紫花苜蓿二氢黄酮醇还原酶基因(MsDFR)的克隆与分析

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紫花苜蓿MsERF003基因的克隆及其在碳酸盐胁迫响应中的功能分析

摘要生物治理是苏打盐碱土治理的有效方法。

紫花苜蓿具有较强的抗盐碱能力，发掘其抗盐碱基因并对其潜在抗性机理进行阐释，有利于高抗碱性紫花苜蓿新品种的培育和在盐碱地生物治理中的综合利用。

AP2/ERFs转录因子家族是一类与盐碱调控密切相关的转录因子，在植物的生长发育、代谢、胁迫应答、信号传导等诸多功能方面发挥着重要作用。

对紫花苜蓿中这类转录因子的研究，将有助于揭示并阐释紫花苜蓿的抗盐碱机理，提供优异的抗盐碱基因，用于作物的抗盐碱育种。

本研究克隆了紫花苜蓿MsERF003基因。

该基因拥有长度为570bp的开放阅读框，编码190个氨基酸残基。

该基因与来自蒺藜苜蓿MtERF003同源基因同源性为98.84%。

通过qPCR法对其在碳酸盐胁迫下的表达模式进行了分析，发现该基因在各个器官中的表达量均有上调，在根和茎中上调尤为明显。

我们构建了MtERF003启动子驱动的GUS基因表达载体，转入烟草中，获得了转基因植株。

GUS染色分析表明，该基因的启动子为在烟草中是根特异性表达启动子，且只在碳酸盐胁迫下发挥作用。

我们构建了过MsERF003-GFP融合表达载体，通过瞬时表达对其亚细胞定位进行了分析。

结果表明MsERF003只定位于在细胞核中。

我们构建了MsERF003基因植物表达载体，并导入到烟草基因组中，获得了转基因植株，且对T1代植株进行抗盐碱性评估。

结果表明在1.2%碳酸盐处理的8天后，非转基因植株已经萎蔫枯黄，而转基因植株则长势良好；在处理的过程中，转基因植株的总糖含量、脯氨酸含量、CAT含量、APX含量、POD含量和Na+/K+比显著高于非转基因组，对照组丙二醛含量的显著高于转基因组，叶绿素含量的降解速度明显快于转基因组；抗逆响应基因表达分析表明，在处理后期转基因植株的抗逆效应基因的表达量都高于对照组。

以上数据表明MsERF003基因在在烟草中表达提高了转基因烟草的抗盐碱能力，其可能在紫花苜蓿抗盐碱响应中起着重要的作用。

紫花苜蓿MsMYB2基因的克隆及转化

紫花苜蓿MsMYB2基因的克隆及转化冯子蓉;孙彦;晁跃辉;袁柱;陆继肖【期刊名称】《草地学报》【年(卷),期】2015(023)003【摘要】为获得MsMYB2基因过量表达的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,利用PCR技术在紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆出MYB2基因并命名为MsMYB2,MsMYB2基因编码区全长834 bp,编码1条长度为278个氨基酸的多肽链.通过DNA重组技术将其与pBI121连接,成功构建了植物表达载体pBI-MsMYB2.通过花序侵染法获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,并通过PCR 和RT-PCR对目的基因进行检测,结果证明目的基因已整合到拟南芥基因组中并且可以表达,成功获得了MsMYB2基因表达的拟南芥转基因植株.【总页数】6页(P580-585)【作者】冯子蓉;孙彦;晁跃辉;袁柱;陆继肖【作者单位】中国农业大学草地研究所,北京100193;中国农业大学草地研究所,北京100193;北京林业大学林学院,北京100083;中国农业大学草地研究所,北京100193;中国农业大学草地研究所,北京100193【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表达分析及遗传转化 [J], 贾会丽;王学敏;郭继承;高洪文;吴欣明;刘建宁;石永红;董宽虎;王运琦2.紫花苜蓿MsHST基因克隆及拟南芥转化 [J], 李奕稹;晁跃辉;康俊梅;杨青川;金洪3.紫花苜蓿MsNAP基因克隆及烟草转化 [J], 晁跃辉;李珊珊;滕珂;许立新;肖国增;郭涛;韩烈保4.紫花苜蓿MsARGOS基因的克隆及对拟南芥的转化 [J], 王梦颖;晁跃辉;丛丽丽;杨青川;康俊梅;张铁军5.紫花苜蓿转录因子基因MsAP_(2)的克隆及转化 [J], 石欣玥;尚骁尧;周玲芳;张铁军;晁跃辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

紫花苜蓿基因组测序及分析

紫花苜蓿基因组测序及分析近年来，随着基因组测序技术的不断发展越来越多的植物基因组序列得到完善。

通过基因组测序，可以系统地解析植物基因功能。

紫花苜蓿具有优良的农艺性状，是全世界种植范围最广的牧草作物，具有“牧草之王”的美称。

在我国，紫花苜蓿生长主要集中在北方地区，这些地区气候寒冷，容易发生低温冻害，造成苜蓿减产，大大降低苜蓿的生产效益。

肇东苜蓿作为紫花苜蓿的地方品种之一，具有良好的抗寒特性。

因此，本研究以肇东苜蓿为主要研究材料，进行基因组测序、组装及注释，获得基因组草图；对其它四种紫花苜蓿品种：阿尔冈金、WL168 WL52侪日WL44列行基因组重测序，挖掘抗寒相关的SNP同时，对紫花苜蓿AP2/ERF^录因子进行挖掘分析，构建紫花苜蓿AP2/ERF 基因调控网络，系统的解析紫花苜蓿AP2/ERF转录因子在抗寒胁迫中的调控机制。

主要研究成果如下：1.紫花苜蓿全基因组组装及注释分析通过高通量测序，评估紫花苜蓿基因组大小为1107"右，杂合率为1.77%，通过组装获得紫花苜蓿基因组草图。

进一步注释分析，挖掘119194个蛋白质编码基因，它们主要的功能集中在信号转导机制、蛋白质翻译后修饰、防御机制以及转录调控等生物过程。

2.紫花苜蓿抗寒性状相关遗传变异的挖掘通过四个紫花苜蓿品种进行基因组重测序，发掘紫花苜蓿品种间的遗传变异(SNP)，获得8909604个遗传变异；结合5个紫花苜蓿品种的抗寒性数据，挖掘82838个SNP与紫花苜蓿抗寒性状形成相关。

这些SN吩布在14372个基因上，它们主要涉及转录调控、还原代谢和信号转导等过程。

进一步富集分析发现，AP2/ERF、bHLH MADS NAC MY以及WRKY 等基因家族可能在紫花苜蓿抗寒过程中起关键调控作用3.紫花苜蓿AP2/ERF^录因子分子调控机制研究对紫花苜蓿全基因组进行分析，发掘了139个AP2/ERF^录因子，其成员分布在3个业家族中；挖掘紫花苜蓿与模式植物拟南芥的基因互作关系,构建紫花苜蓿的基因调控网络,系统的解析紫花苜蓿的分子调控网络，将来为紫花苜蓿基因资源的利用奠定了理论基础。

-紫花苜蓿几丁质酶Class_基因克隆及生物信息学分析

豆丁推荐 ↓精品文档紫花苜蓿几丁质酶ClassⅢ基因克隆及生物信息学分析张文娟李聪*王涌鑫苗丽宏中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草遗传育种实验室,北京,100193*通讯作者,*******************摘要本文根据截叶苜蓿(Medicago trucatula)几丁质酶ClassⅢ基因(GenBank:AY294484.1)的全长序列设计引物，通过RT-PCR的方法得到紫花苜蓿(Medicago sative)几丁质酶ClassⅢ的核酸序列，命名为MsChiⅢ，在NCBI中的登录号为FJ872918。

利用生物信息学软件分析MsChiⅢ，预测氨基酸序列的等电点、二级结构和三级结构，并构建系统发育树。

结果显示该核酸序列全长为953bp，包括完整的开放阅读框，编码301个氨基酸，等电点为8.212。

该序列所编码的蛋白属于几丁质酶18家族的内切酶，分布于细胞间隙，并含有几丁质酶18家族的特征序列———LGDVDFDIE，并预测MschiⅢ可能是一种具有几丁质酶和溶菌酶的双功能酶。

关键词紫花苜蓿,几丁质酶,ClassⅢ基因,生物信息学Cloning and Bioinformatics Analysis of Chintnase ClassⅢGene in Medicago sativeZhang Wenjuan Li Cong*Wang Yongxin Miao LihongForage Plants'Genetics and Breeding Laboratory,Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing,100193*Corresponding author,*******************DOI:10.3969/mpb.008.000271Abstract The cDNA of chitinase ClassⅢgene(GenBank accession:AY294484.1)from Medicago sative was cloned by RT-PCR,with primers designed according to the sequence of chitinase ClassⅢof Medicago trucatula,It was named as MsChiⅢ,and its GenBank accession number is FJ872918.The isoelectric point of amino acid se-quence,secondary and three-dimersional structures of MsChiⅢwere analysed by bioinformatics software,and the homologue tree of chitinaseⅢwas established.The result showed that the sequence consisted of953bp and had an full open reading frame,which encoded a polypeptide of301amino acid residues.The estimated PI of ClassⅢchiti-nase of Medicago sative was8.212.The protein coded by this sequence as incision enzyme belong to chitinase family18,dispersed in intercellular space,and the amino acid sequence included special sequence of chitinase family18,with an amino acid sequence of LGDVDFDIE.The effects of chitinase ClassⅢwould include chitinase and lysozyme.Keywords Medicago sative,Chitinase,ClassⅢgene,Bioinformatics苜蓿是全世界最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”。

紫花苜蓿MsMYB2基因的克隆及转化

Ａ连接酶、各种限制
性内切酶购自ＴａＫａＲａ公司；大肠杆菌感受态ＤＨ５ａ，购自北京天根生物科技有限公司；表达载体ｐＢｌｌ２１为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所草业研究室保存；其他试剂均采用进口分装或国产分析纯。１．２试验方法
１．２．１
植物表达栽体的构建
选取含有正确
ｂｙＤＮＡｒｅｃｏｍｂｉ—
ｎａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａｎｄ
ｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｐＢＩ—ＭｓＭＹＢ２ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅｐｌａｎｔｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｗｉｔｈｋａｎａｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｒａｌｄｉｐｍｅｔｈｏｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＲＴ—ＰＣＲ。ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｐｌａｎｔｓｃｅｓｓｆｕｌｌｙｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．
一些特定的序列参与缺氧反应的调控，诱导这些缺氧相关基因的表达。近年来相关研究表明［１４－１８］，ＭＹＢ２转录因子在干旱胁迫、盐胁迫以及ＡＢＡ信号转导等过程中都发挥着重要作用。２０１３年，Ｂａｃｋ等［１妇通过对拟南芥ＡｔＭＹＢ２基因的分析表明，该基因可以通过激活ｍｉＲ３９９ｆ的转录调节拟南芥对于磷饥饿的响应，是植物体内维持磷平衡的磷信号通路的一部分，并且连接着磷平衡和ＮａＣｌ，ＡＢＡ或发育调控这些非生物胁迫。在其他生物中，ＭＹＢ２转录因子也多次被研究。２００８年，Ｙｕ等［２叨发现ＭＹＢ２基因在兰伯氏贾第虫分化成囊肿的过程中发挥重要作用，是包囊壁蛋白和其他内源基因有效的反式激活因子。２０１１年，李国印等［２妇通过对甘蔗（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ

紫色小麦二氢黄酮醇还原酶基因及其克隆与应用[发明专利]

专利名称：紫色小麦二氢黄酮醇还原酶基因及其克隆与应用专利类型：发明专利
发明人：张宪省,刘茂森,李祥
申请号：CN200410035914.8
申请日：20041013
公开号：CN1632125A
公开日：
20050629
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及紫色小麦二氢黄酮醇还原酶TaDFR1基因的克隆、重组及促进花色苷生成的功能分析与应用，属于分子生物学和生物技术领域。

从紫色小麦种皮中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。

根据其它植物中的二氢黄酮醇还原酶保守的氨基酸序列，设计一对正向特异引物应用于3’RACE，进行常规聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物连接到pGEM－T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。

然后用3’特异引物和5’兼并引物快速扩增获得全长的cDNA。

进一步构建正义表达载体，转化拟南芥。

转基因拟南芥的叶片呈现紫色且萼片部分变紫。

天然的色素具有许多医疗、保健功能以及重要的观赏价值。

因此，该基因转化各种作物及蔬菜，具有非常重要的经济价值和社会价值。

申请人：山东农业大学
地址：271018 山东省泰安市岱宗大街61号
国籍：CN
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《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》范文

《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》篇一一、引言紫花苜蓿作为一种重要的豆科植物，具有丰富的营养价值和生态价值。

近年来，随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，对紫花苜蓿的基因功能研究逐渐成为热点。

SKIP（Skipping）基因作为一类重要的调控基因，在许多植物的生长、发育及响应逆境中起到关键作用。

本文以紫花苜蓿为研究对象，通过对SKIP 同源基因的克隆和功能鉴定，探讨其功能特点，以期为进一步的研究提供参考。

二、实验材料与方法1. 材料本实验选取紫花苜蓿为实验材料，相关试剂和仪器均购自正规渠道。

2. 方法（1）基因克隆a. 提取紫花苜蓿的DNA；b. 设计并合成特异性引物；c. 通过PCR技术扩增SKIP同源基因；d. 连接T载体并转化至大肠杆菌；e. 筛选阳性克隆并测序验证。

（2）功能鉴定a. 构建SKIP同源基因的过表达载体；b. 通过遗传转化法将过表达载体导入植物中；c. 观察并记录转基因植物的生长状况；d. 对转基因植物进行逆境处理，观察其抗逆性；e. 利用生物信息学软件分析基因表达模式。

三、实验结果1. 基因克隆结果通过PCR扩增，成功克隆了紫花苜蓿的SKIP同源基因。

连接T载体并转化至大肠杆菌后，筛选出阳性克隆并进行了测序验证，结果表明所克隆的基因序列与已知的SKIP同源基因序列高度相似。

2. 功能鉴定结果（1）过表达载体的构建及遗传转化成功将SKIP同源基因构建至过表达载体中，并通过遗传转化法成功将过表达载体导入紫花苜蓿中。

（2）转基因植物的生长状况观察在正常生长条件下，转基因植物与野生型植物相比，生长状况无明显差异。

然而，在逆境处理后，转基因植物的抗逆性明显增强，表现出更好的生长恢复能力。

（3）生物信息学分析通过对转基因植物的基因表达模式进行分析，发现SKIP同源基因在紫花苜蓿中的表达受到多种环境因素的调控，具有较高的表达活性。

此外，该基因在紫花苜蓿的生长发育及抗逆过程中发挥重要作用。

二氢黄酮醇还原酶基因概述

8 DFR 基因的转录调控
迄今发现的花青素合成调节因子主要包括 Myb 转录因子，Myc 家族的 bHLH 转录因子和 WD40 蛋白。其中 Myb 转录因子含有保守的 DNA 结合结构域，每个 Myb 结构域约含 51～52 个氨基酸残基，包含一系列高度保守的残基和间隔序列，并含有特异的 DNA 序列识别区和启动子结合区。如玉米的 C1 P1 和 P基因； bHLH 家族蛋白都有一个螺旋－环－螺旋结构区域和 4 个保守功能区域 bHLH 转录因子可以结合到特异的 DNA 序列上。某些 bHLH 转录因子在花青素途径调控中需要与 Myb 类转录因子共同作用，如金鱼草 Delila 基因。WD40 重复蛋白是一种螺旋蛋白，核心区域由 40 个氨基酸残基组成，可以促进蛋白与蛋白之间的相互作用。它发挥作用时必须与 Myb 转录因子，bHLH 转录因子形成蛋白复合体，如拟南芥的 TTG1 编码WD40 蛋白基因。
7 DFR 结构基因的启动子
植物基因启动子是重要的顺式作用元件，位于结构基因 5＇端上游区，指导全酶与模板的正确结合。活化 RNA 聚合酶，决定转录的方向和效率，直接影响基因的表达。
六倍体小麦有 3 种 DFR 基因 TaDFR－A TaDFR－B TaDFR－C 分别位于染色体 3A，3B 和 3D上，都有 3 个内含子。在 3 种DFR 基因启动子序列中存在 Myb 类转录因子P的结合位点，它和 G－box 的核心元件共同调控 DFR 基因的表达，这一结构可能调控小麦 DFR 基因的组织特异性表达，在 TaDFR－B 中有 3 个这种元件。而 TaDFR－A 和TaDFR －C 只有2个，因此 TaDFR－B 的表达量要比其他2种 DFR 基因在小麦的子叶根和种皮等器官中的表达量高。

浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究

浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究
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紫色苜蓿的一般介绍
• 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)草质优良、营养丰富、适口性强，被誉为“饲草之王”，是亚洲、北美洲利用最广泛、最重要的豆科牧草。然而，反刍牲畜采食新鲜苜蓿后易引起膨胀病(bloat)，影响到它在放牧方面的利用。一般认为，苜蓿叶片中浓缩单宁(condensed tannins，CT)含量低是引起反色牲畜膨胀病的主要原因。通过遗传调控，促使叶片中CT合成和积累是苜蓿遗传育种的重要研究内容，具有重要的理论和实践意义。
苯丙氨酸
二氢山奈酚
二氢栋皮黄酮
二氢黄酮还原酶DFR 黄烷3，4-二醇还原酶缩合单宁黄烷一3，4一二醇
结论
• 本项目针对苜蓿作为鲜食牧草容易发生膨胀病问题展开研究，对膨胀因子CT的生物合成及在分子水平的调控开展了一系列与 CT生物合成相关基因克隆、表达及控制CT 表达水平和位点的组织特异启动子的相关试验，取得的主要结果有:
结论
• 4.用农杆菌工程菌pBIDFR/EHA105，pPNDFR/EHA105 菌株转化红花大金子(Zn=4X=48)烟草 (Nictiana tabacom L.)，获得了Kan抗性再生植株。测定了野生型烟草(对照)、不同启动子驱动的DFR基因转化再生烟草的叶片、茎和根等器官中的CT含量，结果显示由于DFR基因的导入提高了转基因烟草中的CT含量。以组成型启动子驱动的DFR 基因(pBIDFR)转化烟草各器宫中CT含量最高显著高于对照，叶片中的含量达到4.27mg/g;而以光合组织特异表达启动子驱动的DFR基因(pPNDFR)转基因烟草的茎叶中浓缩单宁含量显著高于野生型烟草，其中叶片中浓缩单宁含量达到4.01mg/g。

紫花苜蓿MsPPR1_基因的克隆及抗旱功能分析

第 32 卷第 7 期Vol.32，No.749-602023 年 7 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA王少鹏，刘佳，洪军，等. 紫花苜蓿MsPPR1基因的克隆及抗旱功能分析. 草业学报， 2023， 32（7）： 49−60.WANG Shao-peng，LIU Jia，HONG Jun，et al. Cloning and function analysis of MsPPR1in alfalfa under drought stress. Acta Prataculturae Sinica，2023， 32（7）： 49−60.紫花苜蓿MsPPR1基因的克隆及抗旱功能分析王少鹏1**，刘佳1**，洪军2，林积圳2，张义2，史昆1，王赞1*（1.中国农业大学草业科学与技术学院，北京 100193；2.全国畜牧总站，北京 100125）摘要：干旱是影响植物生长发育及产量的重要环境因素，PPR（pentatricopeptide repeats）家族蛋白在植物生长发育以及胁迫响应等生理过程中都具有重要作用。

本研究在中苜1号紫花苜蓿中克隆到MsPPR1，利用病毒介导的基因沉默技术和烟草异源表达，在中苜1号紫花苜蓿和烟草中验证了MsPPR1在抗旱性中的功能。

结果显示，MsPPR1开放阅读框包含3213 bp，编码1070个氨基酸，相对分子量为121.65 kDa，具有多个PPR重复结构域，定位于细胞质，是典型的PPR蛋白家族成员。

MsPPR1主要表达在叶中，其次是茎和根，花中最少；其表达量受自然干旱、甘露醇和脱落酸处理的诱导。

通过病毒诱导基因沉默技术在紫花苜蓿中降低了MsPPR1的表达，干旱胁迫下，沉默植株更加萎蔫，相对含水量显著降低，相对电解质渗透率显著升高，显著降低了紫花苜蓿的抗旱性。

在烟草中异源超表达MsPPR1，显著增强了转基因烟草的抗旱性，干旱胁迫下，丙二醛含量显著降低，脯氨酸含量增加。

紫花苜蓿CNGC基因家族成员鉴定及分析

第32卷第2期V o l .32 No .2草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年 2月F e b . 2024d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2024.02.028引用格式:李小红,王晓彤,麻旭霞,等.紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析[J ].草地学报,2024,32(2):588-598L IX i a o -H o n g ,WA N GX i a o -T o n g ,MAX u -X i a ,e t a l .I d e n t i f i c a t i o n a n dA n a l y s i s o f C N G C G e n eF a m i l y Me m b e r s i n A lf a l f a [J ].A c t aA gr e s t i aS i n i c a ,2024,32(2):588-598紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析李小红1,王晓彤1,麻旭霞1,蔡文祺1,冯学丽1,马梦凡1,李淑霞1,2,3*(1.宁夏大学林业与草业学院,宁夏银川750021;2.宁夏草牧业工程技术研究中心,宁夏银川750021;3.农业农村部饲草高效生产模式创新重点实验室,宁夏银川750021)收稿日期:2023-09-26;修回日期:2023-11-16基金项目:国家自然科学基金项目(32101426);宁夏自然科学基金项目(2023A A C 05019)资助作者简介:李小红(1996-),男,回族,宁夏固原人,硕士研究生,主要从事牧草抗逆育种研究,E -m a i l :l x h 0895@163.c o m ;*通信作者C o r r e -s p o n d i n g au t h o r ,E -m a i l :l i s h u x i a 620@163.c o m 摘要:环核苷酸门控通道(C N G C )基因家族作为非选择性阳离子通道基因家族之一,在植物信号转导㊁生长发育和环境胁迫等生理过程中发挥着重要作用㊂本研究利用生物信息学手段和转录组数据对紫花苜蓿C N G C 家族成员的进化关系㊁基因结构㊁保守基序㊁顺式作用元件㊁染色体定位㊁共线性关系以及基因表达进行分析㊂结果表明,紫花苜蓿M s C N G C 基因家族成员有16个,在染色体上不均匀分布,存在片段重复,大多数蛋白定位于细胞质膜㊂系统发育树将M s C N G C s 为4个亚家族㊂基因结构和保守基序分析表明,都含有c NM P /C N B D 和I T P 功能域㊂顺式作用元件分析表明,M s C N G C s 基因含有许多与非生物或生物胁迫和激素响应元件㊂M s C N G C 4和M s C N G C 7.2蛋白之间存在互作㊂M s C N G C 基因具有组织表达特异性㊂M s C N G C 基因对干旱㊁盐和激素等非生物胁迫均有显著的响应,为进一步研究M s C N G C 基因在调控非生物胁迫过程中的潜在功能提供了理论依据㊂关键词:紫花苜蓿;C N G C 基因家族;全基因组;系统进化;基因结构;非生物胁迫中图分类号:S 512.6 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)02-0588-11I d e n t i f i c a t i o na n dA n a l y s i s o f C N G C G e n eF a m i l y Me m b e r s i nA lf a l f a L IX i a o -h o ng 1,WA N G X i a o -t o n g 1,MA X u -x i a 1,C A IW e n -qi 1,F E N G X u e -l i 1,MA M e n g-f a n 1,L I S h u -x i a 1,2,3*(1.C o l l e g e o fF o r e s t r y a n dP r a t a c u l t u r e ,N i n g x i aU n i v e r s i t y ,Y i n c h u a n ,N i n g x i a 750021,C h i n a ;2.N i n g x i aG r a s s l a n d a n dA n i m a l H u s b a n d r y E n g i n e e r i n g T e c h n o l o g y R e s e a r c hC e n t e r ,Y i n c h u a n ,N i n g x i a 750021,C h i n a ;3.K e y L a b o r a t o r y fo rM o d e l I n n o v a t i o n i nF o r a g eP r o d u c t i o nE f f i c i e n c y ,M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f f a i r s ,Y i n c h u a n ,N i n gx i a 750021,C h i n a )A b s t r a c t :T h e c y c l i cn u c l e o t i d e -g a t e dc h a n n e l s (C N G C s )g e n e f a m i l y fu n c t i o n s a so n eo f t h en o n -s e l e c t i v e c a t i o n c h a n n e l g e n e f a m i l i e s a n d p l a y s i m p o r t a n t r o l e s i n p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s s u c h a s p l a n t s i gn a l t r a n s -d u c t i o n ,g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t ,a n d e n v i r o n m e n t a l s t r e s s .I n t h i s s t u d y ,w e a n a l y z e d t h e e v o l u t i o n a r y r e -l a t i o n s h i p ,g e n e s t r u c t u r e ,c o n s e r v e d m o t i f s ,c i s -a c t i n g e l e m e n t s ,c h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o n ,c o l l i n e a r i t y,a n d g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n so f t h e C N G C f a m i l y m e m b e r s i na l f a l f au s i n g b i o i n f o r m a t i c t o o l sa n dt r a n s c r i p-t o m i c d a t a .T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e r ew e r e16m e m b e r so f M s C N G C g e n e s f a m i l y ina l f a l f a ,w h i c h w e r eu n e v e n l y d i s t r i b u t e do n c h r o m o s o m e s ,w i t h s e g m e n t a l r e pe a t i o n ,a n dm o s t of p r o t e i n sw e r e l o c a t e d i n t h e p l a s m am e m b r a n e .T h e p h y l o ge n e t i c t r e e d i v i d e dM s C N G C s i n t of o u r s u b f a m i l i e s .G e n e s t r u c t u r e a n d c o n s e r v e dm o t i f a n a l y s i s s h o w e d t h a t c NM P /C N B Da n dI T Pf u n c t i o n a l d o m a i n sw e r e p r e s e n t .C i s -a c t i n ge l e m e n t a n a l y s i s s h o w e d t h a t M s C N G C g e n e s c o n t a i n e dm a n y e l e m e n t s t h a t r e s p o n d e d t o a b i o t i c o r b i o l o g i -c a l s t r e s s e s a n dh o r m o n e s .T h e r ew a s i n t e r a c t i o nb e t w e e n M s C N G C 4a n d M s C N G C 7.2p r o t e i n s .M s C -N G C g e n e s h a dt i s s u es p e c if i c i t y .M s C N G Cg e n e sh a dsi g n i f i c a n t r e s p o n s e t od r o u gh t ,s a l t a n dh o r m o n e s t r e s s ,w h i c h p r o v i d e d a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r f u r t h e r r e s e a r c h o n t h e p o t e n t i a l f u n c t i o n o f M s C N G C g e n e s i nt h e r e gu l a t i o no f a b i o t i c s t r e s s .K e y wo r d s :A l f a l f a ;C N G C g e n e s f a m i l y ;G e n o m e -w i d e ;S y s t e m a t i c e v o l u t i o n ;G e n e s t r u c t u r e ;A b i o t i c s t r e s s第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析C a2+作为植物中重要的次级信使,在调控植物的多种信号转导㊁生长发育和非生物胁迫响应中发挥着关键性的作用,如植物的光合作用㊁激素合成㊁生物胁迫和非生物胁迫等[1-4]㊂环核苷酸门控离子通道(C N G C s)蛋白是钙离子传导途径之一,广泛存在于动植物中[5]㊂在植物中,大多数C N G C蛋白位于质膜,部分位于核膜和液泡膜[6-8]㊂C N G C是由六个跨膜(T M)结构域和第五㊁第六T M结构域之间的一个孔隙区域(P)组成,包含C a M B结构域和环核苷酸结合结构域(C N B D)[9-11]㊂C N B D是一个高度保守的区域,包含一个能与钙调蛋白(C a l m o d u-l i n,C a M)结合的磷酸盐结合盒(P B C)和1个铰链区[12-13]㊂环核苷酸单磷酸(3',5'-c AM P和3',5'-c GM P)和C a M可调节C N G C通道的关闭和打开[14]㊂这些结构对研究C N G C提供了重要的信息㊂研究表明,C N G C家族成员可参与植物的各种生理反应,包括种子萌发㊁生殖发育[15]和非生物胁迫(盐胁迫㊁热胁迫)响应等[16,17]㊂目前,已经在大多数植物种鉴定出了C N G C基因,如拟南芥(A r a-b i d o p s i s t h a l i a n a)中鉴定出20个A t C N G C s㊁蒺藜苜蓿(M e d i c a g o t r u n c a t u)中19个M t C N G C s基因㊁赤豆(V i g n a a n g u l a r i s)中18个V a C N G C s基因[35]㊂在拟南芥中,A t C N G C1作为植物发育和抗逆性的调节因子,参与C a2+的吸收[19]㊂A t C N G C18在花粉中表达,A t C N G C18功能的丧失导致花粉管生长缺陷,并导致雄性不育[18]㊂A t C N G C19和A t C N G C20在盐胁迫下表达量显著降低[19]㊂沉默I V b亚族S l C N G C基因显著增强番茄(S o l a n u m l y-c o p e r s i c u m)对真菌病原体P y t h i u ma p h a n i d e r m a-t u m和S o l a n u ml y c o p e r s i c u m的抗性[20]㊂在芒果(M a n g i f e r ai n d i c a)C N G C家族成员中,M i C-N G C13和M i C N G C6可通过调节M D A含量来维持细胞膜完整性,进而积极响应冷胁迫[21]㊂沉默棉花(G o s s y p i u m h i r s u t u m)G h C N G C32和G h C-N G C35基因后,转基因植株的耐盐性降低[22]㊂C N G C基因在植物的各种生物学过程中发挥重要作用㊂因此,鉴定紫花苜蓿(M e d i c a g os a t i v a) C N G C家族成员对紫花苜蓿的抗逆性研究具有重要意义㊂紫花苜蓿是一种优质的多年生豆科牧草,在世界范围内广泛种植,对环境的适应性相对较强,因其营养含量高和适口性好而享有牧草之王的美誉[23,24]㊂然而,一些不利的生物和非生物因素严重制约了苜蓿生产,对苜蓿产量和品质产生了严重的负面影响,进而影响畜牧业的高质量发展㊂本研究利用紫花苜蓿全基因组序列信息㊁拟南芥C N G C家族基因研究信息及生物信息学分析技术对紫花苜蓿中的C N G C基因家族成员进行鉴定和分析,并利用转录组数据分析M s C N G C基因在不同组织和非生物胁迫(冷㊁干旱㊁盐和A B A)下的表达模式,以期为进一步探究M s C N G C 基因的功能提供了理论依据㊂1材料与方法1.1紫花苜蓿C N G C基因家族鉴定从拟南芥数据库(T A I R,h t t p://w w w.a r a b i-d o p s i s.o r g/)中下载拟南芥C N G C家族蛋白的氨基酸序列㊂紫花苜蓿(中苜一号)基因组文件下载自h t t p s://f i g s h a r e.c o m/a r t i c l e s/d a t a s e t/M e d i c a g o_ s a t i v a_g e n o m e_a n d_a n n o t a t i o n_f i l e s/12623960㊂以拟南芥C N G C蛋白为参考序列,利用T B t o o l s中的B L A S T p比对出紫花苜蓿中C N G C s的蛋白,然后,利用c NM P/C N B D(p f a m:P F00027)和I T P(p f a m: P F00520)的隐马尔可夫模型(HMM)配置文件作为查询,对紫花苜蓿蛋白数据库进行搜索,利用C D-H I T(h t t p://w e i z h o n g-l a b.u c s d.e d u/c d-h i t/)软件去除冗余序列㊂再利用I n t e r P r o(h t t p s://w w w.e b i.a c.u k/i n t e r p r o)网站分析预测蛋白的结构域,同时包含一个环核苷酸结合结构域(c NM P/C N B D, P F00027)和一个离子转运蛋白结构域(I T P, P F00520)的蛋白属于紫花苜蓿C N G C基因家族成员,并根据基因在染色体上的位置信息重新命名M s C N G C基因㊂1.2紫花苜蓿C N G C蛋白质理化性质㊁亚细胞定位㊁二级和三级结构预测分析利用在线工具P r o tP a r a m(h t t p s://w e b.e x-p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)预测M s C N G C蛋白质的氨基酸数㊁分子量㊁等电点㊁稳定指数等理化性质㊂利用W o L F P S O R T I I网站(h t t p s://w w w.g e n-s c r i p t.c o m)和S O P MA(h t t p s://n p s a-p r a b i.i b c p.f r)预测M s C N G C蛋白成员的亚细胞定位及二级结构㊂使用在线网站S W I S S-MO D E L(h t t p s:// s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/)分析M s C N G C蛋白的三级结构㊂1.3紫花苜蓿C N G C基因系统进化树分析利用软件M E G A11对紫花苜蓿16个M s C-985草地学报第32卷N G C,拟南芥20个A t C N G C,蒺藜苜蓿19个M t C-N G C蛋白和赤豆18个V a C N G C蛋白共73个C N G C蛋白序列构建系统进化树㊂进化树构建采用最大似然法(M a x i m u m l i k e l i h o o d e s t i m a t e, M L),步长值(b o o t s t r a p v a l u e s)为1000次,其他参数设置默认㊂1.4紫花苜蓿C N G C基因结构、保守基序和顺式作用元件分析通过T B t o o l s工具对M s C N G C基因家族成员进行内含子-外显子结构分析㊂M E M E(h t t p s:// m e m e-s u i t e.o r g/m e m e/t o o l s/m e m e)用于预测蛋白的保守基序,保守基序数为10,其他参数默认㊂利用P l a n t C A R E(h t t p://b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n tc a r e/h t m l/)工具分析启动子序列(基因上游2.0k b)中的顺式作用元件,并利用T B t o o l s工具进行可视化㊂1.5紫花苜蓿C N G C基因染色体定位和共线性分析基于紫花苜蓿全基因文件信息,使用T B t o o l s 软件分析和定位M s C N G C基因的染色体分布㊂从E n s e m b l P l a n t s(h t t p://p l a n t s.e n s e m b l.o r g/i n-d e x.h t m l)网站分别下载拟南芥和蒺藜苜蓿全基因组序列和g f f文件,利用多重共线扫描工具(M C S-c a n X)分析紫花苜蓿与拟南芥和蒺藜苜蓿C N G C基因共线性,并通过T B t o o l s进行可视化㊂用S i m p l e K a/K sC a l c u l a t o r(N G)计算非同义替换率(K a),同义替换率(K s)以及K a/K s比率㊂1.6M s C N G C蛋白互作网络预测蛋白质互作网络预测对功能未知的蛋白有着非常重要的作用㊂我们以模式作物拟南芥已注明功能的蛋白质和16个M s C N G C蛋白为研究对象,通过S T R I N G(h t t p s://c n.s t r i n g-d b.o r g/)在线软件对M s C N G C蛋白进行了预测分析,置信度参数设为0.400,其他参数默认㊂1.7紫花苜蓿M s C N G C基因的组织表达模式和非生物胁迫表达分析从N C B I网站(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/ s r a/?t e r m)下载紫花苜蓿在不同组织㊁干旱㊁低温㊁A B A以及盐胁迫下的转录组数据(S R P055547㊁S R R7091780~7091794,S R R7160313~7160357),获得M s C N G C基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式,对每个M s C N G C s的F P K M值进行对数归一化,并使用T B t o o l s工具绘制热图㊂2结果与分析2.1紫花苜蓿M s C N G C基因家族成员鉴定及基本理化性质分析为鉴定紫花苜蓿中所有的C N G C家族成员,从T A I R网站上下载了拟南芥C N G C基因家族20个成员的蛋白序列作为参考序列,对紫花苜蓿全基因组进行B L A S T检索,E小于1ˑ10-5㊂同时,将c N M P/C N B D 和I T P(p f a m:P F00027㊁P F00520)的隐马尔可夫模型(HMM)配置文件作为查询,对紫花苜蓿蛋白数据库进行搜索㊂去冗余后,共鉴定出16个包含C N G C功能域的基因,根据它们在染色体上的位置被命名为M s C-N G C1-M s C N G C8.5(表1)[36]㊂M s C N G C蛋白长度为460a a(M s C N G C4.2)~2638a a(M s C N G C3.2),对应的蛋白分子量为52.85~295.52k D a,理论等电点在5.87 ~9.5之间,疏水指数(G R A V Y)为-0.433~0.096㊂M s C N G C s蛋白二级结构分析表明,M s C N G C蛋白的α-螺旋㊁β-链折叠㊁延伸链和无规则卷曲分别为37.66% (M s C N G C8.2)~62.17%(M s C N G C4.2),2.60%(M s C-N G C8.3)~11.02%(M s C N G C8.2),延伸链9.17% (M s C N G C3.2)~22.70%(M s C N G C8.2),25.00% (M s C N G C4.2)~33.65%(M s C N G C8.5)㊂不稳定系数预测表明,M s C N G C2.1/7.1/7.2/8.2蛋白的稳定系数小于40,属于稳定蛋白,其他M s C N G C s的稳定系数大于40,属于不稳定蛋白㊂M s C N G C3.2和M s C N G C8.1蛋白的等电点小于7,属于酸性蛋白,其他14个M s C-N G C蛋白等电点大于7,属于碱性蛋白㊂亚细胞定位预测表明,M s C N G C4.2和M s C N G C8.1蛋白分别位于液泡和叶绿体上,其他14个M s C N G C蛋白定位于质膜上㊂2.2紫花苜蓿M s C N G C蛋白的系统发育分析对紫花苜蓿16个M s C N G C蛋白㊁拟南芥20个A t C N G C蛋白㊁蒺藜苜蓿19个M t C N G C蛋白和赤豆18个V a C N G C蛋白,共73个C N G C蛋白的系统进化分析表明:73个C N G C s蛋白被划分为5个亚家族(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,ⅣA,ⅣB)(图1)㊂除Ⅲ亚家族不包含M s C N G C蛋白,其他4个亚家族均包含M s C N G C成员,其中Ⅲ㊁ⅣA㊁ⅣB亚家族均包含上述4个物种的C N G C成员,表明C N G C在不同物种间的进化关系是高度保守㊂第Ⅰ亚家族只包含095第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析M s C N G C 2.1,M s C N G C 3.2和M s C N G C 5㊂第Ⅱ亚家族包含有M s C N G C 8.4和M s C N G C 8.5;第ⅣA 亚家族包含M s C N G C 1,M s C N G C 2.2,M s C N G C 3.1,M s C N G C 4.2,M s C N G C 7.1和M s C N G C 7.2;第ⅣB 亚家族包含M s C N G C 4.1,M s C N G C 7.3,M s C -N G C 8.1,M s C N G C 8.2和M s C N G C 8.3㊂表1 紫花苜蓿M s C N G C 基因家族成员信息T a b l e 1 I n f o r m a t i o no f M s C N G C g e n e f a m i l y me m b e r s i na lf a l f a 基因名称G e n en a m e基因号G e n e I D蛋白质长度P r o t e i nL e n g t h /a a 蛋白质分子质量P r o t e i n MW /k D a稳定系数I n s t a b i l i t yi n d e x 等电点p IV a l u e 疏水指数G R A V Y α-螺旋α-H e l i x /%延伸链E x t e n d e d S t r a n d/%β-折叠B e t at u r n /%无规则卷曲R a n d o m c o i l /%亚细胞定位S u b c e l l u l a rL o c a l i z a t i o nM s M s C N G C 1M s G 0180003547.01.T 01977111.1648.618.21-0.20145.9614.025.1234.90p l a s M s M s C N G C 2.1M s G 028*******.01.T 011189136.2036.658.120.09642.1418.597.9931.29p l a s M s M s C N G C 2.2M s G 028*******.01.T 0171282.1946.389.2-0.14252.8811.672.9532.49p l a s M s M s C N G C 3.1M s G 0380016434.01.T 0167978.4945.729.21-0.17754.7911.193.0930.93p l a s M s M s C N G C 3.2M s G 0380017485.01.T 012638295.5248.235.87-0.23753.079.175.1232.64p l a s M s M s C N G C 4.1M s G 0480018204.01.T 0174486.1557.849.2-0.25752.5511.833.3632.26p l a s M s M s C N G C 4.2M s G 0480020782.01.T 0146052.8547.909.260.01062.1710.222.6125.00v a c u M s M s C N G C 5M s G 0580028912.01.T 0160070.0841.428.16-0.08052.1716.005.3326.50p l a s M s M s C N G C 7.1M s G 0780037654.01.T 0167978.5139.828.96-0.11952.2812.962.8031.66p l a s M s M s C N G C 7.2M s G 0780037699.01.T 0167978.5139.828.96-0.12054.9311.782.9530.34p l a s M s M s C N G C 7.3M s G 0780041753.01.T 0173284.2547.719.5-0.15852.1112.963.4131.51p l a s M s M s C N G C 8.1M s G 0880041836.01.T 0146553.7959.956.81-0.43356.5610.113.2330.11c h l o M s M s C N G C 8.2M s G 0880043019.01.T 0176286.8339.879.48-0.16337.6622.7011.0228.61p l a s M s M s C N G C 8.3M s G 0880043020.01.T 0165475.5941.238.92-0.07154.1312.542.6030.73p l a s M s M s C N G C 8.4M s G 0880044538.01.T 0154963.8750.139.13-0.27455.1910.753.2830.78p l a s M s M s C N G C 8.5M s G 0817*******.01.T 0162472.3750.679.07-0.21952.7210.742.8833.65pl a s 注:pl a s ,代表细胞质膜;v a c u ,代表液泡膜;c h l o ,代表叶绿体N o t e :p l a s s t a n d s f o r c e l l p l a s m am e m b r a n e ;v a c us t a n d s f o r v a c u o l a rm e m b r a n e ;c h l os t a n d s f o rC h l o r o pl a st 图1 紫花苜蓿㊁拟南芥㊁蒺藜苜蓿和赤豆C N G C 蛋白的系统进化分析F i g .1 P h y l o g e n e t i c t r e e o fC NG C p r o t e i n s f r o m M .s a t i v a ,A .t h a l i a n a ,M .t r u n c a t u l a a n d V .a n gu l a r i s 注:图中红色圆圈㊁绿色圆圈㊁黄色圆圈和蓝色色圆圈分别代紫花苜蓿㊁拟南芥㊁赤豆㊁蒺藜苜蓿N o t e :I n t h e f i g u r e ,t h e r e d c i r c l e ,t h e g r e e n c i r c l e ,t h e y e l l o wc i r c l e a n d t h e b l u e c i r c l e r e p r e s e n t a l f a l f a ,A r a b i d o p s i s ,V .a n gu l a r i s a n d M .t r u n -c a t u l a r e s p e c t i v e l y195草地学报第32卷2.3紫花苜蓿M s C N G C基因家族保守基序和基因结构分析为进一步探究M s C N G C基因的进化过程,我们首先对M s C N G C s蛋白构建系统进化树,M s C N G C s 蛋白被划分成3个亚家族(图2A)㊂对M s C N G C基因家族成员的保守基序和基因结构进行了分析,结果表明,M s C N G C蛋白中共预测到了10个基序(M o t i f1 ~M o t i f10)(图2B),其中大多数M s C N G C蛋白含有10个m o t i f㊂根据紫花苜蓿与拟南芥的进化关系,我们发现在第Ⅰ亚家族中M s C N G C3.1/7.1/7.2含有相同的m o t i f;第Ⅱ亚家族中的M s C N G C2.2具有与第Ⅰ亚家族基因相同的m o t i f结构;而第Ⅲ亚家族包含的M s C N G C1和M s C N G C4.2m o t i f数量和种类并不相同,其中M s C N G C1比M s C N G C4.2多3个m o t i f;第Ⅳ亚家族中的M s C N G C蛋白(M s C N G C2.1,M s C-N G C3.2,M s C N G C4.1,M s C N G C5和M s C N G C8.1)包含4~7个m o t i f,其中M s C N G C2.1㊁M s C N G C3.2和M s C N G C5含有4个m o t i f,M s C N G C4.1和M s C-N G C8.1含有7个m o t i f;第Ⅴ亚家族中3个M s C N G C 蛋白(M s C N G C7.3,M s C N G C8.2和M s C N G C8.3)含有8~10个m o t i f,M s C N G C8.2不包含m o t i f7㊂此外,m o t i f2在所有成员中都存在,M s C N G C2.1,M s C-N G C3.2和M s C N G C5不包含m o t i f3和m o t i f5㊂基因结构分析表明,M s C N G C基因内含子/外显子的数量分别为4~45个㊁5~46个不等(图2C)㊂6个基因(M s C N G C2.2,M s C N G C3.1,M s C N G C4.2, M s C N G C7.1,M s C N G C7.2和M s C N G C8.1)含4~5个内含子;4个基因(M s C N G C7.3,M s C N G C8.3, M s C N G C8.4和M s C N G C8.5)包含6~7内含子;2个基因(M s C N G C1,M s C N G C8.2)含有9~10个内含子;3个基因(M s C N G C5,M s C N G C2.1和M s C N G C3.2)含11~45个内含子㊂特别地,M s C N G C3.2基因含有的内含子和外显子数是该家族中最多的,分别是45和46个㊂另外,M s C N G C家族成员U T R的分布也是不均匀的,其数量在0~4个,其中6个基因(M s C N G C3.1,M s C N G C3.2,M s C N G C4.2,M s C-N G C7.3,M s C N G C8.1和M s C N G C8.3)的序列没有预测到U T R区㊂图2紫花苜蓿M s C N G C基因保守结构域、基序及基因结构分析F i g.2 A n a l y s i s o f g e n e c o n s e r v e dd o m a i n,m o t i f a n d g e n e s t r u c t u r e o f a l f a l f a M s C NG C注:(A)M s C N G C基因家族系统发育树㊂(B)M s C N G C蛋白的基序㊂不同的图案用不同颜色的矩形标注,编号1-10㊂(C)M s C N G C基因的外显子-内含子结构㊂非编码区(U T R)是用绿色方框表示㊂黄框表示外显子,灰线表示内含子㊂(D)基序的蛋白N o t e:(A)M s C N G C g e n e f a m i l yp h y l o g e n e t i c t r e e.(B)M o t i f o fM s C N G C p r o t e i n.D i f f e r e n t p a t t e r n s a r em a r k e dw i t hr e c t a n g l e so f d i f f e r e n t c o l o r s,n u m b e r e d1-10.(C)E x o n-i n t r o n s t r u c t u r e o f M s C N G C g e n e.N o n-c o d i n g r e g i o n(U T R).I t i s r e p r e s e n t e db y a g r e e nb o x.T h e y e l l o w b o x s h o w s e x o n s,a n d t h e g r a y l i n e s h o w s i n t r o n s.(D)P r o t e i no f t h em o t i f2.4紫花苜蓿C N G C基因启动子顺式作用元件分析为了进一步了解M s C N G C家族成员顺式作用元件的分布,利用P l a n t C A R E在线工具分析顺式作用元件㊂结果表明,16个M s C N G C基因启动子区共检测到170个响应元件,但不同基因含有的响应元件数量和种类不尽相同㊂M s C N G C基因启动子中与植物激素相关的顺式作用元件有5类,包括与295第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析脱落酸(A B A)㊁生长激素(I A A)㊁茉莉酸(J A)㊁赤霉素(G A)和水杨酸(S A)相关的元件;参与环境刺激的顺式作用元件包括3类,分别为低温响应㊁干旱和防御/应激响应元件;此外,还有与昼夜节律和光响应相关的元件(图3)㊂M s C N G C家族基因均含有与激素响应元件,例如,M s C N G C2.2/7.2/8.3/ 8.4/8.5包含生长素响应(T G A-e l e m e n t)元件; M s C N G C2.1/3.1/4.1/5/7.2/7.3/8.1基因包含参与水杨酸响应(T C A-e l e m e n t)元件;M s C-N G C2.1/4.1/4.2/5/7.1/7.2/7.3/8.1/8.2基因包含参与脱落酸(A B R E)作用元件;M s C-N G C7.2/8.3/8.4/8.5基因包含参与赤霉素响应(P b o x㊁T A T C-b o x)的顺式作用元件;M s C N G C1/ 2.2/3.1/3.2/5/7.2/8.1/8.2/8.3/8.4/8.5包含参与茉莉酸响应(T G A C G-m o t i f)元件㊂胁迫响应元件也广泛存在于M s C N G C基因家族中,例如, M s C N G C2.2㊁M s C N G C4.1㊁M s C N G C4.2和M s C-N G C7.3基因含有干旱响应(M B S)元件;M s C N G C1/ 2.2/3.2/8.5基因包含参与防御和应激反应(T C-r i c hr e p e a t s)元件;M s C N G C1/3.2/4.1/5/7.3/ 8.1/8.4包含光响应(G-b o x㊁I-b o x)元件,M s C-N G C2.1/7.2/8.3包含低温响应(L T R)元件㊂此外,M s C N G C1/3.1/4.2/7.2/8.1还包含参与昼夜节律调控相关(C i r c a d i a n)作用元件(图3)㊂图3M s C N G C基因启动子区顺式作用元件分析F i g.3 D i s t r i b u t i o no f c i s-a c t i n g e l e m e n t s i n t h e p r o m o t e r r e g i o no f M s C NG C g e n e s i na l f a l f a 注:顺式作用元件由不同颜色的矩形表示N o t e:T h e c i s-e l e m e n t s a r e r e p r e s e n t e db y r e c t a n g l e s o f d i f f e r e n t c o l o r s2.5紫花苜蓿M s C N G C基因染色体定位、基因重复及共线性分析对紫花苜蓿C N G C家族基因进行染色体定位分析发现,16个M s C N G C s基因不均匀的分布在c h r1㊁c h r2㊁c h r3㊁c h r4㊁c h r5㊁c h r7和c h r8上(图4A)㊂其中,c h r1和c h r5上各包含1个M s C N G C 基因,c h r2㊁c h r3和c h r4上各包含2个M s C N G C s 基因,c h r7上各包含3个M s C N G C s基因,c h r8上各包含5个M s C N G C s基因㊂共线性分析表明:紫花苜蓿C N G C家族内的M s C N G C1/M s C N G C4.2, M s C N G C7.3/M s C N G C8.2之间存在共线性关系(图4A),属于节段重复,K a/K s小于1,说明他们之间在进化过程中经历了纯化选择(表2)㊂进一步分析紫花苜蓿与拟南芥和蒺藜苜蓿之间C N G C基因的共线性发现,不同物种间也存在共线性关系,但紫花苜蓿与蒺藜苜蓿之间在相同染色体上的共线性较多,说明紫花苜蓿与蒺藜苜蓿都是豆科植物,所以其亲缘性更高(图5B)㊂395草地学报第32卷图4M s C N G C基因的染色体分布及共线性分析F i g.4 C h r o m o s o m e d i s t r i b u t i o na n d c o l l i n e a r i t y a n a l y s i s o f M s C NG C g e n e s注:(A)紫花苜蓿C N G C基因在染色体定位和染色体间关系㊂黑线线表示M s C N G C共线性基因㊂(B)苜蓿㊁苜蓿和拟南芥中C N G C基因的共线性分析㊂背景中的灰线代表紫花苜蓿和拟南芥/蒺藜苜蓿的共线块,蓝线代表共线C N G C基因对N o t e:(A)C h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o na n d i n t e r c h r o m o s o m e r e l a t i o n s h i p o f C N G C g e n e i na l f a l f a.T h e b l a c k l i n e r e p r e s e n t s t h e M s C N G C c o l l i n e a r g e n e s.(B)C o l l i n e a r i t y a n a l y s i s o f C N G C g e n e s i n a l f a l f a,a l f a l f a a n dA r a b i d o p s i s.T h e g r a y l i n e s i n t h e b a c k g r o u n d r e p r e s e n t t h e c o l l i n e a r b l o c k s o f a l f a l f a a n d A r a b i d o p s i s/M.t r u n c a t u l a,a n d t h eb l u e l i n e s r e p r e s e n t c o l l i n e a r C N G C g e n e p a i r s表2M s C N G C基因复制事件T a b l e2M s C N G C g e n e r e p l i c a t i o ne v e n t s基因1/基因2G e n e1/G e n e2K a K s K a/K s D u l p l i c a t e d e d a t e(M y a)重复日期D u l p l i c a t e t y p e重复类型M s C N G C1/M s C N G C4.20.2642.0990.126172.083节段重复M s C N G C7.3/M s C N G C8.20.2120.7670.27662.915节段重复注:对于每个基因对,基于每个位点每年6.1ˑ10-9次替换的速率,将k值转换成以百万年为单位的分化时间㊂重复时间(T)计算为T= K s/(2ˑ6.1ˑ10-9)ˑ10-6M y aN o t e:F o r e a c h g e n e p a i r,t h eK s v a l u e i s t r a n s l a t e d i n t o d i v e r g e n c e t i m e i nm i l l i o n s o f y e a r s b a s e do n a r a t e o f6.1ˑ10-9s u b s t i t u t i o n s p e r s i t e p e r y e a r.T h e d i v e r g e n c e t i m e(T)i s c a l c u l a t e d a sT=K s/(2ˑ6.1ˑ10-9)ˑ10-6M y a2.6M s C N G C蛋白互作网络预测分析为了提供更多关于M s C N G C功能的线索,我们利用S T R I N G在线软件基于拟南芥C N G C蛋白的相互作用预测了该家族成员的蛋白质相互作用网络㊂构建蛋白质相互作用网络(图5)㊂M s C N G C 蛋白中有6个C N G C蛋白存在互作现象㊂其中M s C N G C7.2与M s C N G C4之间存在蛋白互作,其他M s C N G C蛋白之间不存在互作现象㊂M s C-N G C2.1和M s C N G C5共有的互作蛋白有钙调蛋白(C a l c i n e u r i nB-l i k e1,C B L1㊁C a l c i n e u r i nB-l i k e4,C B L4)㊁与C B L蛋白相互作用的植物激酶(C B L-I n-t e r a c t i n g P r o t e i n K i n a s e24,C I P K24)㊁钠/氢交换蛋白(N a+/H+E x c h a n g e r7,N H X7)和参与真核生物前转录R N A剪接和R N A延伸的蛋白质(P r e-t R N A S p l i c i n g F a c t o ra n d R N A E l o n g a t i o n F a c-t o r,P O T5)㊂M s C N G C2.1还与C B L蛋白相互作用的植物激酶(C B L-I n t e r a c t i n g P r o t e i n K i n a s e6, C I P K6)和氢离子A T P酶(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a H ʃA T P a s e1,A H A1)这2个蛋白之间存在互作㊂M s C N G C2.2与植物受体样激酶(P s e u d o m o n a s s y-495第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析r i n ga e p v .t o m a t o D C 3000s t r e s sk i n a s er e c e p t o r 1,P S K R 1)和氢离子A T P 酶(A r ab i d o p s i s t h a l i a n a H ʃA T P a s e 1,AH A 1)之间存在互作㊂M s C -N G C 8.3只和参与真核生物前转录R N A 剪接和R N A 延伸的蛋白质(P r e -t R N AS p l ic i n g Fa c t o r a n d R N A E l o n g a t i o nF a c t o r ,P O T 5)互作㊂M s C N G C 5还与C B L 蛋白相互作用的植物激酶(C B L -I n t e r a c -t i n g Pr o t e i nK i n a s e 10,C I P K 10)之间存在互作㊂此外,M s C N G C 7.2与钙依赖性蛋白激酶(C a l c i u m -d e -pe n d e n t p r o t e i nk i n a s e 32,C P K 32)存在互作㊂图5 紫花苜蓿M s C N G C 蛋白与拟南芥同源基因对的蛋白-蛋白互作网络预测模型F i g .5 P r e d i c t i o nm o d e l o f p r o t e i n -p r o t e i n i n t e r a c t i o n n e t w o r kb e t w e e n M s C N G C p r o t e i n s o f a l f a l f a a n dA r a b i d o ps i s h o m o l o g o u s g e n e p a i r s 2.7 紫花苜蓿M s C N G C 基因在不同组织中的表达模式分析分析了M s C N G C 基因在紫花苜蓿不同组织中的表达模式,M s C N G C 基因具有组织表达特异性(图6)㊂M s C N G C 4.1和M s C N G C 8.1在各个组织中都具有相同的表达水平㊂M s C N G C 1在根瘤组织中不表达;M s C N G C 7.2在花组织中不表达;M s C -N G C 8.4在根组织中不表达;M s C N G C 4.2和M s C N G C 5的表达模式相似,只在花中表达;M s C -N G C 3.1仅在叶中表达;M s C N G C 8.5主要在伸长茎中表达;M s C N G C 8.2基因在伸长茎和短茎组织中均有较高的表达水平,尤其在伸长茎中表达量最高;M s C N G C 7.1在根瘤和根中高表达;M s C -N G C 2.1和M s C N G C 8.4在地上组织中的表达量要显著的高于地下组织,表明M s C N G C s 基因在调节紫花苜蓿生长发育过程中发挥不同的作用㊂图6 M s C N G C 基因在不同组织中的表达模式F i g u r e 6E x pr e s s i o no f M s C N G C g e n e s i nd i f f e r e n t t i s s u e s 注:热图中的数值代表基因的表达量,下同N o t e :T h e v a l u e s i nt h eh e a tm a p r e pr e s e n t t h ea m o u n to f g e n ee x -pr e s s i o n ,t h e s a m e a s b e l o w 2.8 紫花苜蓿M s C N G C 基因在非生物胁迫下的表达模式分析为进一步研究M s C N G C 基因家族对非生物胁迫的响应,利用紫花苜蓿转录组数据分析了M s C N G C s 基因在低温㊁盐㊁干旱和A B A 处理下的表达模式(图7)㊂在低温处理下,M s C N G C 2.2㊁M s C N G C 5㊁M s C -N G C 8.4㊁M s C N G C 8.5的表达量在2h 后与0h 相比明显上调(图7A );M s C N G C 7.1和M s C N G C 7.2的表达趋势一致㊂在盐处理下,M s C N G C s 基因的表达量随着盐处理时间的延长表现出不同程度的下调现象,如M s C N G C 2.2和M s C N G C 5的表达量显著降低(图7B )㊂在干旱处理下,随着处理时间的增加,M s C -N G C 3.2㊁M s C N G C 5和M s C N G C 8.5基因的表达量不断升高(图7C )㊂在A B A 处理下,M s C N G C 2.2的表达量随胁迫时间的延长而降低;M s C N G C 5在3h 表达量明显下调,随处理时间的延长又逐渐升高;M s C N G C 4.2㊁M s C N G C 8.4和M s C N G C 8.5在A B A处理下表达趋势相似,在处理1h 后表达量显著下调㊂M s C N G C 1和M s C N G C 3.1在A B A 处理下的表达量不变(图7D )㊂595草地学报第32卷图7M s C N G C基因在非生物胁迫下的表达模式分析F i g.7 E x p r e s s i o no f M s C NG C s g e n eu n d e r a b i o t i c s t r e s s注:图7C中M代表甘露醇㊂(A)低温处理;(B)盐处理;(C)干旱处理;(D)A B A处理N o t e:I n t h e f i g u r e7C,Ms t a n d s f o rm a n n i t o l.(A)C o l d t r e a t m e n t;(B)S a l t t r e a t m e n t;(C)M a n n i t o l t r e a t m e n t;(D)A B At r e a t m e n t3讨论紫花苜蓿作为最重要的豆科牧草之一,是畜牧业持续健康发展的重要物质基础,因此,研究紫花苜蓿对非生物胁迫的响应是至关重要的㊂C N G C作为一种非选择性的阳离子通道,对C a2+和K+具有渗透性,并已被证实参与植物的生长发育和对各种环境胁迫的响应[24]㊂本研究利用生物信息学方法从在紫花苜蓿全基因组中初步鉴定到了16个C N G C基因,而拟南芥和玉米中分别有20,12个C N G C基因,与M s C N G C基因的数量不同,说明在不同物种间C N G C基因的数量存在差异㊂亚细胞定位预测分析表明,大多数M s C N G C蛋白定位于细胞膜,与拟南芥C N G C基因的亚细胞定位相似[10],推测C N G C蛋白主要在细胞膜上发挥功能㊂物种间的系统发育关系是生物学研究的基础㊂紫花苜蓿和拟南芥中C N G C蛋白的系统发育关系发现,紫花苜蓿和拟南芥的C N G C蛋白被划分为4个亚家族(图1),并且在第Ⅱ和第Ⅳ亚家族中紫花苜蓿与蒺藜苜蓿的C N G C蛋白被划分到同一分支,表明紫花苜蓿和蒺藜苜蓿有较高的亲缘性㊂基因的功能域是调控顺式作用元件活性和基因表达的重要因素㊂拟南芥[10]㊁玉米[27]㊁小麦[29]的C N G C蛋白都含有典型的c N M P/C N B D和I T P功能域,能促进阳离子运输[25]㊂而M s C N G C蛋白成员也含有典型的c N M P/C N B D和I T P功能域,表明M s C-N G C蛋白可能也具有运输阳离子功能㊂外显子和内含子的结构影响基因的表达和蛋白质的功能,意味着外显子和内含子使基因在生物体中发挥重要作用,从而维持生命[26]㊂内含子和外显子分析发现,M s C-N G C基因家族成员的内含子数目分别是4~45不等㊂虽然部分基因外显子/内含子结构相似,但序列长度不同(图2),这与其他植物的外显子/内含子结构相似,如玉米[27]㊁水稻[28]㊁小麦[29]等,说明C N G C家族695第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析基因的结构相对复杂㊂基因启动子区域内的顺式作用元件在基因表达调控中起着至关重要的作用,基因启动子中不同类型的顺式作用元件预示着该基因在应对不同胁迫时可能具有不同的功能[30]㊂对启动子顺式作用元件分析发现,M s C N G C s的启动子中包含大量的植物激素(A B A,I A A,J A,G A)响应元件㊁光响应元件和胁迫(光照,低温,干旱)响应元件(图3),表明M s C N G C基因可能参与调控胁迫响应及植物激素信号转导㊂例如,M s C N G C2.2,M s C N G C4.1,M s C-N G C4.2和M s C N G C7.3基因含有干旱响应(M B S)元件,表明它们可能在干旱胁迫下具有活性㊂M s C-N G C7.2和M s C N G C8.3基因具有多个激素应答元件,它们可能在植物的激素应答和各种生理代谢过程的调控中发挥作用㊂M s C N G C基因分布在紫花苜蓿的7条染色体上,第6号染色体上没有M s C N G C基因,因此, M s C N G C的分布是不均匀,与玉米㊁水稻C N G C基因在染色体上的分布相似[26,28]㊂基因复制是基因组进化和物种遗传最重要的驱动力之一[31]㊂植物中基因家族扩增的两个主要原因是节段重复和串联重复㊂基因复制不仅可以为基因家族增加新成员,还可以丰富基因家族的功能,极大地促进了各种生物的遗传进化[32]㊂在本研究中,M s C N G C基因家族中存在2对节段重复事件(M s C N G C1/M s C-N G C4.2,M s C N G C7.3/M s C N G C8.2)(图4A),表明他们可能在功能上具有相似性㊂M s C N G C s基因与蒺藜苜蓿之间存在共线性关系,可能由于其是同科植物和亲缘关系较近,也表明它们可能具有相似的功能,这需要进一步的研究㊂M s C N G C与拟南芥存在共线性,为预测M s C N G C基因的表达和蛋白的功能提供了依据㊂进一步蛋白质相互作用网络预测发现,M s C N G C4与M s C N G C7.2之间存在蛋白互作,同时M s C N G C蛋白还与C B L,C I P K,NH X7, P O T5和C P K32蛋白之间存在互作关系㊂这些结果为深入研究M s C N G C蛋白的潜在功能提拱了依据㊂组织表达分析表明,第ⅣB亚家族中M s C-N G C4.1和M s C N G C8.1的组织表达一致,可能与它们的亲缘性较高有关(图1)㊂M s C N G C基因具有组织表达特异性,例如,M s C N G C4.2和M s C-N G C5基因只在花中表达,M s C N G C3.1基因只在叶中表达,说明M s C N G C s在各个组织中发挥着不同的作用㊂类似的,Z m C N G C5在玉米花粉中的特异性表达高于其他组织,Z m C N G C10㊁Z m C N G C11和Z m C N G C12在玉米胚中的表达量都相对较高[27],说明这些基因在玉米的花粉和胚的生长发育中起着至关重要的作用㊂C N G C家族基因参与了非生物胁迫响应过程[13,16,21]㊂转录组数据分析表明,大多数M s C N G C基因在冷㊁盐㊁干旱和A B A胁迫下表达量下降,有少数M s C N G C基因的表达量上升㊂如M s C N G C2.2㊁M s C-N G C5㊁M s C N G C8.4㊁M s C N G C8.5受冷胁迫诱导下在2h显著上调表达,该结果与R c C N G C14和部分油菜籽C N G C s在冷诱导下的表达模式相同[13];第Ⅲ亚家族中M s C N G C7.1和M s C N G C7.2在冷胁迫诱导下的表达水平一致,这与它们可能在进化关系上的亲缘性较高有关(图2A)㊂在盐处理下M s C N G C2.2与拟南芥中的A t C N G C19和A t C N G C20的表达水平类似[19],它们可能参与了植物对盐胁迫时的生理调控㊂M s C N G C5㊁M s C N G C8.5与P t r C N G C15.2㊁P t r C N G C15.3在干旱胁迫下的表达相似[12]㊂研究发现沉默S l C N G C15基因的表达可提高番茄耐旱性,为进一步研究M s C N G C基因在非生物胁迫下的功能提供依据[33-35]㊂4结论本研究对紫花苜蓿的C N G C家族成员进行了鉴定分析,从紫花苜蓿参考基因组中共鉴定出16个M s C N G C基因,并对其蛋白分子特征㊁进化关系㊁保守基序㊁基因结构㊁重复事件㊁共线性关系㊁顺式作用元件和表达模式进行了研究㊂M s C N G C基因被划分为4个亚家族,所有成员均含有c N M P/C N B D和I T P功能域㊂M s C N G C基因家族内存节段重复事件,紫花苜蓿与蒺藜苜蓿和拟南芥之间存在物种间共线性关系㊂M s C N G C基因的启动子区含有大量与非生物应激和激素响应相关的顺式作用元件㊂M s C N G C基因具有组织表达特异性㊂M s C N G C基因参与调控紫花苜蓿的冷㊁干旱㊁盐和A B A等非生物胁迫响应过程,其中,M s C N G C3.2,M s C N G C5和M s C N G C8.5能是调控紫花苜蓿耐干旱的关键差异基因㊂参考文献[1] WU M,L IY,C H E ND,L I U H,e t a l.G e n o m e-w i d e i d e n t i f i c a-t i o na n de x p r e s s i o na n a l y s i so f t h e I Q D g e n e f a m i l y i n m o s ob a m b o o(P h y l l o s t ac h y s ed u l i s)[J].S c ie n t if i cR e p o r t s,2016,(6):24520[2] S A A N D M A,X U YP,MU N Y AM P U N D UJ P,e t a l.P h y l o g-e n y a n de v o l u t i o nof p l a n t c y c l i cn u c l e o t i d e-g a t e d i o nch a n n e l(C N G C)g e n e f a m i l y a n d f u n c t i o 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《黄花苜蓿MfERF070基因的克隆及其抗逆功能初探》范文

《黄花苜蓿MfERF070基因的克隆及其抗逆功能初探》篇一一、引言近年来，基因工程技术得到了迅猛的发展，利用基因克隆技术来研究特定基因的功能已经成为生物学领域的重要手段。

黄花苜蓿作为一种重要的植物资源，其抗逆性备受关注。

本文旨在克隆黄花苜蓿中的MfERF070基因，并对其抗逆功能进行初步探索。

二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括黄花苜蓿植株、PCR引物、DNA提取试剂盒、感受态细胞等。

2. 方法（1）基因克隆：首先从黄花苜蓿中提取总DNA，设计特异性引物，通过PCR技术扩增MfERF070基因片段，然后将其克隆至表达载体中。

（2）抗逆功能初探：通过构建MfERF070基因的过表达和沉默载体，分别转化至模式植物中，观察其在不同逆境条件下的生长状况及生理指标变化。

三、实验结果1. 基因克隆通过PCR技术成功扩增出MfERF070基因片段，并将其克隆至表达载体中。

经测序验证，成功获得了MfERF070基因的序列。

2. 抗逆功能初探（1）过表达载体转化植物：将MfERF070基因的过表达载体转化至模式植物中，发现在干旱、盐碱等逆境条件下，过表达MfERF070基因的植物生长状况明显优于野生型植物。

（2）沉默载体转化植物：将MfERF070基因的沉默载体转化至模式植物中，发现其逆境耐受能力显著降低，表明MfERF070基因在植物抗逆过程中发挥重要作用。

四、讨论本实验成功克隆了黄花苜蓿中的MfERF070基因，并初步探索了其抗逆功能。

实验结果表明，MfERF070基因在植物抗逆过程中发挥重要作用。

通过构建过表达和沉默载体并转化至模式植物中，我们发现过表达MfERF070基因的植物在干旱、盐碱等逆境条件下的生长状况明显优于野生型植物，而沉默该基因的植物则表现出较低的逆境耐受能力。

这表明MfERF070基因具有提高植物抗逆性的潜力。

然而，本实验仅对MfERF070基因的抗逆功能进行了初步探索，还需要进一步研究其在植物抗逆机制中的具体作用途径及分子机制。

《MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿耐寒性的研究》范文

《MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿耐寒性的研究》篇一一、引言紫花苜蓿是一种重要的牧草作物，其高产、营养丰富的特点使其在全球范围内得到了广泛的种植和应用。

然而，寒害仍是影响紫花苜蓿产量和质量的重要限制因素之一。

为了提高紫花苜蓿的耐寒性，我们进行了基因工程技术研究，试图利用MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿的耐寒性。

二、研究方法本研究以紫花苜蓿为研究对象，利用基因工程技术将MfERF028基因转入紫花苜蓿中，以期通过该基因的表达提高其耐寒性。

首先，我们克隆了MfERF028基因，并构建了相应的表达载体。

然后，通过农杆菌介导的方法将该基因转入紫花苜蓿中，获得转基因紫花苜蓿。

接着，我们对转基因紫花苜蓿进行了耐寒性鉴定，以评估MfERF028基因的表达对紫花苜蓿耐寒性的影响。

三、实验结果1. MfERF028基因的克隆与表达载体的构建我们成功克隆了MfERF028基因，并构建了相应的表达载体。

通过PCR和测序验证，确认了该基因的正确性。

2. 转基因紫花苜蓿的获得通过农杆菌介导的方法将MfERF028基因转入紫花苜蓿中，我们成功获得了转基因紫花苜蓿。

通过对转基因植株的PCR鉴定和基因表达分析，证实了MfERF028基因在转基因紫花苜蓿中的成功表达。

3. 转基因紫花苜蓿的耐寒性鉴定我们对转基因紫花苜蓿进行了耐寒性鉴定。

通过在低温环境下对转基因和未转基因的紫花苜蓿进行生长和生理指标的测定，我们发现转基因紫花苜蓿的耐寒性明显提高。

具体表现为在低温环境下，转基因紫花苜蓿的生长速度更快，叶片的叶绿素含量更高，且细胞膜的稳定性更好。

这表明MfERF028基因的表达显著提高了紫花苜蓿的耐寒性。

四、讨论本研究表明，通过将MfERF028基因转入紫花苜蓿中，可以提高其耐寒性。

这一研究为进一步应用基因工程技术提高作物的抗逆能力提供了理论依据和技术支持。

然而，基因编辑过程和该过程可能产生的潜在环境影响需要进一步的考虑和探讨。

《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》范文

《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》篇一一、引言紫花苜蓿作为一种重要的豆科植物，具有丰富的营养价值和生态价值。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对紫花苜蓿的基因研究逐渐深入。

SKIP基因作为一种重要的调控基因，在多种生物中发挥着重要的功能。

因此，本文旨在克隆紫花苜蓿中的SKIP同源基因，并对其功能进行鉴定，以期为进一步研究紫花苜蓿的生长发育和抗逆机制提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本实验所使用的紫花苜蓿材料采自于……（具体地点），经过无菌处理后用于基因克隆实验。

2. 方法（1）基因克隆a. RNA提取及cDNA合成：从紫花苜蓿中提取总RNA，反转录合成cDNA。

b. 设计引物：根据已知SKIP基因的序列信息，设计特异性引物。

c. PCR扩增：以cDNA为模板，进行PCR扩增，获得SKIP 同源基因片段。

d. 序列分析：对PCR产物进行测序，分析序列信息。

（2）功能鉴定a. 表达模式分析：通过实时荧光定量PCR技术，分析SKIP 同源基因在紫花苜蓿不同组织、不同发育阶段的表达情况。

b. 转基因植物构建及功能验证：构建SKIP同源基因的过表达和敲除植物，观察其对植物生长、抗逆性能等方面的影响。

c. 蛋白质互作分析：通过酵母双杂交等技术，分析SKIP同源基因与其他蛋白质的互作关系。

三、实验结果1. 基因克隆结果通过上述方法，成功克隆了紫花苜蓿中的SKIP同源基因，并进行了序列分析。

结果表明，该基因与已知的SKIP基因具有较高的相似性，表明其可能具有相似的功能。

2. 功能鉴定结果（1）表达模式分析结果实时荧光定量PCR结果表明，SKIP同源基因在紫花苜蓿的不同组织、不同发育阶段中均有表达，且表达量存在一定的差异。

这表明该基因可能参与紫花苜蓿的多种生物过程。

（2）转基因植物构建及功能验证结果过表达和敲除植物的实验结果表明，SKIP同源基因对紫花苜蓿的生长、抗逆性能等方面具有显著影响。

过表达植物表现出更强的生长势和抗逆性能，而敲除植物则表现出相反的趋势。

紫花苜蓿花期调控基因MsCOL2的克隆及功能研究

第31卷第10期V o l.31N o.10草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2023年10月O c t.2023d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2023.10.002引用格式:卢栋宇,王雪,蒋旭,等.紫花苜蓿花期调控基因M s C O L2的克隆及功能研究[J].草地学报,2023,31(10): 2905-2915L U D o n g-y u,WA N G X u e,J I A N G X u,e ta l.C l o n i n g a n d F u n c t i o n a l A n a l y s i so fF l o w e r i n g R e g u l a t i o n G e n e M s C O L2i nA l f a l f a[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2023,31(10):2905-2915紫花苜蓿花期调控基因M s C O L2的克隆及功能研究卢栋宇,王雪,蒋旭,张云秀,张丽丽,栗亚静,康俊梅*(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193)摘要:开花是植物由营养生长过渡到生殖生长的转折点,紫花苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a L.)的产量和品质与开花时间密切相关㊂光周期是影响植物开花的重要因素之一,C O N S T A N S-l i k e(C O L)基因家族在光周期开花调控途径中发挥重要的作用㊂为揭示C O L家族基因在紫花苜蓿开花调控中的功能,本研究克隆了M s C O L2基因,该基因编码401个氨基酸;组织差异性表达分析显示,M s C O L2在花中表达量最高;花不同发育时期表达分析显示,M s C O L2在花芽分化期表达量最高;在不同光周期条件下,M s C O L2的表达水平具有不同的节律性表达;外源激素50μm o l㊃L-1赤霉素和100μm o l㊃L-1水杨酸处理后,M s C O L2表达水平呈现不同的变化趋势㊂为了验证过表达M s C O L2对开花相关基因表达的影响,分析了过表达M s C O L2株系中开花相关基因的表达水平,结果显示促进开花基因的表达水平下调,抑制开花基因的表达水平上调㊂表型观察显示,过表达株系延迟开花,表明M s C O L2对延迟开花有重要的调节作用㊂关键词:紫花苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a L.);M s C O L2;开花时间;表达分析中图分类号:S541.9文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2023)10-2905-11C l o n i n g a n dF u n c t i o n a l A n a l y s i s o f F l o w e r i n g R e g u l a t i o nG e n e M s C O L2i nA l f a l f a L UD o n g-y u,WA N G X u e,J I A N G X u,Z H A N G Y u n-x i u,Z H A N GL i-l i,L IY a-j i n g,K A N GJ u n-m e i*(I n s t i t u t e o fA n i m a l S c i e n c e,C h i n e s eA c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,B e i j i n g100193,C h i n a)A b s t r a c t:F l o w e r i n g i s a t u r n i n gp o i n t f o r p l a n t s f r o mv e g e t a t i v e g r o w t h t o r e p r o d u c t i v e g r o w t h.T h e y i e l d a n d q u a l i t y o f a l f a l f a(M e d i c a g o s a t i v a L.)a r e c l o s e l y r e l e v a n t t o i t s f l o w e r i n g t i m e.P h o t o p e r i o d i s o n e o f t h e i m p o r t a n t f a c t o r s a f f e c t i n gp l a n t f l o w e r i n g.T h eC O N S T A N S-l i k e(C O L)g e n e f a m i l yp l a y s a n i m p o r-t a n t r o l e i n t h e r e g u l a t i o no f p h o t o p e r i o d f l o w e r i n g.I no r d e r t o r e v e a l t h e f u n c t i o no f C O L f a m i l yg e n e s i n a l f a l f a f l o w e r i n g r e g u l a t i o n,M s C O L2g e n ew a s c l o n e d f r o ma l f a l f a i n t h i s s t u d y.T h i s g e n e e n c o d e s f o r401 a m i n o a c i d s.T i s s u ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o na n a l y s i ss h o w e dt h a t M s C O L2h a dt h eh i g h e s te x p r e s s i o ni n f l o w e r s.E x p r e s s i o na n a l y s i s a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e so f f l o w e r i n g s h o w e d t h a t M s C O L2h a d t h e h i g h e s t e x p r e s s i o n l e v e l a t f l o w e r b u dd i f f e r e n t i a t i o n s t a g e;u n d e r d i f f e r e n t p h o t o p e r i o dc o n d i t i o n s,t h e e x-p r e s s i o n l e v e l o f M s C O L2h a d d i f f e r e n t r h y t h m i c e x p r e s s i o n s;A f t e r t r e a t m e n tw i t h e x o g e n o u s h o r m o n e s50μm o l㊃L-1G i b b e r e l l i n3(G A3)a n d100μm o l㊃L-1S a l i c y l i ca c i d(S A),t h ee x p r e s s i o n l e v e l o f M s C O L2 s h o w e dd i f f e r e n t t r e n d s.I no r d e r t ov e r i f y t h ee f f e c to fo v e r e x p r e s s i o no f M s C O L2o nt h ee x p r e s s i o no f f l o w e r i n g-r e l a t e d g e n e s,t h ee x p r e s s i o nl e v e l so ff l o w e r i n g-r e l a t e d g e n e su n d e ro v e r e x p r e s s i o n M s C O L2 l i n e sw e r e a n a l y z e d.T h e r e s u l t ss h o w e dt h a t t h ee x p r e s s i o n l e v e l o f t h e g e n e s p r o m o t i n g f l o w e r i n g w a s d o w n-r e g u l a t e da n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f t h e g e n e s i n h i b i t i n g f l o w e r i n g w a su p-r e g u l a t e d.F l o w e r i n g p h e n o t y p ea n a l y s i ss h o w e dt h a to v e r e x p r e s s i o no f M s C O L2d e l a y e df l o w e r i n g,i n d i c a t i n g t h a t M s C O L2 p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n r e g u l a t i n g o f d e l a y e d f l o w e r i n g.K e y w o r d s:A l f a l f a;M s C O L2;F l o w e r i n g t i m e;E x p r e s s i o na n a l y s i s收稿日期:2023-04-15;修回日期:2023-05-28基金项目:国家自然科学基金(32071868)资助作者简介:卢栋宇(1995-),汉族,河北三河人,男,硕士研究生,主要从事饲草遗传育种研究,E-m a i l:1571687177@q q.c o m;*通信作者A u-t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:k a n g j u n m e i@c a a s.c nCopyright©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷开花是植物从营养生长向生殖生长过渡的转折点,是高等植物繁衍后代,延续物种的重要生理过程[1]㊂开花时间是由植物内源信号与外界环境因子共同精细地调控[2]㊂开花时间的早晚对饲草作物的产量和品质有重要的影响㊂开花前植物处于营养生长时期,光合产物主要用于营养体生长;开花后光合产物发生重新分配从营养器官转向了繁殖器官,并伴随着木质化程度的增加,导致饲草品质显著下降[3]㊂因此,花期调控的分子机制一直是植物发育生物学研究的热点和难点㊂植物在长期的进化过程中形成了复杂精确的调节机制,通过响应内源信号和环境变化来调节开花时间[4]㊂通过对模式植物拟南芥开花发育及遗传学分析表明,开花调控主要有6条途径,分别为光周期途径㊁赤霉素途径㊁春化途径㊁温度途径㊁年龄途径和自主途径[5-6]㊂其中光周期是影响植物开花的重要因素之一㊂研究表明,C O N S T A N S-L i k e(C O L)基因家族成员具有保守的B-b o x和C C T结构域[7],在光周期开花诱导过程中起关键作用[8],在不同物种中C O L的功能复杂多样[9-12]㊂在拟南芥中,C O在长日照条件下作为正调控因子促进开花[13];过量表达C O L5可以诱导短日照条件下拟南芥的开花[14]㊂对C O L1和C O L2的研究表明,它们对拟南芥的开花时间几乎没有影响,但过量表达C O L1能够缩短昼夜节律的周期[15]㊂在拟南芥中过表达C O L8和C O L9导致晚花表型[16-17]㊂C O L开花的功能在其他物种中也有研究㊂水稻中的H e a d i n g d a t e1(H d1),与拟南芥C O同源,在短日照条件下诱导开花,在长日照(L D)条件下则会抑制开花[18]㊂大豆中G m C O L1a 和G m C O L1b在长日照条件下起到抑制开花作用[19]㊂大麦中C O的同源蛋白H v C O9有助于延迟大麦的开花[20]㊂在杨树中,C O1和C O2在杨树C O同系物中与拟南芥C O的序列相似性最高,但对开花时间没有明显的调节作用[21]㊂芒果中M i-C O L1A和M i C O L1B在L D条件下抑制开花[22]㊂虽然在拟南芥㊁水稻㊁大豆等植物中开展了对C O L 的功能研究,但在紫花苜蓿中未见相关报道㊂紫花苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a L.)是多年生优质豆科牧草,其产草量高㊁蛋白质含量丰富,对奶业等草牧业的健康发展具有不可替代的作用[23]㊂紫花苜蓿的产量和品质与开花时间密切相关,其最佳刈割期是现蕾期和初花期,此时产量和品质均为最佳㊂收割的时间过早,苜蓿的产量会受到影响,收割时间过晚会导致苜蓿的品质下降㊂而苜蓿产量的增加,主要以增加营养体的产量为目标,如果延迟开花,就可以延长营养体生长的时间,从而达到提高产量和品质的目标㊂因此,晚花苜蓿品种的培育可以为苜蓿生产带来较大的经济效益,具有广阔的应用前景㊂本研究克隆了紫花苜蓿M s C O L2基因,分析了其在不同组织与花发育时期的表达差异以及不同诱导条件下M s C O L2的表达模式;通过对过表达M s C O L2转基因紫花苜蓿株系开花表型的观测,揭示了M s C O L2调控开花的功能,本研究为解析M s C O L2调控紫花苜蓿开花的分子机制奠定了基础㊂1材料与方法1.1实验材料用于表达模式分析和遗传转化的材料为中苜1号紫花苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a L. Z h o n g m u N o.1 ),由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所育成并保存㊂实验用载体:植物表达载体p C A M B I A3301-M s C O L2,大肠杆菌感受态D H5α,农杆菌感受态E H A105㊂1.2实验方法1.2.1苜蓿培养与处理挑选饱满大小均匀一致的紫花苜蓿种子,置于铺有双层滤纸的培养皿中发芽7d,待子叶展开后移栽到1/2H o a g l a n d营养液中,置于植物培养箱(16h光照/8h黑暗,温度24ħ,湿度60%~70%),每周更换一次营养液,培养3周后进行光周期和激素处理㊂长日照处理为16h光照/8h黑暗,短日照处理为8h光照/16h黑暗,分别在0,4,8,12,16,20,24h共7个时间点收集幼苗叶片部分;激素处理分别用50μm o l㊃L-1赤霉素(G i b b e r e l l i ca c i d,G A3)和100μm o l㊃L-1水杨酸(S a l i c y l i c a c i d,S A)处理,分别在0,1,3,6,12h共5个时间点收集幼苗叶组织㊂不同组织及花发育时期目标基因的表达分析所用材料为中苜1号扦插苗,连续刈割两次挑选生长状态一致的植株,分别取叶㊁茎和花,其中叶㊁茎组织取样时期为花芽分化期,花组织分别取花芽分化期的花苞㊁初花期尚未开放的花蕾和盛花期开放的花朵㊂所取试验材料置于液氮中冷冻,保存于-80ħ冰箱备用㊂测试材料均为3个生物学重复㊂6092Copyright©博看网. All Rights Reserved.第10期卢栋宇等:紫花苜蓿花期调控基因M s C O L2的克隆及功能研究1.2.2植物总R N A的提取及c D N A合成植物总R N A的提取利用R N A提取试剂盒(P r o m e g a,上海普洛麦格生物技术有限公司),详细步骤参照试剂盒说明书㊂R N A完整性采用1%琼脂糖凝胶电泳检测,并用紫外分光光度计(N a n o D r o p2000)检测R N A的浓度㊂c D N A的反转录,利用反转录试剂盒(北京金沙生物科技有限公司),实验过程详见试剂盒说明书㊂1.2.3M s C O L2的克隆利用紫花苜蓿M s C O L2全长C D S序列设计P C R引物(表1),以紫花苜蓿c D N A为模板,利用E x T a g D N A聚合酶进行P C R 扩增,反应体系为50μL:c D N A2μL,T a k a R aE X T a q0.5μL,10ˑE X T a q B u f f e r5μL,d N T P M i x-u r e4μL,M s C O L2引物各2.5μL,去离子水33.5μL㊂反应程序为95ħ5m i n;95ħ30s,52ħ30s, 72ħ1m i n20s,25个循环;72ħ5m i n㊂P C R产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后纯化㊂1.2.4组织差异性及不同诱导条件下的表达模式分析利用q R T-P C R检测M s C O L2的表达水平,以紫花苜蓿A c t i n为内参㊂将c D N A稀释20倍备用,实时荧光定量P C R体系为20μL,反应体系如下:10μL2ˑT a q P r oU n i v e r s a l S Y B R q P C R M a s-t e rM i x;0.4μL q C O L2-F;0.4μL q C O L2-R;2μL c D N A;7.2μL去离子水㊂引物序列见表1㊂表1基因克隆及载体构建引物序列T a b l e1 P r i m e r s e q u e n c e s f o r g e n e c l o n i n g a n dv e c t o r c o n s t r u c t i o n引物P r i m e r核酸序列(5'-3')N u c l e o t i d e s e q u e n c e(5'-3')功能F u n c t i o nM s C O L2-F A C A A A C C A T T C A T C A C T C C C C M s C O L2克隆M s C O L2-R A C C A T C A A T T C A A A C A T G C A C T C l o n i n g o f M s C O L2M13-F T G T A A A A C G A C G G C C A G T阳性单菌落鉴定M13-R C A G G A A A C A G C T A T G A C C P o s i t i v e s i n g l e c o l o n y i d e n t i f i c a t i o n 35S-F G C A C A A T C C C A C T A T C C T T G T转基因植株阳性鉴定G U S-R A G T T T T T T G A T T T C A C G G G T T G A T G P o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o no f t r a n s g e n i c p l a n t s W-C O L2-F A C C A T C A A T T C A A A C A T G C A C T A C A A A C C A T T C A T C A C T C C C C M s C O L2克隆W-C O L2-R A G A A A T T T A C C C T C A G A T C T A C C A T A C C A T C A A T T C A A A C A T G C A C T C l o n i n g o f M s C O L21.3生物信息学分析利用N C B I的O R F f i n d e r(h t t p s://w w w.n c b i. n l m.n i h.g o v/o r f f i n d e r/)预测最大开放阅读框;通过D N AMA N进行氨基酸同源序列比对; M E G A11.0软件使用邻接法构建进化树,B o o t-s t r a p设置为1000次[24];利用P r o t s c a l e(h t t p s:// w e b.e x p a s y.o r g/c g i-b i n/p r o t s c a l e/p r o t s c a l e.p l)预测跨膜结构域;利用E x A S y(h t t p s://w e b.e x p a s y. o r g/c g i-b i n/c o m p u t e p i)预测M s C O L2蛋白分子量大小㊁理论等电点和亲水性;利用P l a n t c a r e(h t-t p://b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t-c a r e/)预测分析启动子区域(起始密码A T G上游2 k b)顺式作用元件㊂利用S O P MA(h t t p s://n p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/n p s a_a u t o m a t.p l?p a g e= n p s a_s o p m a.h t m l)预测蛋白的二级结构;利用C e l l-P L o c2.0(h t t p://w w w.c s b i o.s j t u.e d u.c n/b i o i n f/ p l a n t-m u l t i/)进行蛋白亚细胞定位分析㊂以上软件均使用默认参数进行分析㊂1.4过表达载体的构建与遗传转化利用测序正确的p T O P O-M s C O L2质粒扩增带有同源臂的P C R产物,将带有同源臂的扩增产物与p C AM B I A3301载体进行同源重组㊂将构建好的载体转入E H A105农杆菌中,采用根癌农杆菌侵染法[25],以紫花苜蓿叶片为外植体进行遗传转化㊂将转化后的外植体在无抗性S H3a 培养基上共培养24~48h,移入S H3a(2m g㊃L-1草铵膦㊁400m g㊃L-1头孢霉素)培养基中,置于人工培养箱避光培养6~8周㊂将愈伤组织转入M S B K培养基(2m g㊃L-1草铵膦㊁400m g㊃L-1头孢霉素)中,进行光照培养(16h光照/8h黑暗,温度22ħ,湿度60%),诱导丛生芽生长㊂2~3周后将含有丛生芽的愈伤组织转入S H9a培养基(2m g㊃L-1草铵膦㊁400m g㊃L-1头孢霉素)中诱导根芽分化,直至长出幼苗和强壮的根系,移入土壤生长(营养土ʒ蛭石=1ʒ1),置于人工气候室培养(条件同上)㊂1.5紫花苜蓿阳性苗鉴定及M s C O L2的表达分析遗传转化的紫花苜蓿再生植株提取基因组D N A采用快检法:剪取20m g叶片放入200μL D N A提取液中研磨,研磨完全后13000r㊃m i n-1离心15m i n,随后吸取160μL上清液转移到一个新的1.5m L离心管中,加入160μL异丙醇吸打混匀,将混合液13000r㊃m i n-1离心15m i n,弃上清液,将离心管倒置30m i n,倒置结束后向离心管中7092Copyright©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷加入20μL灭菌水悬浮,所得D N A溶液,保存在-20ħ冰箱㊂以提取的D N A为模板,利用通用引物35S-F/G U S-R(表1)进行P C R扩增,扩增体系如下:5μL2ˑt a q P C R M i x,0.5μL35S-F,0.5μL G U S-R,1μL D N A,3μL去离子水㊂用移液枪轻轻吹打混匀,瞬时离心后进行P C R反应,P C R扩增体系为:95ħ5m i n,95ħ30s,50ħ30s,72ħ1m i n, 25c y c l e s,72ħ5m i n㊂反应结束后将P C R产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测㊂1.6开花相关基因的表达分析开花相关基因的表达对植物的开花有重要影响㊂为探究过量表达M s C O L2对紫花苜蓿开花相关基因表达的影响,选取2个M s C O L2表达量较高的转基因株系进行功能验证分析㊂本研究挑选了已报道的12个开花相关的基因,其中促进开花基因为M s P H Y A, M s G I,M s F K F1,M s F T a1,M s S O C a1,M s S P L13, M s C O和M s L F Y,抑制开花相关基因为M s S V P, M s T O C a1,M s E L F4和M s E F M(引物序列见表2)㊂表2研究所用的定量引物序列T a b l e2 S e q u e n c e s o f t h e q u a n t i t a t i v e p r i m e r su s e d i n t h e s t u d y引物P r i m e r核酸序列(5'-3')N u c l e o t i d e s e q u e n c e(5'-3')功能F u n c t i o nq C O L2-F C G A T G C C A C C A A C G A A G A A G实时定量P C R q R T-P C R q C O L2-R G A T T G A G A T C A G G G A A T T T A G G GM s a c t i n-F C A A A A G A T G G C A G A T G C T G A G G A T q R T-P C R内参基因M s a c t i n-R C A T G C A C C A G T A T G A C G A G G T C G A c t i n g e n e f o r q R T-P C R M s P H Y a-F G C A T A T C G C G A T G G A A A C C T T GM s P H Y a-R A A A G G T T C A A C T T G C C A C C CM s G I-F A A A C C T T T T G A A G T G T C G T C T A G C AM s G I-R G A G A C G C T C A G A G C A C G G A C A T GM s F K F1-F T C A A C T G G G T A T C G T G C T C AM s F K F1-R A A C G A C T G G A T C C A C C A A A GM s F T a1-F T G T A T C A C C A T G A G T C A A G A C A T T GM s F T a1-R C A A T G T C T T G A C T C A T G G T G A T A C AM s S P L13-F C A C T T C A T A G C C A A A C C A C A C C T C T TM s S P L13-R A G G G C T G C A T A A G A G A C A T T G A A T G AM s C O-F T G C T G C T T C T C T T T G C T C C AM s C O-R G C C G A C A A A G C C T T C A T C T T开花相关基因的表达分析M s L F Y-F A G T C A C T C C T T C A A C T G C T C C E x p r e s s i o na n a l y s i s o f M s L F Y-R G A T G T T C T C T T T G T C T C T C T C A C C C f l o w e r i n g r e l a t e d g e n e s M s S O C1-F G C G T T G T T C G A G C A A G A A A G A A T C A G G CM s S O C1-R G G G G C T G C T T A G A G A G C C T G G C A T T TM s T O C1-F A G A A A C A T G C T G G A G A G G T A GM s T O C1-R C A C C A A G C A T T T G A A G A G C A T TM s E F M-F A G A A A C A T G C T G G A G A G G T A GM s E F M-R C A C C A A G C A T T T G A A G A G C A T TM s S V P-F T T T G A A G A G G A C A G G C T T A G G GM s S V P-R A T A A C C A T C A C A T A C C T G A G G A CM s E L F4-F A G T T T C A G G C A G G T T C A G T C GM s E L F4-R C T T C A C C A T A T T A T C A G G C A T T C T2结果与分析2.1M s C O L2的克隆与生物信息学分析以紫花苜蓿c D N A为模板克隆了M s C O L2, C D S序列长度为1206b p,编码401个氨基酸㊂B l a s t结果和系统进化树分析表明,该基因编码蛋白的氨基酸序列与豆科模式植物蒺藜苜蓿的C O L亲缘关系最近,相似度为95.28%,故命名为M s C O L2 (图1,2)㊂通过同源氨基酸多重序列比对分析和保守结构域预测,M s C O L2基因编码的氨基酸序列含有两段由44个氨基酸组成的典型B B o x保守区和一段由43个氨基酸组成的典型C C T保守结构域(图1)㊂为了预测M s C O L2的功能,利用P l a n t C A R E软件预测该基因的顺式作用元件,结果显示,该基因启动子包含多个顺式作用元件,其中包括G T1,G-b o x 等一系列光响应元件,还包含有G A R E-m o t i f和P-b o x等赤霉素和水杨酸响应元件(表3)㊂E x P A S y在线预测M s C O L2蛋白分子量为43.96 k D a,理论等电点为5.00;M s C O L2全部氨基酸的平均8092Copyright©博看网. All Rights Reserved.第10期卢栋宇等:紫花苜蓿花期调控基因M s C O L 2的克隆及功能研究亲水系数为-0.527,表明其为亲水性蛋白质(图3A )㊂对M s C O L 2蛋白分析结果显示,该蛋白的二级结构以无规则卷曲为主,占总体的57.11%,α-螺旋占29.43%,β-折叠占2%,转角为11.47%(图3C );T M H MM 预测该蛋白无跨膜结构域(图3B );通过C e l l -P L o c 2.0软件预测,该蛋白定位在细胞核上(图3D)㊂图1 M s C O L 2与其他物种的多序列比对F i g .1 M u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t o fM s C O L 2w i t ho t h e r s pe c i e s 注:方框内为B B o x 结构域,下划线为C C T m o t if ㊂G m 为大豆;M t 为蒺藜苜蓿;A t 为拟南芥;Z m 为玉米;O s 为水稻;T a 为小麦N o t e :T h eB B o xd o m a i n i s i n s i d e t h e b o xa n du n d e r l i n e d i sC C T m o t i f .G ms t a n d s f o r G l y c i n em a x ;M t s t a n d s f o r M e d i c a go t r u n c a t u l a ;A t s t a n d s f o r A r a b i d o p s i s t h a l i a n a ;Z ms t a n d s f o r Z e am a y s ;O s s t a n d s f o r O r yz a s a t i v a ;T a s t a n d s f o r T r i t i c u ma e s t i v um 图2 M s C O L 2进化树分析F i g .2 P h y l o g e n e t i c a n a l ys i s o fM s C O L 2注:G m 为大豆;M s 为紫花苜蓿;M t 为蒺藜苜蓿;A t 为拟南芥;O s 为水稻;Z m 为玉米;T a 为小麦㊂分叉处数值为b o o t s t r a p 校正值N o t e :G ms t a n d s f o r G l y c i n em a x ;M s s t a n d s f o r M e d i c a g o s a t i v a ;M t s t a n d s f o r M e d i c a g o t r u n c a t u l a ;A t s t a n d s f o r A r a b i d o ps i s t h a l i a n a ;O s s t a n d s f o r O r y z a s a t i v a ;Z ms t a n d s f o r Z e am a ys ;T a s t a n d s f o r T r i t i c u ma e s t i v u m .T h e v a l u e a t t h eb i f u r c a t i o n i s t h e p o s i t i v ev a l u eo f b o o t s t r a p co r r e c t i o n 9092Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷图3 M s C O L 2生物信息学分析F i g .3 B i o i n f o r m a t i c s a n a l ys i s o fM s C O L 2注:A 为M s C O L 2的亲水性;B 为M s C O L 2无跨膜结构;C 为M s C O L 2的二级结构;D 为M s C O L 2的亚细胞定位预测N o t e :As t a n d s f o rH y d r o p h i l i c i t y o fM s C O L 2p r o t e i n p r e d i c t e db y Pr o t s c a l e ;Bs t a n d s f o rN o n -t r a n s m a m r a n ed o m a i n f o rM s C O L 2p r o t e i n p r e d i c t e db y TMHMM ;Cs t a n d s f o r S e c o n d a r y s t r u c t u r e o fM s C O L 2p r e d i c t e db y SO P MA ;Ds t a n d s f o rP r e d i c t i o no fM s C O L 2s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o nb y Ce l l -P l o c 表3 启动子作用元件分析T a b l e 3 P r e d i c t i v e a n a l y s i s o f p r o m o t e r a c t i n g el e m e n t s 顺式作用元件C i s a c t i n g e l e m e n t 序列S e q u e n c e (5'-3')物种S pe c i e s 功能F u n c t i o nB O X -4A T T A A T 欧芹P e t r o s e l i n u mc r i s pu m 光响应元件P a r t o f a l i g h t r e s p o n s i v e e l e m e n t G A -m o t i fA T A G A T A A 拟南芥A r a b i d o p s i s t h a l i a n a 光响应元件P a r t o f a l i g h t r e s p o n s i v e e l e m e n t G T 1-m o t i f G G T T A A 拟南芥A r a b i d o ps i s t h a l i a n a 光响应元件P a r t o f a l i g h t r e s po n s i v e e l e m e n t G -B o x C A C G T G 豌豆P i s u ms a t i v u m 光响应元件C i s -a c t i n g r e g u l a t o r y e l e m e n t i n v o l v e d i n l i g h t r e s po n s i v e n e s s I -b o x G A T A A G G G T 黄花菊F l a v e r i a t r i n e r v i a 光响应元件P a r t o f a l i g h t r e s po n s i v e e l e m e n t G A R E -m o t i fT C T G T T G 甘蓝B r a s s i c a o l e r a c e a 赤霉素响应元件G i b b e r e l l i n -r e s p o n s i v e e l e m e n t P -b o x C C T T T T G水稻O r y z a s a t i v a 赤霉素响应元件G i b b e r e l l i n -r e s po n s i v e e l e m e n t T C A T C A T C T T C A T豌豆P i s u ms a t i v u m 参与水杨酸反应的顺式作用元件C i s -a c t i n g e l e m e n t i n v o l v e d i n s a l i c y l i c a c i d r e s po n s i v e n e s s T A T A -b o x T A T A拟南芥A r a b i d o ps i s t h a l i a n a 在转录起始的-30附近的核心启动子元件C o r e p r o m o t e r e l e m e n t a r o u n d -30o f t r a n s c r i pt i o n s t a r t 2.2 M s C O L 2表达模式分析2.2.1 M s C O L 2组织特异性及花的不同发育时期的表达分析为了明确M s C O L 2基因在不同组织中的表达特性,利用q R T -P C R 分析了该基因在花㊁茎㊁叶以及花芽分化期㊁初花期㊁盛花期的表达水平,结果显示,M s C O L 2在花㊁茎㊁叶中均有表达,且在花中表达量最高,是茎中的3倍(图4A )㊂花不同发育时期表达分析结果表明,M s C O L 2在花芽分化期表达量最高,为初花期的1.6倍,为盛花期的2.7倍(图4B )㊂2.2.2 光周期和外源激素诱导下M s C O L 2的表达分析光周期是影响植物开花的重要因素之一㊂为了明确M s C O L 2对光周期诱导的表达模式,采用3周龄的紫花苜蓿分别进行了长日照(L D )和短日照0192Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第10期卢栋宇等:紫花苜蓿花期调控基因M s C O L2的克隆及功能研究(S D)处理㊂q R T-P C R结果分析显示,在L D条件下,M s C O L2表达量峰值出现在光照后8h和12h (图5A);而S D条件下,随着黑暗时间的增加, M s C O L2表达量逐步上升,且在24h达到一个高峰(图5B)㊂在长㊁短日照条件下,该基因在转录水平均呈现24小时一个周期性的变化,说明M s C O L2与C O L家族其他成员类似,能够响应光周期,暗示M s C O L2可能在光周期开花调控中发挥重要作用㊂图4M s C O L2在不同组织与花发育时期的表达分析F i g.4 E x p r e s s i o na n a l y s i s o f M s C O L2a t d i f f e r e n t t i s s u e s a n d f l o w e r d e v e l o p m e n t a l s t a g e s注:A为组织特异性表达;B为花发育的3个时期差异表达㊂B a r表示标准差 * 和 ** 分别代表t检验P<0.05和<0.01㊂下同N o t e:A:T i s s u e s p e c i f i c e x p r e s s i o n s;B:D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n s a t t h r e e f l o w e r d e v e l o p m e n t a l s t a g e s.E r r o r b a r s r e p r e s e n t t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h em e a n, * o r ** o nb e h a l f o f P v a l u e<0.05o r<0.01b y s t u d e n t t t e s t a n a l y s i s.T h e s a m e a s b e l o w 激素在植物的开花途径中起重要的调节作用㊂为了揭示施加外源激素对M s C O L2表达的影响,分析了50μm o l㊃L-1G A3和100μm o l㊃L-1S A诱导下的表达特性㊂研究结果表明,在G A3诱导下,M s C O L2表达量呈现先升高后降低再升高的变化趋势,24h时表达量达到最高水平,为对照的1.7倍(图5C);S A诱导12h时表达量达到最高水平,为对照的25倍(图5D)㊂上述研究结果表明,M s C O L2受激素G A3和S A诱导表达㊂图5光周期和外源激素诱导下M s C O L2的表达分析F i g.5 E x p r e s s i o na n a l y s i s o f M s C O L2u n d e r p h o t o p e r i o da n de x o g e n o u sh o r m o n e s t r e a t m e n t s注:A为长日照处理;B为短日照处理;C为G A3处理;D为S A处理㊂G A3为赤霉素;S A为水杨酸N o t e:A:L o n g d a y t r e a t m e n t;B:S h o r t d a y t r e a t m e n t;C:G A3t r e a t m e n t;D:S At r e a t m e n t.G A3s t a n d s f o rG i b b e r e l l i n3;S AS a l i c y l i c a c i d1192Copyright©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷2.3 过表达M s C O L 2紫花苜蓿鉴定及开花相关基因表达分析2.3.1 过表达M s C O L 2紫花苜蓿鉴定及表型分析以p C A M B I A 3301作为表达载体,通过无缝克隆构建过表达载体,用W -M s C O L 2-F 和G U S -R 引物对含有3301-35S -M s C O L 2质粒的大肠杆菌单菌落进行阳性鉴定,P C R 产物经1%凝胶电泳检测,出现单一条带,大小约为1200b p 左右,表明M s C O L 2基因成功导入苜蓿基因组(图6)㊂通过阳性鉴定共获得8株35S :M s C O L 2过表达株系,q R T -P C R 分析转基因紫花苜蓿与对照组M s C O L 2的表达水平,其中,O E #1的表达量为对照的5.8倍,O E #6的表达量为对照的4.7倍㊂选择上述2株转基因植株开展后续功能验证研究(图7)㊂开花表型初步观察发现,对照在刈割后37天开花,而过表达M s C O L 2紫花苜蓿植株在刈割后的45天开花,开花时间比对照延迟9天㊂2.3.2 过表达M s C O L 2紫花苜蓿中开花相关基因的表达分析为了分析过量表达M s C O L 2对开花调控途径中与开花相关基因表达水平的影响,利用qR T -P C R 检测了转基因株系中促进开花相关基因图6 过表达M s C O L 2紫花苜蓿的鉴定F i g .6 P o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f M s C O L 2-o v e r e x pr e s s i o n a l f a l fa 图7 转基因紫花苜蓿M s C O L 2表达分析F i g .7 E x p r e s s i o n a n a l y s i s o f M s C O L 2-o v e r e x pr e s s i o n a l f a l f a 注:WT 为野生型植株;O E #1-O E #8为过表达紫花苜蓿植株N o t e :WT :W i l d -t y p e p l a n t s ;O E#1-O E#8:O v e r e x p r e s s i n g al f a l f a pl a n t s M s PH Y A ,M s G I ,M s F K F 1,M s F T a 1,M s S O C 1,M s S P L 13,M s C O ,M s T G A 1,M s S A R D 1,M s S L Y 1和M s F L D 的表达水平,以及抑制开花相关基因M s S V P ,M s T O C 1,M s E L F 4和M s E F M 的表达水平㊂研究结果显示,促进开花的相关基因M s PH Y A ,M s S P L 13,M s F T a 1,M s C O ,M s T G A 1,M s S A R D 1,M s S L Y 1,M s F L D 和M s L F Y 的表达水平均下调,其中成花素基因M s F T a 1的表达显著下调,其表达量仅是对照的0.07%,M s S P L 13的表达量是对照的24.4%,M s PH Y A 的表达量是对照的33%㊂本研究结果显示抑制开花相关基因M s S V P ,M s T O C a 1,M s E L F 4和M s E F M 的表达水平均上调,其中O E#1中M s E L F 4表达量比对照提高了30.9倍㊂上述结果表明,过表达M s C O L 2可能抑制促进开花基因的表达,而促进抑制开花基因的表达(图8)㊂2192Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第10期卢栋宇等:紫花苜蓿花期调控基因M s C O L 2的克隆及功能研究图8 过表达M s C O L 2紫花苜蓿开花相关基因表达分析F i g .8 E x p r e s s i o na n a l y s i s o f f l o w e r i n g -r e l a t e d g e n e su n d e r o v e r e x pr e s s e d M s C O L 2a l f a l f a 注:A-L 为促进开花相关基因;M-P 为抑制开花相关基因N o t e :A-Ls t a n d s f o rF l o w e r i n gp r o m o t i n gg e n e s ;M-Ps t a n d s f o rF l o w e r i n h i b i t i n gge n e s 3 讨论3.1 M s C O L 2组织特异性及花的发育不同时期的表达分析开花是影响植物繁殖和提高作物产量的重要农艺性状之一[26]㊂为了明确M s C O L 2基因在不同组织中的表达特性,利用q R T -P C R 进行了组织特异性表达检测,结果显示,M s C O L 2在花中表达量最高,预测该基因可能参与苜蓿的花期调控㊂本研究对花芽分化期㊁初花期㊁盛花期3个不同花发育时期的M s C O L 2表达量分析表明,在花芽分化期相对表达量最高㊂已有研究表明花芽分化是积累营养物质以及激素调节物质㊁遗传物质等共同协调作用的过程,是花器官形成的基础,并控制开花时间[27]㊂推测该基因在成花初期表达水平高,可能在花蕾形成和花发育中可能发挥功能㊂3.2 光周期和外源激素诱导M s C O L 2的表达光周期是影响植物开花的重要因素之一㊂光响应元件能够感知光信号,不同光照能够调控基因表达㊂研究报道,在L D 条件下拟南芥中A t C O 的表达水平在黄昏时达到峰值,而S D 条件下在夜间达到峰值㊂春兰在L D 条件下C gC O L 的表达水平光照期间高于黑暗期间,在SD 条件下,在光照下C g-C O L 的表达水平低于黑暗[28-31]㊂水稻中O s C O L 16的表达水平先降低后增加,在黄昏后6h 或14h 达到峰值[32]㊂本研究M s C O L 2在长日照和短日照条件下,表现出不同的昼夜表达模式,暗示M s C O L 2可能在光周期开花调控中发挥重要作用㊂激素在植物的开花调控中发挥着重要的作用,G A 3,S A 均参与植物的开花调控[33-34]㊂赤霉素可以使S O C 1基因的表达水平上调,进而促进花分生组织基因L E A F Y 的表达上调,从而促进植物开花[35]㊂水杨酸可以诱导植物的花芽分化[36]㊂在苜蓿生殖生长的不同时期叶面喷施G A 3后,会直接影响花荚激素含量的变化,从而间接影响苜蓿产量构成因子与种子产量[37-38]㊂对紫花苜蓿分别施加50μm o l ㊃L -1G A 3和100μm o l ㊃L -1S A 两种激素,M s C O L 2表达量上调,说明M s C O L 2受到2种激素的诱导,但是施加2种激素对紫花苜蓿开花的影响,以及如何通过M s C O L 2调控开花还有待于进一步研究㊂3.3 M s C O L 2参与紫花苜蓿开花基因表达调控为了探究过表达M s C O L 2对紫花苜蓿开花花期调控途径中开花相关基因的影响㊂挑选已报道的与促进开花相关的基因M s PH Y A ,M s G I ,M s -F K F 1,M s S O C 1,M s S P L 13,M s C O ,M s L F Y ,M s -F T a 1,M s TG A 1,M s S A R D 1,M s S L Y 1,M s F L D 和抑制开花相关基因M s S V P ,M s T O C 1,M s E L F 4,M s E F M 进行定量表达分析;结果显示,与对照相比,过表达M s C O L 2材料中促进开花基因M s F T a 1和M s PH Y A 的表达水平显著下调㊂研究表明,成花素基因F T 是植物开花网络的中心调控因子,在3192Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷紫花苜蓿中沉默F T a1具有延迟开花的作用[39]; PH Y A作为光敏因子,主要感受远红光,参与到光周期开花调节途径中[40],这些促进开花基因在过表达紫花苜蓿中的表达量均有所下调,暗示M s C O L2在紫花苜蓿开花调控过程中发挥负调控作用㊂G I 是一种植物特有的核蛋白,具有调控开花时间㊁昼夜节律和光信号转导的作用,拟南芥g i突变体能够延迟开花[41];然而,长日照条件下过表达O s G I水稻出现开花延迟[42]㊂本研究中过表达M s C O L2植株中M s G I基因表达量上调,可能与水稻开花调控的机制相似㊂C O结合在S O C1的启动子上正调控其表达[43],拟南芥中过表达水稻O s S O C1导致转基因植株出现早花表型[44],而草莓中过表达F v S O C1却抑制开花[45]㊂本研究分析显示,过表达M s C O L2植株中S O C1表达量上调,表明C O L对S O C1的表达有促进作用㊂本研究分析结果显示,在过表达M s C O L2材料中,抑制开花基因M s T O C1和M s S-V P的表达量分别上调了4.5倍和1.5倍㊂T O C1通过光周期调节途径调控拟南芥对光照的响应, t o c1突变会导致拟南芥的昼夜节律缩短[46-47]㊂S V P 通过结合F T的启动子区域,抑制其转录表达从而调控开花,在拟南芥中过表达S V P具有延迟开花的作用[48-50]㊂以上抑制开花基因在过表达M s C O L2紫花苜蓿中表达均上调㊂综上,M s C O L2可能在紫花苜蓿开花途径中发挥上调抑制开花基因表达水平的作用,从而导致开花延迟㊂4结论M s C O L2受光周期和外源激素G A3和S A的诱导表达,暗示在光周期和激素开花调节途径中发挥作用㊂M s C O L2能够上调抑制开花基因的表达水平,下调促进开花基因表达水平㊂表型观察显示紫花苜蓿开花延迟,表明M s C O L2在延迟苜蓿开花的调控机制有重要的作用㊂参考文献[1]刘永平,杨静,杨明峰.植物开花调控途径[J].生物工程学报,2015,31(11):1553-1566[2]李宪利,袁志友,高东升.高等植物成花分子机理研究现状及展望[J].西北植物学报,2002(1):173-183[3] V O G E LKP,B 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紫花苜蓿抗逆基因MsDUF的克隆及其功能分析

紫花苜蓿抗逆基因MsDUF的克隆及其功能分析韩博;王卫栋;杨培志;张攀;呼天明【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2013(046)002【摘要】[目的]克隆紫花苜蓿(Medicago sativaL.)抗逆新基因MsDUF,并对其进行序列特征分析,了解该基因在逆境胁迫下的表达模式.[方法]利用RACE法获得紫花苜蓿MsDUF全长的cDNA序列,对该序列进行生物信息学分析;用基因枪法进行MsDUF的亚细胞定位分析;采用实时荧光定量PCR研究该基因在高含量NaC1和PEG-6000的胁迫下,以及ABA和GA3诱导下的表达模式.[结果]测序结果显示,该基因cDNA全长714 bp,包含一个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸,命名为MsDUF,GenBank登录号为JX183734.氨基酸BLASTP分析表明,MsDUF 氨基酸序列与拟南芥、大豆和蒺藜苜蓿等具有53％-98％的相似性,属于DUF4228 superfamily.实时荧光定量PCR研究表明,该基因在逆境胁迫下上调表达.[结论]从紫花苜蓿中克隆了抗逆相关基因MsDUF,发现其定位于细胞质中,实时荧光定量PCR结果分析表明该基因在紫花苜蓿的抗逆反应中起着重要作用.【总页数】9页(P424-432)【作者】韩博;王卫栋;杨培志;张攀;呼天明【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【相关文献】1.核桃JrGSTTau1基因的克隆及转入酵母的抗逆功能分析 [J], 粟莉圆;李大培;常远;卢烨彤;康桐铭;杨桂燕2.棉花抗逆基因GhAREB4的克隆及功能分析 [J], 张安红;王志安;肖娟丽;罗晓丽3.刚毛柽柳ThP5 CR基因的克隆及抗逆功能分析 [J], 唐绯绯;赵玉琳;王培龙;冯德明;宋怡;高彩球4.番杏TtASR基因的克隆及其抗逆功能分析 [J], 叶玉妍;罗鸣;陈红锋;张美;何金实;杨礼香5.油菜抗菌核病和抗逆相关基因的克隆和功能分析 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析

紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析陈敏;马琳;贾聪俊;刘希强;龚攀;王赞【摘要】赤霉素受体(GID)是赤霉素信号转导途径的重要成员,直接影响着赤霉素对植物体效应的发挥。

该研究利用同源克隆的方法,首次从紫花苜蓿中克隆得到1个赤霉素受体基因,命名为 MsGID 1b。

序列分析发现,MsGID 1b基因开放阅读框长度为1053 bp,编码350个氨基酸,推测其蛋白质分子量为39.839 kD,是一个无信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白。

序列比对结果表明,MsGID 1b 基因与蒺藜苜蓿MtGID 1b 基因的核苷酸序列相似性为98%,氨基酸序列相似性为99%,且具有HSL 家族典型的 HGG 和 GXSXG 保守结构域及 GA、DELLA 蛋白结合位点。

荧光定量 PCR 分析表明,MsGID 1b 基因在紫花苜蓿各组织中的表达丰度依次为：根>盛花>初花>茎>叶>荚果；经 GA3、ABA、NaCl、PEG 和黑暗诱导后该基因表达上调,尤其是在 GA3诱导下,MsGID 1b 基因的表达量一直维持在较高水平,表明MsGID 1b 基因可能参与紫花苜蓿的抗逆调控。

%Gibberellin receptor (GID)plays an important role in gibberellin signal transduction pathway, which directly affects plant growth and development.In this study,a gibberellin receptor gene,MsGID 1b , was first isolated from Medicago sativa by homologous cloning.Sequence analysis showed that MsGID1b contains 350 amino acid residues with 39.839 kD molecular weight,and has high nucleotide (98%)and a-mino acid (99%)similarity with its orthologous gene in Medicago truncatula .Physical and chemical prop-erties analysis defined that MsGID1b was a kind of hydrophilic protein without signal peptide and trans-membrane structures.MsGID1b contains the binding site of GA,DELLA and some conserved domain of hormone-sensitive lipasefamily (HSL)like HGG and GXSXG.Spatio and temporal expression profilein-vestigated by real-time PCR indicated that MsGID 1b expressed comprehensively with its highest expression level in root.MsGID 1b was sensitive to GA3 ,ABA,NaCl,PEG and dark treatments.It maintained a high transcript level under GA3 treatment,suggesting that MsGID 1b might participate in the response of abiotic stress of M.sativa .【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2016(036)011【总页数】8页(P2159-2166)【关键词】紫花苜蓿;GID1b;同源克隆;表达模式【作者】陈敏;马琳;贾聪俊;刘希强;龚攀;王赞【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q786赤霉素(GAs)是一类重要的植物激素，影响着植物生长发育的多个环节，包括种子萌发，茎杆伸长，叶片扩张，花粉成熟和开花诱导等，同时参与植物对外界环境的响应[1]。

紫花苜蓿中黄酮类化合物分离及特殊显色反应研究

紫花苜蓿中黄酮类化合物分离及特殊显色反应研究
赵静
【期刊名称】《当代化工研究》
【年(卷),期】2024()3
【摘要】本研究旨在分离紫花苜蓿中的黄酮类化合物,并进行特殊显色反应相关研究。

研究人员通过植物采集和样品制备,获得了紫花苜蓿的植物材料。

研究人员采用萃取方法和分离富集方法,成功地从植物材料中提取出黄酮类化合物。

其中,柱色谱技术和液液萃取是本研究中主要的分离富集手段。

通过黄铜色素的纯化步骤,获得了高纯度的黄酮类化合物。

在黄酮色素的紫外光谱分析中,实验过程中采用了先进的光谱技术,得到了详细的实验结果。

通过实验结果的分析,确定了所得黄酮类化合物的结构和纯度,为后续研究奠定了坚实的基础。

综合研究结果,本研究成功地实现了紫花苜蓿中黄酮类化合物的分离、富集和特殊显色反应的研究目标。

所获得的高纯度黄酮类化合物为进一步的生物活性研究提供了有力的实验基础,为紫花苜蓿及相关植物资源的开发利用提供了重要的科学依据。

【总页数】3页(P36-38)
【作者】赵静
【作者单位】甘肃工业职业技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
【相关文献】
1.超声波提取紫花苜蓿中黄酮类化合物的工艺研究
2.黄芪中黄酮类化合物的超临界流体色谱分离方法研究
3.植物中黄酮类化合物提取分离和结构测定方法研究
4.紫花苜蓿中黄酮类化合物抗肝癌的网络药理学研究
5.《天然药物化学实验指导》中黄酮类化合物显色反应的考证
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