助溶蛋白的去除，获得不含助溶蛋白标签的全长人CD81蛋白.1 材料与方法1.1 材料大肠杆菌菌株DH5α，BL21（DE3），pET28b质粒，人脾脏cDNA为本室保存；pCold TF质粒，DNA marker和T4连接酶购自宝生物公司（TaKa－Ra）；PCR 试剂盒购自Roche公司；质粒纯化，DNA回收试剂盒，Factor Xa蛋白酶购自QIAGEN公司；限制性内切酶购自Promega公司；Ni－NTA镍离子亲和层析柱购自GE公司；PVDF膜和蛋白marker购自Bio－rad公司；anti－his鼠源单克隆抗体购自天根公司；羊抗鼠二抗购自Invitrogen公司；ECL发光试剂盒购自Thermo公司.1.2 pCold TF载体的改造1.2.1 pCold TF载体的改造方案方案设计的基本原则是使用PCR分别扩增His－Tag前后的部分DNA片段，PCR 产物两端分别带有限制性酶切位点，在His－Tag部分引入一个载体不包含的限制性酶切位点，分别酶切pCold TF质粒和两个PCR产物，再将这3个片段连接成新载体质粒，实现以限制性酶切位点替换His－Tag的目的.在NCBI上获取pCold TF载体序列，经搜索发现271～288位为His－Tag序列，109～114位和699～704位分别为限制性酶切位点NheⅠ和BubⅠ，且NheⅠ和BubⅠ在载体中是单一的酶切位点，因此可用于本载体的改造.PCR扩增109～270位的DNA 片段P1和289～704位的DNA片段P2，并在P1 3′端和P2 5′端的引物中添加限制性酶切位点SpeⅠ.NheⅠ和BubⅠ双酶切pCold TF载体，NheⅠ和SpeⅠ双酶切P1，SpeⅠ和BubⅠ双酶切P2，再将酶切后的载体、P1和P2进行连接，获得重组质粒（图1）.图1 pCold TF载体改造方案图Fig.1 Schematic diagram of vetor modification of pCold TF1.2.2 pCold TF载体的改造方法P1 5′端（NheⅠ）引物：5′－cgcgcgctagcgctagcgcatatccagtgta－3′；P1 3′端（SpeⅠ）引物：5′－ctgcagactagtcactttgtgattcatggtg－3′；P2 5′端（SpeⅠ）引物：5′－cgcgcactagtatgcaagtttcagttgaaaccactc－3′；P2 3′端（BubⅠ）引物：5′－ctgcaggcatgccgtcaacgtca－3′；引物合成与纯化由上海生工公司完成.应用PCR试剂盒扩增目的片段的反应体积为50μL.循环参数为：95℃预变性2min；然后95℃30s，60℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸5min.按照限制性内切酶的使用说明，分别双酶切pCold TF载体、P1和P2，使用T4连接酶将酶切后的片段相连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取生长在平板上的单克隆菌落，培养后提取质粒进行酶切鉴定.1.2.3 pL118载体的酶切鉴定及测序按照限制性内切酶的使用说明，用SpeⅠ单酶切pCold TF和pL118载体，用NheⅠ，SpeⅠ和BbuⅠ三酶切pCold TF和pL118载体，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.使用P1 5′端引物和P2 3′端引物对pL118进行正反测序，由上海生工公司完成.1.3 蛋白的表达与纯化1.3.1 空载体和重组质粒蛋白的表达以人脾脏cDNA为模板，PCR扩增cd81基因的编码序列，将其装入pET28b或pL118载体中.5′端（NdeⅠ）引物：5′－cccatatgggagtggagggctgcaccaa－3′，将其克隆到pET28b载体中的3′端（BamHⅠ）引物：5′－cgggatcctcagtacacggagctgtt－3′，将其克隆到pL118载体中的3′端（PstⅠ和His－Tag）引物：5′－ctgcagctgcagtcagtgatggtgatggtgatggtacacggagctgttc cggat－3′.将需要表达蛋白的质粒转入大肠杆菌菌株BL21（DE3）中，37℃摇菌过夜，次日以1∶50扩大培养至OD值0.6～0.8，25℃诱导pET28b和pET28b－hCD81菌表达12h，16℃诱导pCold TF，pL118和pL118－hCD81表达24h，收集细菌沉淀，用于蛋白纯化或－80℃冻存备用.1.3.2 人CD81蛋白的纯化使用美国GE公司的Ni－NTA镍离子亲和层析柱纯化蛋白，由于pL118－hCD81质粒表达的融合蛋白是可溶性的，因此在非变性条件下（Binding Buffer：20mmol／L磷酸钠，500mmol／L NaCl，5mmol／L咪唑，PH7.4）裂解细菌和纯化目的蛋白.采用溶菌酶超声破碎法裂解细菌，将裂解液上清通过Ni－NTA层析柱后，用Washing Buffer（20mmol／L磷酸钠，500mmol／L NaCl，50mmol／L咪唑，PH7.4）洗涤，最后用Elution Buffer（20mmol／L磷酸钠，500mmol／L NaCl，500mmol／L咪唑，PH7.4）洗脱目的蛋白.收集的Elution Buffer即为目的蛋白，具体操作参照Ni－NTA层析柱使用说明.1.4 Factor Xa蛋白酶切40μL酶切反应体系：10μg融合蛋白，1UFactor Xa蛋白酶，Reaction Buffer至40μL.酶切反应混合液20℃孵育9h，然后混合液在Binding Buffer中透析过夜，再利用Ni－NTA层析柱获取不含TF助溶蛋白的全长人CD81蛋白，过程方法同上述人CD81蛋白的纯化.1.5 Western blot分析细菌裂解液上清或纯化的蛋白进行SDSPAGE，随即将电泳后的蛋白转移到PVDF 膜上，用5%的脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1h，TBST震荡洗涤PVDF膜3次，每次5min.加入1∶1 000稀释的anti－his鼠源单克隆抗体，室温孵育1h，TBST 洗涤3次，每次5min.再用HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次5min.最后用ECL发光试剂显色.2 结果2.1 pL118载体的构建与鉴定以融合型冷休克原核表达载体pCold TF为模板，PCR扩增载体109～270位的DNA片段P1和289～704位的DNA片段P2，载体中271～288位为His－Tag序列，并在P1 3′端和P2 5′端的引物中添加限制性酶切位点SpeⅠ（图1），PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后分别出现约200bp和450bp的特异性条带，与预期P1和P2的大小一致（图2）.P1和P2分别双酶切处理后，与经过NheⅠ和BbuⅠ酶切的pCold TF载体片段连接，获得重组质粒.酶切鉴定结果显示，重组质粒能被SpeⅠ单酶切，pCold TF质粒则不能被酶切.NheⅠ，SpeⅠ和BbuⅠ三酶切重组质粒，出现与P1和P2大小相同的2个DNA片段，而pCold TF质粒只出现大小约650bp的DNA片段（图3）.DNA测序证实，重组质粒100～710位序列中His－Tag序列被限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT替代，其他序列保持不变，获得与设计序列完全一致的质粒，将原质粒和重组质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3），原核表达显示改造前后质粒的表达水平不受影响，均有54ku左右的空载蛋白表达（图4中泳道3和泳道4）.将此新质粒命名为pL118.图2 pCold TF载体中DNA片段P1和P2的PCR产物Fig.2 PCR product of DNA fragment P1and P2in pCold TF图3 pCold TF和pL118质粒酶切鉴定电泳图Fig.3 Gel electrophoresis of plasmids of pCold TF and pL118digested by restriction enzymes图4 目的蛋白原核表达与纯化SDS－PAGE图Fig.4 SDS－PAGE gel of target proteins in prokaryotic expression and purification2.2 人cd81在pL118中融合表达与纯化pL118载体不含His－Tag序列，将cd81基因克隆到该载体时，需要通过PCR引物在基因的3′端添加His－Tag序列，以利于融合蛋白的纯化.将质粒pET28b－hCD81和pL118－hCD81分别转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，考马斯亮蓝染色SDS－PAGE胶上可见pL118－hCD81菌中CD81融合蛋白的可溶性表达，其大小约7.5×104，与理论预期值一致，而pET28b－hCD81菌则没有表达（图4中泳道2和泳道5）.应用Ni－NTA层析柱对CD81融合蛋白进行非变性蛋白纯化，在7.5×104处得到特异的蛋白条带（图4中泳道7）.2.3 蛋白酶切去除TF助溶蛋白应用pL118载体原核表达获得的人CD81融合蛋白包含4部分，即TF助溶蛋白、蛋白酶切位点、CD81蛋白和His－Tag.为了去除TF助溶蛋白，使用Factor Xa蛋白酶对CD81融合蛋白进行酶切，即可将CD81融合蛋白分成TF助溶蛋白和CD81蛋白2个部分，再将酶切后的蛋白混合液通过Ni－NTA层析柱，利用Ni－NTA层析柱对CD81蛋白3′末端His－Tag的亲和性，实现TF助溶蛋白和CD81蛋白的分离，获得3′端含有His－Tag的全长人CD81蛋白（图5）.图5 Western blot鉴定CD81融合蛋白的蛋白酶切及CD81蛋白的回收纯化Fig.5 Western blot analysis of protease cleavage of CD81 fusion protein and purification of CD81protein3 讨论pCold TF载体拥有冷休克表达系统和TF助溶蛋白，一些表达困难的基因在pCold TF中有更高概率的可溶性表达.但是目的基因在pCold TF中表达得到的融合蛋白含有4.8×104的TF助溶蛋白标签，标签的分子质量偏大，对目的蛋白结构及功能有较大的影响，而去除TF却不方便，因为融合蛋白表达的顺序为His－Tag、TF助溶蛋白、蛋白酶切位点、目的蛋白，利用蛋白酶对融合蛋白进行酶切后，目的蛋白将和His－Tag、TF助溶蛋白分开成为两个蛋白片段，目的蛋白不含His－Tag，不利于目的蛋白的再回收.本文对pCold TF载体进行改造，使之不含His－Tag序列，将目的基因克隆到该载体时，通过在目的基因3′端引物添加His －Tag序列，其融合蛋白表达的顺序为TF助溶蛋白、蛋白酶切位点、目的蛋白、His－Tag，其中His－Tag不仅可用于融合蛋白的纯化，也可用于融合蛋白酶切后目的蛋白的纯化，因为His－Tag仍然保留在目的蛋白上，也可作为标签用于Western blot中目的蛋白的检测，以及结合在Ni－NTA等载体上，用于进一步目的蛋白功能研究和特异性药物筛选等.通过对pCold TF载体序列中限制性酶切位点的分析，发现位于His－Tag序列前端的NheⅠ和后端的BubⅠ是载体中单一的酶切位点，且载体不含酶切位点SpeⅠ.通过设计特定的PCR引物，并运用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法，成功去除pCold TF载体中的His－Tag序列，并且不影响原载体的蛋白表达能力，将此新质粒命名为pL118.pL118继承了原载体高效蛋白可溶性表达的优点，并使之有利于去除融合蛋白中的TF助溶蛋白，将His－Tag保留在目的蛋白上.在应用pL118表达融合蛋白时要特别注意的是：在目的基因3′端引物引入His－Tag序列时，将Hig－Tag序列放置在目的基因的编码序列和终止密码子之间，如果His－Tag序列放置在终止密码子之后，融合蛋白的表达将提前终止而不含His－Tag.膜蛋白具有多种多样的细胞功能，是基础研究及药物开发的理想靶标，然而研究膜蛋白有一个难题，它们的过表达对宿主有毒性而限制蛋白产量，或产生包涵体增加纯化难度.人CD81是一种四跨膜蛋白，将其克隆到pET28b载体中尝试原核表达，发现没有可溶性目的蛋白的表达，关于CD81原核表达的文献报道也集中于CD81胞外大环可溶片段的表达.CD81参与细胞的粘附和信号转导，具有影响细胞增殖和分化等生物学功能，是细胞表面的免疫调节分子，并作为受体介导HCV感染宿主细胞.近期有报道称，CD81不仅是HCV感染中的一个受体，还可影响HCV RNA的复制［8］，或通过激活细胞的Raf／MEK／ERK信号通路而影响HCV在宿主细胞中的生活周期［9］，在慢性丙型肝炎病人的血清中，可溶性的CD81蛋白水平升高，并参与病人肝纤维化的形成［10］，因此对CD81的进一步研究具有重要的理论与实践意义.4 结语本文将CD81克隆到pL118载体中，实现了CD81融合蛋白高效可溶性表达，使用Ni－NTA亲和层析柱对融合蛋白纯化，再利用Factor Xa蛋白酶去除TF助溶蛋白，成功获得含有His－Tag的全长CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化证实了pL118载体使表达困难的基因获得更高概率的可溶性表达，为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81与HCV之间的关系奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化方法具有一定的创新性，为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.参考文献［1］ LEVY S，TODD S C，MAECKER H T.CD81（TAPA－1）：a molecule involved in signal transduction and cell adhesion in the immune system ［J］.Annu Rev Immunol，1988，16：89－109.［2］ LEVY S，SHOHAM T.The tetraspanin web modulates immune－signalling complexes［J］.Nat Rev Immunol，2005，5（2）：136－148. ［3］ PILERI P，UEMATSU Y，CAMPAGNOLI S，et al.Binding of hepatitis C virus to CD81［J］.Science，1988，282（5390）：938－941.［4］ FLINT M，MAIDENS C，LOOMIS－PRICE L D，et al.Characterizationof hepatitis C virus E2glycoprotein interaction with aputative cellular receptor，CD81［J］.J Virol，1999，73（8）：6235－6244.［5］ PETRACCA R，FALUGI F，GALLI G，et al.Structure－function analysis of hepatitis C virus envelope－CD81binding［J］.J Virol，2000，74（10）：4824－4830.［6］ STAMATAKI Z，GROVE J，BALFE P，et al.Hepatitis C virus entry and neutralization［J］.Clin Liver Dis，2008，12（3）：693－712.［7］ ASHFAQ U A，QASIM M，YOUSAF M Z，et al.Inhibition of HCV3agenotype entry through Host CD81and HCV E2 antibodies［J］.J Transl Med，2011，9：194.［8］ ZHANGY Y Y，ZHANG B H，LSHII K，et al.Novel function of CD81in controlling hepatitis C virus replication［J］.J Virol，2010，84（7）：3396－3407.［9］ BRAZZOLI M，BIANCHI A，FILIPPINI S，et al.CD81is a centralregulator of cellular events required for hepatitis C virus infection of human hepatocytes［J］.J Virol，2008，82（17）：8316－8329.［10］WELKER M W，REICHERT D，SUSSER S，et al.Soluble serum CD81is elevated in patients with chronic hepatitis C and correlates with alanine aminotransferase serum activity［J］.PLoS One，2012，7（2）：e30796.。

重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定

重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定何贤辉;徐丽慧;刘毅;杜丽蕊【期刊名称】《免疫学杂志》【年(卷),期】2006(22)2【摘要】目的构建人CD40胞外结构域(exCD40)的原核表达载体,获得可溶性产物。

方法以RT-PCR方法从人白细胞总RNA中扩增编码CD40胞外区的cDNA,构建羧基端融合His6标签的exCD40的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对表达产物进行复性、纯化和鉴定。

结果构建了exCD40的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高表达,Mr为23 000,与理论大小相符,表达产物主要存在于包涵体中,经Ni2+-NTA柱上复性和纯化获得纯度达95%的可溶性exCD40蛋白,该蛋白能与细胞上的CD40L结合。

结论从大肠杆菌中成功获得具有配基结合活性的可溶性exCD40蛋白。

【总页数】4页(P195-198)【关键词】CD40;原核表达;包涵体;复性【作者】何贤辉;徐丽慧;刘毅;杜丽蕊【作者单位】暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室;暨南大学生物工程研究所【正文语种】中文【中图分类】R392.12;Q78【相关文献】1.重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定 [J], 尹凤红;肖清江;周卫东;陈清西2.重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定 [J], 林辉煌;刘春凤;尹凤红;丁玉梅;陈清西3.重组人ASCT2胞外结构域ECL2在大肠杆菌中的表达及其鉴定 [J], 欧阳东云;徐丽慧;高琦;郭贺;陈清;何贤辉4.重组人βNGF 在大肠杆菌中的可溶表达、纯化及活性鉴定 [J], 白羊;陈星;章永垒;邹有土;黄奋飞;陈胜亮;阮卡;葛平辉;马燕玲;王明灶5.B36-12 重组人可溶性Fas配基在大肠杆菌中的表达、纯化、重折叠和表征Sun KH等 [J], 龚家玮;胡又佳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

第29卷第5期2008年10月西安交通大学学报(医学版)Jo ur nal of X i an Jiao to ng U niv ersity (M edical Scie nce s)V ol.29N o.5O ct.2008Apoptin 原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达王健生1,张明鑫1,段小艺2,王峥4,周苏娜1,张广健3,王全颖5,杨广笑5(1.西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科;2.西安交通大学医学院第一附属医院核医学科;3.西安交通大学医学院第一附属医院胸外科,陕西西安 710061;4.四川大学华西医院,四川成都 610041;5.西安华广生物工程公司,陕西西安 710025)摘要:目的构建A poptin 的原核表达载体,并制备抗原物质A poptin 融合蛋白。

方法在获得A poptin 融合基因的基础上,成功构建了Apo ptin 的高效原核表达载体pET 28a(+) A po ptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中,以IPT G 对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。

结果转化有Apoptin 的原核表达载体pET 28a(+) Apoptin 的大肠杆菌E.coli BL 21(DE3)经IP T G 诱导后,经SDS P AG E 分析,在相对分子质量约17000的位置出现目的蛋白条带,大小与A po ptin 融合蛋白一致。

结论 Apo ptin 原核表达载体pET 28a (+) Apoptin 能够表达出A po ptin 融合蛋白,为进一步的Apoptin 研究和制备Apoptin 抗体奠定了基础。

关键词:A poptin;原核表达载体;pET 28a(+);大肠杆菌中图分类号:Q 786 文献标识码:A 文章编号:1671 8259(2008)05 0496 03Constru ction of a prokaryotic expression vector forApoptin and expression in E.coliWang Jiansheng 1,Zhang M ingx in 1,Duan Xiaoyi 2,Wang Zheng 4,Zhou Suna 1,Zhang Guangjian 3,Wang Quanying 5,Yang Guangx iao 5(1.Department of Oncolog y Surg er y;2.Department of Nuclear M edicine;3.Departm ent of T horacic Surgery,the First Affiliated H ospital,M edical School of Xi an Jiao to ng U niversity,Xi an 710061; 4.West China H o spital,Sichuan U niversity,Chengdu 610041; 5.Xi an H uag uang Bioengineering Com pany,Xi an 710025,China)ABSTRAC T:Objective T o c onstr uct an Apo ptin pr o kar yo tic vec tor ,aiming to pr o duce antig enic fusio n pr o teinApo ptin.Methods The Apo ptin gene w as amplified fr o m the te mplate o f plasmid pSSC HG /N T 4A poptin HA 2 TA T by PCR.T he A po ptin w as sub cloned into the m ultiple c lo ne sites o f plasmid pET 28a (+)to g et the pr o kary ot ic ve ctor o f pET 28a (+) Apo ptin,which w as tr ansf o rmed into E.coli BL21(D E3).Ex pr essio n o f E.co li BL 21(D E3)was induced by IP TG.T he specific pr ote in expr ession wa s detec ted by SD S PAG E.Results T hefusio n pr ote in w as ex pr esse d with high ef fic iency in E.coli BL21(DE3)tra nsfo rm ed by pET 28a (+) Apo ptin afte r induction w ith I PT G.T he specific f usio n pr ote in had an appar ent r elated molecular weight o f about 17000ku as indicate d by SD A PAG E analysis.Conclusion T he Apo ptin pro kar yo tic ex pressio n vecto r with pET 28a (+)Apo ptin can ef fect ive ly e xpre ss Apo ptin fusion pr o tein,lay ing a f o undatio n fo r f ur ther study o f A poptin and pr epar ation o f a nt ibodies ag ainst A po pt in.KEY WORDS:Apo pt in;pr okar y otic expr essio n v ecto r;pET 28a (+); E.co li 收稿日期:2008 04 16 修回日期:2008 06 30基金项目:教育部博士点专项科研基金赞助项目(No.20060698055)作者简介:王健生(1970 ),男(汉族),教授,博士生导师.主要从事肿瘤临床与基础研究.E m ail:w an gjsh@mail.x 目的基因或载体对正常组织的毒性和肿瘤细胞对治疗的耐受等是限制肿瘤基因治疗临床应用的瓶颈。

人B7h基因原核表达载体的构建和表达的开题报告

人B7h基因原核表达载体的构建和表达的开题报告1. 研究背景和意义基因表达载体是生物技术领域中重要的工具，可以用于基因转染、基因治疗和基因编辑等研究方向。

B7-H家族成员是一类共刺激分子，在肿瘤免疫疗法和移植免疫方面有重要作用。

当前，研究B7-H分子的功能和调控机制已成为免疫治疗领域的热点问题之一。

在此背景下，构建一个高效的原核表达载体是必要的。

2. 研究内容和方法（1）选择适合的重组质粒载体。

在构建原核表达载体时，选择适合的质粒非常重要。

根据目的和实验条件，选择pET 系列、pGEX 系列或者 pMAL 系列等重组质粒，同时还要考虑表达宿主菌株和打靶蛋白的产量等因素。

（2）选取适合的宿主菌株。

在原核表达中，一般选择大肠杆菌作为宿主菌株，因为其易于培养和大量生产。

在菌株选取中，还要注意质粒的拷贝数、菌株生长速度和表达产物的稳定性。

（3）扩增目的基因。

获取目的基因需要进行PCR扩增。

在PCR反应中，应根据目的基因的大小、GC含量等因素，合理设置反应体系，同时需要对PCR产物进行分离纯化。

（4）将目的基因克隆到载体中。

构建目的载体需要进行双酶切和连接，通过T4 DNA连接酶、限制酶和琼脂糖凝胶电泳等技术进行原核表达载体的构建。

（5）转染表达宿主菌株。

将构建好的重组质粒转染大肠杆菌中，并通过平板筛选、PCR等方法鉴定获得含有目的基因的表达宿主菌株。

（6）表达和纯化目的蛋白。

在菌株表达达到最优条件时，通过感光性吸附树脂、金属离子亲和树脂、凝胶过滤等不同的分离纯化方法获得目的蛋白。

3. 预期结果通过以上研究内容和方法，预期可以成功构建出一个高效的原核表达载体，实现目的基因在大肠杆菌中的表达。

同时，可以获得表达产物，通过不同的纯化方法获得目的蛋白，为后续的功能研究提供基础支持。

4. 参考文献1. Huang R, et al. B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer. Lung cancer, 2009.2. Huang R, et al. B7-H4 overexpression potentiates immune evasion of cancer cells. Cancer biomedicine, 2014.3. Kretz-Rommel A, et al. B7-H3 and B7-H4 expression in glioblastomas: correlation with tumor proliferation and patient survival. Clinical Cancer Research, 2004.。

如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆

如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆？影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。

一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。

根据载体复制的特点，可分为严谨型和松弛型。

严谨型载体伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主中拷贝数很少（1~3个）；松弛型的复制而不依赖于宿主染色体，在宿主细胞中的拷贝数可多达3000个。

2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。

而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。

3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。

4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。

阻遏子的阻遏作用可由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。

因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖。

而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。

例如可使宿主细胞快速生长增殖到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时可减少表达产物的降解。

5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。

同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。

诱导表达时，由于强终止子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。

因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。

6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。

二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。

启动子是在转录水平上影响基因表达。

转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。