钙调蛋白激酶_信号转导途径在血管_省略_张素_致心肌肥大反应中的调控作用_王岚
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1 材料与方法
1. 1 材料
出生 3 d 以内的 SD 大鼠, 雌雄不拘, 由华中科 技大学同济医学院实验动物学部提供。试剂: 缬沙 坦由诺华公司提供; 胰蛋白酶、5c- 溴脱氧尿苷 ( Brdu) 、Ang Ò由 Sigma 公司提供; 胎牛血清、DM EM 培养液、Ñ 型胶原酶, T rizol 试剂盒由 Gibco 公司提 供; 羊抗大鼠 CA M K ÒDIgG , 小鼠抗 G A PDH 单克 隆一抗( 美国 Sant a Cruz 公司) , 相 应二抗( 北京中 山生物技术有限公司) , ECL 增强型化学发 光显色 试剂( 美国 P ier ce 公司) , RT- PCR 试剂盒( P romag e 公司) ; 3H- 亮氨酸 ( L eu) 由中国原子能科学 研究院 提供; 其他试剂均为国产分析纯。
第 38 卷第 1 期第 27 页 2009 年 2 月
华中科技大学学报( 医学版) A ct a M ed U ni v Sci T echnol H uaz hong
V ol. 38 N o. 1 P. 27 Feb. 2009
钙调蛋白激酶 Ò信号转导途径在血管紧张素 Ò 致心肌肥大反应中的调控作用*
王 岚1
吕家高2 v
张存泰2 v
程 冕2
刘 念2
阮燕菲2
王 琳2
1 武汉市普爱医院心内科, 武汉 430033 2 华中科技大学同济医学院附属同济医 院心内科, 武汉 430030
摘要 目的 研究钙调蛋白激酶 Ò ( CAM K Ò ) 途径 在血 管紧张 素 Ò ( Ang Ò ) 诱 导乳 鼠心肌 细胞 肥大 反应中 的作 用。方法 原代培养乳鼠心肌细胞, 分为对照组( 不加任何干预因素) , 肥厚组 ( A ng Ò刺激心肌 细胞肥大) , 缬沙坦组( 缬 沙坦直接作用于心肌细胞) 和预处理组( 缬沙坦进行干预 30 min 后, 加入 Ang Ò 刺激心肌细胞) 。测定 心肌细胞3 H- 亮氨 酸掺入作为心肌细胞肥大的指 标; 用 RT- P CR 和 W estern blot 法检测心肌 细胞 CA M K Ò D的 mRN A 和蛋白质 表达的水 平。结果 ¹ A ng Ò 在 10- 9 ~ 10- 6 mol/ L 范围内剂量依赖性地增加乳鼠心肌细胞的3 H- 亮氨酸掺入。选择 10- 7 mol/ L A ng Ò 作用心肌细胞 48 h 为成功的心肌细胞肥厚 模型。 º A ng Ò ( 10- 7 mo l/ L ) 处 理心肌细 胞 48 h, 可使3 H- 亮氨酸 掺入明显增加, 该作用可被缬沙坦明显抑制。 » 与对照组相比, 肥 厚组心肌 的 CA M K Ò DmRN A 水平显 著增加; 而缬沙 坦预处理组较之肥厚组则显著下降。 ¼与对照组相比, 肥厚组心肌的 CA M K ÒD的蛋白质表达显著增加; 而缬 沙坦预处 理组的 CA M K Ò D蛋白质表达水平较之肥 厚组则显著下降。结论 ¹ CAM K Ò 信号转导 通ຫໍສະໝຸດ Baidu激活是 A ng Ò 介 导的心肌 肥大反应重要环节之一。 º 缬沙坦抑制 Ang Ò 介导心肌肥大反应的机制可 能部分是通 过抑制 CA M K Ò D的表 达而实现 的。
1. 4 心肌细胞3H- 亮氨酸掺入测定
按上述分 组加入 不同干 预药 物时, 按 3. 7 @ 1010 mBq/ L 培养液加入3 H- L eu, 培养 48 h 后, 收集 细胞于玻璃纤维素膜上, 以三氯乙酸固定, 洗去游离 的同位素标记物。滤膜烘干后置于含 5 ml 闪烁液 的闪烁瓶中, 以 L S3801 液体闪烁仪( Beckman) 测定 放射强度( cpm / w ell) 。
Key words calmo dulin kinase Ò ; car diomyo cyte hypertr ophy; ang iot ensin Ò ; v alsart an
心肌肥厚是临床上许多心血管疾病共有的病理
* 国家自然科学基金资助项目( N o. 30470714) 王 岚, 女, 1979 年生, 博士研究生 v 通讯作者, Corres pon ding aut h or, E- mail : ct zhang@ t jh . t jmu. edu. cn; luji agao@ tj h. t jmu. edu . cn
关键词 钙调蛋白激酶 Ò; 心肌细胞肥大; 血管紧张素 Ò; 缬沙坦 中图法分类号 R54 DOI: 10. 3870/ j. issn. 1672- 0741. 2009. 01. 007
Calmodulin Kinase Ò Regulates the Cardiomyocyte Hypertrophic Responses Induced by Angiotensin Ò
过程, 心肌肥厚患者中心脏性猝死的发生率远高于 正常人群, 而心脏性猝死与室性心律失常的发生密 切相关。目前 的研 究表 明: 在肥 厚 心肌 中, Ca2+ / CaM 依赖 的钙调 蛋白 激酶 Ò ( calmodulin kinase Ò, CAMK Ò) 的活性明显上调, 抑制 CAM K Ò活性
1. 3 实验分组
按上述方法培养心肌细胞 48 h 后, 换无血清培 养液, 再培养 24 h 后, 按以下分组加入不同干扰因 素进行实验, 每组 10 例。实验分组: ¹ 对照组( 无 血清组) : 心肌细胞培养液中不加干预因素; º Ang
Ò组: 分别加入 A ng Ò10- 9 ~ 10- 6 mo l/ L ; » 缬沙坦 组: 缬沙坦 10- 6 m ol/ L ; ¼缬沙坦预处理组: 加入缬 沙坦 10- 6 m ol/ L 预 处理 30 m in 后, 加 入 A ng Ò 10- 7 m ol/ L , 继续培养 48 h。
Univ ers ity of Science and T echnolog y , Wuhan 430030
Abstract Objective T o inv estigate the regulator y ro le of calmodulin kinase Ò ( CA M K Ò ) in cardiomy ocyte hypertr ophic respo nse induced by ang io tensin Ò ( A ng Ò ) . Methods Cultured cells derived fr om neo natal hear t w ere divided into 4 gr oups: ( 1) nor ma l contro l; ( 2) hypert rophic g roup: cells wer e stimulated by Ang Ò ( 10- 7 mo l/ L) ; ( 3) valsar tan gr oup: cells wer e treated with v alsar tan ( 10- 6 mol/ L ) , and ( 4) pr et reatment g r oup: cells wer e t reated w ith valsartan 30 min before adding Ang Ò . N eonatal r at car dio myo cy te hy per tro phic response was assay ed by 3 H- L eucine inco rporat ion. T he g ene ex pr ession o f CA M K Dw as detected by RT- P CR and W ester n blot . Results A ng Ò promo ted 3H- L eucine inco rpor ation in a dose- dependent manner between 10- 9 - 10- 6 mol/ L . Cells treated w ith ang Ò at 10- 7 mo l/ L for 48 h w ere chosen as hypertr ophic cardiocy te model. Calmodulin kinase signaling might be the candidate t arg et fo r ther apy o f hy per tro phy and arr hy thmias. T he mRN A level of CA M K ÒDw as sig nificant ly increased in t he hy per tro phic g ro up as compar ed w ith nor mal co ntr ol and pretr eatment gr oups. T he pr otein lev el o f CA M K Ò D was sig nificantly incr eased in the hy per tro phic g ro up as co mpar ed w ith no rmal contro l and pret reatment gr oups. Conclusion T he activat ion of CA M K Ò played an impo rtant ro le in cardiom yocy tes hy pert ro phy induced by Ang Ò . V alsa rtan pr evented the hypertr ophy of car dio myo cy tes induced by A ng Ò partially by inhibiting the expressio n o f CA M K Ò D.
Wang L an1 , L Jiag ao2 v , Zhang Cunt ai2 v et al
1 D ep ar tment of Car diology , P uai H osp ital , Wuhan 430033 2 D ep ar tment of Car diology , T ongj i H osp ital , T o ngj i M edical College , H uaz hong
1. 2 心肌细胞培养
取 1~ 3 d SD 乳鼠, 在无菌条件下取出心室, 剪 成约 1 mm3 大小碎块, 加入 0. 1% 胰酶 5 m l, 37 e 吹 打消化 5 m in, 弃上清。再加入 0. 1% 胶原酶消化 4 ~ 5 min, 取上清, 加含 10% 小牛血清的 DM EM 培 养液, 离心( 1 000 r/ min, 10 min, 4 e ) , 弃上清液。 同条件下重复消化 6~ 8 次, 至无肉眼可见的组织块 为止。收集细胞, 加入含 10% 小牛血 清的 DM EM 培养, 分装入 50 m l 培养瓶中, 置 37 e , 5% CO 2 培 养箱中单层贴壁培养, 用 1 h 差速贴壁法分离心肌 细胞和非心 肌细胞, 将心肌 细胞用 10% 小牛血 清 DEME 液配成 1 @ 106/ ml 均匀地接种于 6 孔板上, 每孔 2 ml。在心 肌细胞培 养的最初 2 d 内加 0. 1 mmo l/ L 的 BrdU , 以抑制非心肌细胞的生长。
# 28 #
华中科技大学学报( 医学版) 2009 年 2 月第 38 卷第 1 期
及表达可不同程度地减少心肌肥厚形成, 改善心功 能及降 低肥 厚 心肌 恶 性心 律失 常 甚 至猝 死 的 发 生[ 1-3] 。可见 CA M K Ò信号转导途径在肥厚心肌心 律失常发生中起着相当重要的作用。但血管紧张素 Ò( Ang Ò) 的致心律失常和心肌肥厚作用是否与激 活 CA MK Ò信号转导系统有关, 血管紧张素 Ò 受 体拮抗剂( ARB) 等逆转心肌肥厚和降低心 律失常 发生率的特性是否与抑制过度激活的 CAM K Ò信 号系统相关联, 目前国内外未见报道。本研究利用 培养的新生大鼠心肌细胞, 从细胞水平探讨 CAMK Ò信号转导途径在 Ang Ò诱导乳鼠心肌细 胞肥大 反应以及 ARB 抑制肥大反应中的作用。
1. 1 材料
出生 3 d 以内的 SD 大鼠, 雌雄不拘, 由华中科 技大学同济医学院实验动物学部提供。试剂: 缬沙 坦由诺华公司提供; 胰蛋白酶、5c- 溴脱氧尿苷 ( Brdu) 、Ang Ò由 Sigma 公司提供; 胎牛血清、DM EM 培养液、Ñ 型胶原酶, T rizol 试剂盒由 Gibco 公司提 供; 羊抗大鼠 CA M K ÒDIgG , 小鼠抗 G A PDH 单克 隆一抗( 美国 Sant a Cruz 公司) , 相 应二抗( 北京中 山生物技术有限公司) , ECL 增强型化学发 光显色 试剂( 美国 P ier ce 公司) , RT- PCR 试剂盒( P romag e 公司) ; 3H- 亮氨酸 ( L eu) 由中国原子能科学 研究院 提供; 其他试剂均为国产分析纯。
第 38 卷第 1 期第 27 页 2009 年 2 月
华中科技大学学报( 医学版) A ct a M ed U ni v Sci T echnol H uaz hong
V ol. 38 N o. 1 P. 27 Feb. 2009
钙调蛋白激酶 Ò信号转导途径在血管紧张素 Ò 致心肌肥大反应中的调控作用*
王 岚1
吕家高2 v
张存泰2 v
程 冕2
刘 念2
阮燕菲2
王 琳2
1 武汉市普爱医院心内科, 武汉 430033 2 华中科技大学同济医学院附属同济医 院心内科, 武汉 430030
摘要 目的 研究钙调蛋白激酶 Ò ( CAM K Ò ) 途径 在血 管紧张 素 Ò ( Ang Ò ) 诱 导乳 鼠心肌 细胞 肥大 反应中 的作 用。方法 原代培养乳鼠心肌细胞, 分为对照组( 不加任何干预因素) , 肥厚组 ( A ng Ò刺激心肌 细胞肥大) , 缬沙坦组( 缬 沙坦直接作用于心肌细胞) 和预处理组( 缬沙坦进行干预 30 min 后, 加入 Ang Ò 刺激心肌细胞) 。测定 心肌细胞3 H- 亮氨 酸掺入作为心肌细胞肥大的指 标; 用 RT- P CR 和 W estern blot 法检测心肌 细胞 CA M K Ò D的 mRN A 和蛋白质 表达的水 平。结果 ¹ A ng Ò 在 10- 9 ~ 10- 6 mol/ L 范围内剂量依赖性地增加乳鼠心肌细胞的3 H- 亮氨酸掺入。选择 10- 7 mol/ L A ng Ò 作用心肌细胞 48 h 为成功的心肌细胞肥厚 模型。 º A ng Ò ( 10- 7 mo l/ L ) 处 理心肌细 胞 48 h, 可使3 H- 亮氨酸 掺入明显增加, 该作用可被缬沙坦明显抑制。 » 与对照组相比, 肥 厚组心肌 的 CA M K Ò DmRN A 水平显 著增加; 而缬沙 坦预处理组较之肥厚组则显著下降。 ¼与对照组相比, 肥厚组心肌的 CA M K ÒD的蛋白质表达显著增加; 而缬 沙坦预处 理组的 CA M K Ò D蛋白质表达水平较之肥 厚组则显著下降。结论 ¹ CAM K Ò 信号转导 通ຫໍສະໝຸດ Baidu激活是 A ng Ò 介 导的心肌 肥大反应重要环节之一。 º 缬沙坦抑制 Ang Ò 介导心肌肥大反应的机制可 能部分是通 过抑制 CA M K Ò D的表 达而实现 的。
1. 4 心肌细胞3H- 亮氨酸掺入测定
按上述分 组加入 不同干 预药 物时, 按 3. 7 @ 1010 mBq/ L 培养液加入3 H- L eu, 培养 48 h 后, 收集 细胞于玻璃纤维素膜上, 以三氯乙酸固定, 洗去游离 的同位素标记物。滤膜烘干后置于含 5 ml 闪烁液 的闪烁瓶中, 以 L S3801 液体闪烁仪( Beckman) 测定 放射强度( cpm / w ell) 。
Key words calmo dulin kinase Ò ; car diomyo cyte hypertr ophy; ang iot ensin Ò ; v alsart an
心肌肥厚是临床上许多心血管疾病共有的病理
* 国家自然科学基金资助项目( N o. 30470714) 王 岚, 女, 1979 年生, 博士研究生 v 通讯作者, Corres pon ding aut h or, E- mail : ct zhang@ t jh . t jmu. edu. cn; luji agao@ tj h. t jmu. edu . cn
关键词 钙调蛋白激酶 Ò; 心肌细胞肥大; 血管紧张素 Ò; 缬沙坦 中图法分类号 R54 DOI: 10. 3870/ j. issn. 1672- 0741. 2009. 01. 007
Calmodulin Kinase Ò Regulates the Cardiomyocyte Hypertrophic Responses Induced by Angiotensin Ò
过程, 心肌肥厚患者中心脏性猝死的发生率远高于 正常人群, 而心脏性猝死与室性心律失常的发生密 切相关。目前 的研 究表 明: 在肥 厚 心肌 中, Ca2+ / CaM 依赖 的钙调 蛋白 激酶 Ò ( calmodulin kinase Ò, CAMK Ò) 的活性明显上调, 抑制 CAM K Ò活性
1. 3 实验分组
按上述方法培养心肌细胞 48 h 后, 换无血清培 养液, 再培养 24 h 后, 按以下分组加入不同干扰因 素进行实验, 每组 10 例。实验分组: ¹ 对照组( 无 血清组) : 心肌细胞培养液中不加干预因素; º Ang
Ò组: 分别加入 A ng Ò10- 9 ~ 10- 6 mo l/ L ; » 缬沙坦 组: 缬沙坦 10- 6 m ol/ L ; ¼缬沙坦预处理组: 加入缬 沙坦 10- 6 m ol/ L 预 处理 30 m in 后, 加 入 A ng Ò 10- 7 m ol/ L , 继续培养 48 h。
Univ ers ity of Science and T echnolog y , Wuhan 430030
Abstract Objective T o inv estigate the regulator y ro le of calmodulin kinase Ò ( CA M K Ò ) in cardiomy ocyte hypertr ophic respo nse induced by ang io tensin Ò ( A ng Ò ) . Methods Cultured cells derived fr om neo natal hear t w ere divided into 4 gr oups: ( 1) nor ma l contro l; ( 2) hypert rophic g roup: cells wer e stimulated by Ang Ò ( 10- 7 mo l/ L) ; ( 3) valsar tan gr oup: cells wer e treated with v alsar tan ( 10- 6 mol/ L ) , and ( 4) pr et reatment g r oup: cells wer e t reated w ith valsartan 30 min before adding Ang Ò . N eonatal r at car dio myo cy te hy per tro phic response was assay ed by 3 H- L eucine inco rporat ion. T he g ene ex pr ession o f CA M K Dw as detected by RT- P CR and W ester n blot . Results A ng Ò promo ted 3H- L eucine inco rpor ation in a dose- dependent manner between 10- 9 - 10- 6 mol/ L . Cells treated w ith ang Ò at 10- 7 mo l/ L for 48 h w ere chosen as hypertr ophic cardiocy te model. Calmodulin kinase signaling might be the candidate t arg et fo r ther apy o f hy per tro phy and arr hy thmias. T he mRN A level of CA M K ÒDw as sig nificant ly increased in t he hy per tro phic g ro up as compar ed w ith nor mal co ntr ol and pretr eatment gr oups. T he pr otein lev el o f CA M K Ò D was sig nificantly incr eased in the hy per tro phic g ro up as co mpar ed w ith no rmal contro l and pret reatment gr oups. Conclusion T he activat ion of CA M K Ò played an impo rtant ro le in cardiom yocy tes hy pert ro phy induced by Ang Ò . V alsa rtan pr evented the hypertr ophy of car dio myo cy tes induced by A ng Ò partially by inhibiting the expressio n o f CA M K Ò D.
Wang L an1 , L Jiag ao2 v , Zhang Cunt ai2 v et al
1 D ep ar tment of Car diology , P uai H osp ital , Wuhan 430033 2 D ep ar tment of Car diology , T ongj i H osp ital , T o ngj i M edical College , H uaz hong
1. 2 心肌细胞培养
取 1~ 3 d SD 乳鼠, 在无菌条件下取出心室, 剪 成约 1 mm3 大小碎块, 加入 0. 1% 胰酶 5 m l, 37 e 吹 打消化 5 m in, 弃上清。再加入 0. 1% 胶原酶消化 4 ~ 5 min, 取上清, 加含 10% 小牛血清的 DM EM 培 养液, 离心( 1 000 r/ min, 10 min, 4 e ) , 弃上清液。 同条件下重复消化 6~ 8 次, 至无肉眼可见的组织块 为止。收集细胞, 加入含 10% 小牛血 清的 DM EM 培养, 分装入 50 m l 培养瓶中, 置 37 e , 5% CO 2 培 养箱中单层贴壁培养, 用 1 h 差速贴壁法分离心肌 细胞和非心 肌细胞, 将心肌 细胞用 10% 小牛血 清 DEME 液配成 1 @ 106/ ml 均匀地接种于 6 孔板上, 每孔 2 ml。在心 肌细胞培 养的最初 2 d 内加 0. 1 mmo l/ L 的 BrdU , 以抑制非心肌细胞的生长。
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华中科技大学学报( 医学版) 2009 年 2 月第 38 卷第 1 期
及表达可不同程度地减少心肌肥厚形成, 改善心功 能及降 低肥 厚 心肌 恶 性心 律失 常 甚 至猝 死 的 发 生[ 1-3] 。可见 CA M K Ò信号转导途径在肥厚心肌心 律失常发生中起着相当重要的作用。但血管紧张素 Ò( Ang Ò) 的致心律失常和心肌肥厚作用是否与激 活 CA MK Ò信号转导系统有关, 血管紧张素 Ò 受 体拮抗剂( ARB) 等逆转心肌肥厚和降低心 律失常 发生率的特性是否与抑制过度激活的 CAM K Ò信 号系统相关联, 目前国内外未见报道。本研究利用 培养的新生大鼠心肌细胞, 从细胞水平探讨 CAMK Ò信号转导途径在 Ang Ò诱导乳鼠心肌细 胞肥大 反应以及 ARB 抑制肥大反应中的作用。