生物样品中六种抗凝血鼠药的测定

1.2 储备溶液配制
准确称取各种标准品 0.00500g 至 10.0 mL 容量瓶，甲醇定容至刻度，单标溶液浓度为 500 µg/mL，作为储备溶液，-20℃保存。
1.3 仪器
Gold System 高效液相色谱仪（Beckman 公司）；Alliance 2695-Quattro Ultima TM Pt 液相 色谱-串联质谱仪（Waters 公司）；Ka-1000 离心机；T25 basic 均质机（IKA 公司）；氮气吹 干仪；超声波震荡器；涡旋混合器。
1.6.3 肉样前处理方法
称取绞碎肉样 1 g（精确到 0.01 g）于 10 mL 具塞玻璃试管中，加入 3 mL 乙腈和 0.5mL 异丙醇，均质，超声震荡 5min，3000 rpm 下离心 8 min，取上清液于 10 mL 试管中，加入 0.5 mL 氢氧化钠溶液（1 mol/mL）充分混匀。
1.5.2 质谱条件
离子源(Source)：ESI(-)；毛细管电压：3.92kV；锥孔电压：55V；离子源温度：120℃； 锥孔反吹气流量：45L/hr；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：436L/hr。
抗凝血类鼠药质量条件参数详见表 1。
通道 杀鼠灵 杀鼠醚 溴敌隆 大隆
敌鼠 氯敌鼠
母离子 307.2 291.2 524.9 523.3 339.1 373.4
取血样 1 mL（精确到 0.01 mL）于 10 mL 具塞玻璃试管中，加入 3 mL 甲醇，混匀， 3000 rpm 下离心 8 min，取上清液于 10 mL 试管中，加入 0.2 mL 氢氧化钠溶液（1 mol/mL），充 分混合。
1.6.2 尿样前处理方法
取尿样 4 mL（精确到 0.01 mL）于 10 mL 具塞玻璃试管中，加入 1 mL 异丙醇和 0.5 mL 氢氧化钠溶液（1 mol/mL），混匀，超声震荡 1 min。若有沉淀，则需要离心取上清液。
目前测定抗凝血类鼠药的方法主要有高效液相色谱法[2-5]、气相色谱法[6-7]、薄层色谱法
[8]、分光光度法[9]、高效液相色谱-质谱联用法[10-11]等。 高效液相色谱法和气相色谱法是测定抗凝血类灭鼠药最常用的方法，这两种方法具有操
作简单，快速，适用范围广等特点。在对中毒生物样品的预处理过程中，由于样品基质的复 杂，以及光谱检测的局限性，杂质干扰往往会影响检测结果的准确性，不能够准确确定鼠药 的种类，对中毒病人的急救带来了较大的困难。
生物样品中六种抗凝血鼠药的测定
蔡增轩，徐小民，俞和建，于 村，黄百芬
（浙江省疾病预防控制中心，杭州，310009） [摘要] 目的：建立检测生物样品中抗凝血类鼠药(杀鼠灵、杀鼠醚、溴敌隆、大隆、敌鼠, 氯敌鼠)的方法。方法：以高效液相色谱(HPLC)分离，紫外(UV)检测器定量检测，以高效液 相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)进行样品确认。通过对样品的预处理、色谱条件、质谱参 数等的优化选择，采用 MAX 固相萃取柱对样品净化提纯，Phenomenex C18 柱分离，紫外检 测波长为 285nm。阳性样品采用子离子扫描（Daughter-scan）方式检测，将得到的特征离子 作为鉴别鼠药的定性确认依据。结果：经过方法回收率、精密度等的方法学验证，杀鼠灵、 杀鼠醚、溴敌隆、大隆、敌鼠和氯敌鼠的最低检出限分别为 0.298、0.165、0.277、0.120、 0.184 、 0.267µg/mL 。 线 性 范 围 为 0.3-11µg/mL ， 线 性 相 关 系 数 R2>0.999 ， 回 收 率 在 60.1%-106.5%之间。结论：该法简单快速，分离效果好，定性准确，能够同时对生物样品中 多种抗凝血类鼠药进行检测，能够满足日常的检测需求。 [关键词]：高效液相色谱，高效液相色谱-串联质谱，抗凝血鼠药，生物样品
表 1 质量条件参数
子离子
碰撞能量（eV）
250.3 20
161.1
140.9
105.8
26
247.1
.1 36
136.9
135.0
80.8
39
187.1
167.1 20
145.1
201.0 18
145.0
延迟时间(s) 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03
1.6 前处理方法 1.6.1 血样前处理方法
杀鼠灵、杀鼠醚、溴敌隆、大隆、敌鼠和氯敌鼠为6种缓效灭鼠剂[1]，其中杀鼠灵、杀 鼠醚、溴敌隆和大隆等为香豆素类化合物，而敌鼠和氯敌鼠等为茚二酮类衍生物。利用该类 化合物能够破坏老鼠体内的凝血酶原，造成体内各脏器及粘膜大面积出血，最后达到杀死老 鼠的目的，故统称为抗凝血类杀鼠药。近年来随着毒鼠强、氟乙酰胺等急性灭鼠药的被禁用， 取而代之的是这些新一代的抗凝血灭鼠剂。虽然这些灭鼠剂有良好的灭鼠效果，但是由于使 用不当，人和生畜中毒的事件时常发生。为配合中毒病人的临床诊断与治疗，有必要建立生 物样品中这些抗凝血灭鼠剂的分析检测方法。
李青[8]等建立了薄层色谱法测定单个鼠药溴敌隆的方法，其回收率在88%-92%之间，该 法操作简单，成本低。
潘振球[9]等运用分光度法对毒鼠饵中的一种鼠药杀鼠醚进行了含量测定，毒鼠饵中杀鼠 醚用无水乙醇提取，于308.2纳米处有较强吸收，根据比尔定律，求出杀鼠醚的浓度。该方 法简单快速，回收率在96.7-99.9%之间，但其分析过程比较繁琐，在选择吸收波长时易受杂 质干扰。
金米聪[10]等用高效液相色谱-质谱联用法，以选择性离子检测(SIM)测定了全血中杀鼠醚 的含量，该法操作简便、快速、灵敏、准确，适用于中毒病人的中毒诊断分析。
本文采用高效液相色谱法定量检测生物样品（血、尿、肉）中抗凝血鼠药的成分, 阳性 样 品 以 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 定 性 确 认 。 提 取 液 经 MAX 固 相 萃 取 柱 富 集 净 化 ， Phenomenex C18 柱梯度洗脱色谱分离，紫外 285 nm 检测。阳性样品在高效液相色谱-串联质 谱中以子离子扫描（Daughter-Scan）模式检测，根据六种鼠药的特征离子进行定性确认。本 法具有操作简便,准确度高，能同时对多种抗凝血类鼠药进行检测。
2 结果与讨论
2.1 色谱柱选择
取各个单标储备溶液，配制成混合溶液，分别用下列色谱柱进行分析，色谱柱参数如 下：柱 1：Atlantis C18 柱(2.1×150 mm、粒径 5 μm)；柱 2：Sunfire C18 柱(2.1×150 mm、粒径 5 μm)；柱 3：Xbridge C18 柱(2.1×150 mm、粒径 5 μm)；柱 4：Phenomenex C18 柱(4.6×250 mm、 粒径 5 μm)。使用同一浓度的混合标准溶液，采用上述四种色谱柱进行分离，在各自优化后 的梯度洗脱条件下分别进样分析，结果表明色谱柱 2 和 4 有较好的分离效果。本实验采用色 谱柱 2 和 4 进行分离（见图 1）。
1.4 HPLC 条件 色谱柱：Phenomenex C18 柱(250×4.6 mm，粒径 5 µm)，柱温：35℃。进样体积：20 µL。
流动相 A：0.4%醋酸铵溶液，流动相 B：甲醇，梯度洗脱。流动相 B 初始为 30%，0-7 分钟， B：30%-70%；7-8 分钟，B：70%-100%；B100%保持 8 分钟；16-21 分钟，B：100%-70%。
Determination 6 anticoagulant rodenticides in biological samples
Cai Zengxuan,Xu Xiaomin,Yu Hejian,Yu Cun,Huang Baifen ( Zhejiang Provincial Center for Disease Prevention and Control , Hangzhou,310009)
1.5 HPLC-MS/MS 条件 1.5.1 HPLC 条件 色谱柱：Sunfire C18 柱（2.1×150 mm，粒径 5 µm），柱温：35℃。进样体积：10μL。流速：
0.3mL/min。 流动相 A：10 mM 醋酸铵溶液，流动相 B：甲醇，梯度洗脱。流动相 B 初始 为 60%；0-3 分钟，B：60%-100%；5-5.5 分钟，B：100%-60%。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
标准品：杀鼠灵，杀鼠醚，溴敌隆，敌鼠，氯敌鼠，大隆均购自 chemservice 公司；甲 醇、乙腈为色谱纯（merck 公司）；异丙醇为分析醇；盐酸为优级醇；实验用水为超纯水， 由 Millipore 纯水系统制备；固相萃取柱（Waters Oasis MAX 3 cc 60 mg）。
1.6.4 固相萃取净化处理
将上述处理液转移至 MAX 固相萃取柱（使用前分别用 3 mL 甲醇、3 mL 水活化）中， 上样溶液以小于 3 mL/min 的速度通过。待溶液完全流出后，依次 3 mL 水、2 mL 甲醇洗柱， 弃去全部淋出液，抽干 3 min。最后用 3 mL 2%盐酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于 5 mL 试 管中，于 60℃下氮气吹干。用甲醇-0.4%醋酸铵溶液（v/v，7∶3）定溶至 1 mL，涡旋混合。 经 0.45 µm 滤膜过滤后进样分析。
[Abstract] Objective: To setup the method for determination of six anticoagulant rodenticides (Warfarin,Coumatetralyl,Bromadiolone,Brodifacoum,Diphacinone,Chlorophacinone)in biological samples. Method: Six anticoagulant rodenticides were determinated by HPLC，and confirmed by HPLC-MS/MS. After optimization of sample preparation, separation condition and MS/MS parameters, a MAX solid phase extraction(SPE) column was choosed to clean up samples, analytes were determined with UV detector(285 nm) after separated by a Phenomenex C18 column. Positive samples were confirmed by HPLC-MS/MS with Daughter-scan mode.Result: The limits of detection (LOD) were 0.298,0.165,0.277,0.120,0.184 and 0.267ug/mL for Warfarin, Coumatetralyl, Bromadiolone, Brodifacoum, Diphacinone and Chlorophacinone, respectively. Linear range were from0.3 to 11 µg/mL, with coefficient R2>0.999.The mean recoveries were between 60.1% and 106.5%. Conclusion: The method is simple and fast and has a good separation, so it can satisfy the need for determination of 6 anticoagulant rodenticides in biological samples in routine analysis. [Keywords] HPLC, HPLC-MS/MS, Anticoagulant rodenticides, Biological samples