南昌大学遗传学课件 第1讲 DNA的复制机理与PCR技术1

Contents

What is iPSORT and how does it work? Predict localization sites of protein sequences Run amino acid index analysis Reference
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滚环复制模型 (1968, Gilbert
2.3.2 D环复制模型
线粒体，叶绿体DNA
哺乳动物线粒体D环复制模型（lewin,2000)
2.3.3 θ环复制模型
大肠杆菌，枯草杆菌等原核生物
(a)
(b)
(a) Θ形复制模式图 (b)3H标记质粒DNA合成图

2.3.4泡状或Y形结构
线状染色体DNA复制起始后产生的一种结构。
θ环复制模型
将不连续的DNA片段以磷酸二酯键连接起来
3.DNA的复制
DNA复制的起始
DNA复制的延伸
DNA复制的终止
3. DNA的复制

3.1 DNA复制的起始
DNA的原点被一个复杂的蛋白质识别，在 DNA合成之前，母链必须解开，并（短暂 的）保持单链状态。然后子链的合成在复 制叉起始。在大肠杆菌中，一个DNA链的 起始是通过一个称为引发体的蛋白复合体 完成的。

2.3 复制的方式

滚环复制模型 D环复制模型 θ环复制模型 泡状或Y形结构



2.3.1 滚环复制模型（1968，Gilbert)
哪些 DNA进行滚环复制？
* 真核rDNA的扩增
*
大肠杆菌F因子DNA的转移
* Λ噬菌体裂解途经的复制
* φX174, M13. G4等 单链环DNA
噬菌体第二阶段复制都是 进行 滚环复制的.
+
+ 2400 1500 100 修复
+
+ 15 000~60 000 ≥500 000 10~20 复制
聚合速度（核苷酸/分） 持续合成能力 分子数/细胞 功能
DNA聚合酶延伸多核苷酸链总是5’——3’
聚合酶催化的链延长反应
(2) 真核生物的DNA聚合酶： δ
9. DNA连接酶（ligase）
Watson and Crick， 1953 人类科学 发展历史上的 伟大里程碑。
本节主要内容


DNA复制的半保留性 DNA复制的原点、方向和方式 DNA的复制过程
1. DNA的半保留复制
1.1 DNA复制的三种（假说）类型：
半保留复制 全保留复制 弥散复制
半保留复制
全保留复制
弥散复制
6. 单链结合蛋白（SSB，single stranded binding protein）稳定已经解开成两股的DNA单链，防 止其退火复性。
7. 拓扑异构酶（DNA topoisomerase）
拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保 持物体不变的性质。 DNA 分子中存在打结，缠绕、连环的现象。
The autonomously replicating sequence (ARS) of budding yeast
2. 复制的起点、方向与方式
2.1.1 复制原点： 复制是从DNA 分子上特定位置开 始的，这一特定的位置称之为复制原点。 a. 原核生物：通常只有一个复制原点 (E.coli :oriC)；
35S promoter
Transit peptide Sequence （RF1A，RF1B )
GFP sequence
NOS
转基因载体的构建
绿光和红光能够重合，发出黄光， 证明RF1A和RF1B确实是线粒体导肽序列
(Wang, Z., Zou, Y., 2006, Plant Cell. 18, 676-87.)
2. 复制的起点、方向与方式
2.1.1 复制原点： 复制是从DNA 分子上特定位置开 始的，这一特定的位置称之为复制原点。 a. 原核生物：通常只有一个复制原点 (E.coli :oriC)；
b. 真核生物：通常具有多个复制原点； (Yeast: ARS) 复制子：基因组中能独立进行复制的单位，一 个复 制子中只有一个复制起点。
聚合酶II 活性弱
DNA聚合酶Ⅰ (1) 原核生物的聚合酶 不同种类亚基数目 相对分子质量 5´→3´核酸聚合酶活 性 3´→5´核酸外切酶活 性 5´→3´核酸外切酶活 性 1 103 000
DNA聚合酶Ⅱ ≥7 88 000
DNA聚合酶Ⅲ ≥10 900 000
+
+ + 1 000~1200 3~200 400 切除引物，修复
Gyrase 旋转酶，解除正超螺旋，引入负超 起催化作用 螺旋 SSB 稳定单链 －
3.DNA的复制
DNA复制的起始
DNA复制的延伸
DNA复制的终止
3. DNA的复制
3.2 DNA复制的延伸
这个过程由DNA聚合酶III催化，它是主要的复制酶。 前导链（leading chain）：为连续合成，合成方向 与解链方向一致。 后随链（lagging chain ）：不连续合成，在RNA引 物基础上分段合成DNA小片段（冈崎片段），方向与 解链方向相反。 由此可见，整个DNA分子的复制是半不连续的。
1. DNA的半保留复制
1.2 DNA半保留复制的证 据：
1958年，Meselson和Stahl, 用重氮15N标记DNA，在复 制后不同的时间经CsCl梯度 密度离心实验验证了DNA的 半保留复制。
利用蔗糖密度梯 度离心分离植物 叶片中的线粒体
DNA半保留复制
1.2 DNA半保留复制的证据
2.1.2.1 生物信息学分析
利用复制起始结构的特点，开发生物 信息学分析软件，寻找和分析DNA序列 中的复制起始位点，并设计相关实验 验证.
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I 型酶： 切开双链中的一股，使DNA不致打结，切口 的3’端可通过自由转动一周再与5’端磷酸连接， 不需ATP。
I 型酶：切断处于超螺旋状态中双股链中的某个部位， 通过切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢复复制所 要求的负超螺旋状态。
8. DNA聚合酶（DNApolymerase）
聚合酶III 主要的复制酶，并有校读、纠错的功 能 聚合酶 I 用于切除引物RNA,并填补留下的缺口
2.2 DNA复制的方向：

DNA是从一个起始位点开始复制的，一旦复制开始， 就一定会完成，达到复制子的终点。 从起始位点开始后，DNA有两种复制方式：单方向 的（Unidirectional Replication）；或双方向的 （bidirectional replication.）两个复制叉复制的速度 也可能不尽相同，可以同时复制，也可以先复制一条 链，到一定程度后在复制另一条链。大多数采用双向 等速复制。
Taylar 实验，验证了 真核生物的半保留复 制
课后思考题
半保留的复制机制具有什么生 物学意义？
2. 复制的起点、方向与方式
2.1.1 复制原点： 复制是从DNA 分子上特定位置开 始的，这一特定的位置称之为复制原点。 a. 原核生物：通常只有一个复制原点 (E.coli :oriC)； b. 真核生物：通常具有多个复制原点；
线粒体导肽的验证
A command line version of iPSORT is available here. The program has been rewritten in the OCaml language, and is different from the one used for this web predictor (but should give the same predictions).
现代人的“多地区起源”和“非洲起源”？
XY XY XY XY XY
XX XX XX XY XX XY XY XX
XX
亚当标记追踪
对一万两千个中国男性的Y染色体进行检测，发现了一致的突变位点M168G， 这个突变位点在7.9万年前产生于非洲，是部分非洲人特有的遗传标记，这 些祖先约在六万年前从非洲到达东南亚一带，然后向北迁移至中国。
b. 真核生物：通常具有多个复制原点； (Yeast: ARS) 复制子：基因组中能独立进行复制的单位，一 个复 制子中只有一个复制起点。
2.1.2 DNA复制起始区段的结构特点 是：
（1）有多个独特的短重复序列，但各种生物中该序 列不尽相同 （2）该重复序列与多种启动复制蛋白结合，DNA 聚合酶和其他复制蛋白在复制起点正确的装配就可 以启动DNA的复制 （3）复制起始位点序列富含A－T碱基序列，有利 于双链解开起始复制
Plant Protein
Non-plant Protein
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The underlined sequences correspond to mitochondrial transit signals predicted with predicted with probabilities of 0.95 and 0.97,respectively.
3. DNA复制的过程
3.1 与复制有关的酶和因子
1. 2. 3. 原料： dNTP， 双链DNA模板