第五章：免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学技术(immunohistochemistry)
免疫组织化学技术（immunohistochemistry）由于免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高及能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起的显著特点，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景。
此方法经不断改进和发展已日趋成熟，应用范围逐渐扩大。
目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。
一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围（一） 免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
免疫组织化学技术的原理及方法
❖单克隆抗体：针对某一抗原决定簇， 由单株淋巴细胞（克隆）所产生的 抗体
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
❖ 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定 簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断 中，有利划归 肿瘤的基本类型。
酶标亲和素
在AB复合物中，酶是标记 在生物素上，而后与亲和素 合成复合物。在标记的亲和 素-生物素方法中是将辣根 过氧化酶直接标记在亲和素 上，辣根过氧化酶与亲和素 间有极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏感
多聚物载体
1、 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
2、 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能 与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 →HRP·H2O2 →有色分子终末产
物+ HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点 在于显色系统的差异： ❖ 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 ❖ PAP法： 利用PAP复合物 ❖ ABC法： 利用AB复合物 ❖ LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 ❖ EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
标记抗体
1、在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体 的结合能用肉眼观察到
2、标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，碱性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
3、标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性， 从而使染色敏感性降低
免疫组化技术的原理、分类和优点
点击次数：3565 发表于：2008-06-15 11:58转载请注明来自丁香园来源：互联网一、免疫组化技术的基本原理应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
二、免疫组织化学染色方法1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
2、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常用的方法。
三、几种常用免疫组织化学方法的原理1、免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
免疫组织化学技术
（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂（ 1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔 包好，室温或4℃保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml
待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞 ，固定2－4小时。
在细胞上加一层甘油放-20℃保存。
荧光标记免疫组织化学
直接法
间接法
注意事项
一、抗体的保存
浓缩抗体：有效期内，只需放在 4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。
即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内 可保存半年左右。
PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶
的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
组织材料的固定
目的:
（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。
（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与自然状态时相仿。防止组织细 胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态
光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项.
免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组织化学技术
临床免疫学检验技术定的一项免疫检测方法。
目录CONTENTS第一节第二节第三节第四节酶免疫组织化学技术第五节第六节影响免疫组织化学技术的主要因素免疫组织化学技术的临床应用免疫标记电镜技术亲和组织化学技术荧光免疫组织化学技术免疫组织化学过程1抗原的提取与纯化2制备特异性抗体3标记物与抗体结合形成标记抗体4标本的处理与制备基本过程5抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应6观察结果免疫组织化学技术分类酶免疫组织化学技术免疫标记电镜组织化学技术标记物不同荧光免疫组织化学技术亲和组织化学技术免疫金（银）组织化学技术酶免疫组织化学技术0104定义：在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。
标本类型：组织切片、组织印片和细胞涂片等。
分类酶桥法过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP ）法双桥PAP 法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP ）法非标记抗体酶免疫组化技术酶标记抗体免疫组化技术直接法间接法直接法间接法优点操作简便特异性强检测敏感性高制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体缺点敏感性低制备的抗体种类有限特异性不如直接法操作较为繁琐非标记抗体酶免疫组织化学染色酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色（图12-1）。
过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法：是在酶桥法基础上加以改良。
PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物，图12-2）。
该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。
通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同（图12-3）。
免疫组织化学技术
复
染
根据所用的底物溶液而选择复染液
DAB 有色终末产物不溶于酒精和有机溶剂， 可用醇性染料复染、脱水，有机溶剂透明和封 固。复染过程：a、漂洗切片以除去未反应的 底物；b、Harris苏木素复染；c、流水洗涤； d、1%盐酸酒精分化；e、流水冲洗，温水蓝 化；f、梯度酒精脱水；g、二甲苯透明；h、 中性树胶封固。
显色物标记的抗体检测组织或细胞内的抗 原，用于疾病的诊断或研究。
新鲜组织的冻存 新鲜组织离体后应及时冻存，如需送至其他 实验室冻存可先置于4℃生理盐水中，但时 间不宜超2～6过小时。制备冻块的原则是 低温及速冻。速冻的目的是使抗原迅速固定 和防止冰晶形成，冰晶形成将破坏细胞结构。 低温速冻的方法有：丙酮–干冰法、液氮法。
10%中性缓冲福尔马林液
40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的 PBS90ml
影响固定的因素
固定时间 固定时间过短将影响抗原的固定 和细胞形态，过长能引起抗原遮盖或抗原 变性，因而要选择一合适的固定时间。
固定温度 一般固定剂的固定作用随温度升 高而加强，固定的温度以室温最为常用。
冰冻切片 石蜡切片
免疫组织化学染色
内源性酶和内源性生物素的阻断 内源性过氧化物酶主要见于红细胞的血红 蛋白，中性粒细胞内的髓过氧化物酶及单 核细胞，嗜酸性细胞和组织内的过氧化物 酶。 阻断剂：3% H2O2–甲醇液，10～15分 钟
内源性碱性磷酸酶
内源性碱性磷酸酶主要见于中性粒细胞和内
热诱导的抗原修复应注意的问题：
热处理后应注意自然冷却。 热处理液不要让其煮干。 不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破 坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡 染等现象。而经酶水解的切片，其细胞浆破坏要视消化 时间而异，但核的破坏较轻。
免疫组织化学技术讲义
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
免疫组织化学(免疫组化)技术
免疫组织化学（免疫组化）技术利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry IHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）。
其特点是将形态学改变与功能，代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量分析。
第一节免疫组化的发展史及应用自1941年Coons及其同事首创免疫组织化学技术以来，拌随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日新月异的变化。
如下表由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态与功能研究有机的结合在一起，所以，这门技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，推动了学科的发展，取得了令人瞩目的成就。
免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。
免疫组化可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定，淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。
在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。
以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。
近年来，拌随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。
越来越多的癌基因与抗癌基因的发现不仅有助于对肿瘤发生机制的探讨，而且使肿瘤的预防，早期诊断，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。
组织化学技术5免疫组化
Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 ①保证离子浓度和PH值。 ②减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
Ab滴片图示：
方法：洗三次，每次5分钟。 Ab孵育技术 必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
02
应用：特别适用于含抗原量较少的组织。
03
包埋后染色：
04
组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制
05
成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由
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于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，
07
故又称载网染色（on grid staining ）。
优点： ① Ultrastructure 保存良好。 超薄切片易穿透，可标记细胞任何 部位。 方法简便，（+）结果高度可重复性。 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 树脂中的组织不易进行免疫反应。
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液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时
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新配）
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自来水洗净。
5
用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞
6
核（可不染）。
7
常规脱水、透明、封固、镜检。
8
结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
9
（四）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 ① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。
免疫组织化学技术
两种不同抗原具有相同或相似的抗原决定簇， 互称共同抗原。
*交叉反应：由共同抗原决定簇刺激机体产生 的抗体可以和两种共同抗原结合发生反应。
抗原的类型繁多，分类方法也很多， 故抗原的名称各种各样。
根据溶解性抗原有可溶和不溶性两类。
按性能分
抗原的种类
按亲缘关系分
概述
❖基本原理：
❖
抗原抗体反应
标记化学反应
呈色化学反应
❖ 与IHCT相关的免疫学基础： ❖ 抗原：能刺激机体引起抗体的产生，并与相应抗
体发生特异性结合的物质—抗体原。
❖ 抗体：针对某种抗原而产生的，并能识别相应抗
原，与其发生特异性结合
第一节 抗原
1. 概念 凡能刺激机体免疫系统产生
特异性免疫应答；并能与相应的在体内 或体外发生特异性结合的物质称为抗原 （ Antigen，Ag ）。
有关概念
❖ 免疫球蛋白:是浆细胞产生的球蛋白。 １、抗体（antibodies, Ab）：是机体免疫
细胞受抗原物质刺激后产生的，能与相应 抗原特异性结合，并具有多种免疫学、生 物学活性的球蛋白。
2 、 免 疫 球 蛋 白 （ immunoglobulins,Ig ） ： 指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的 球蛋白。
γ、 μ、 α、 δ、 ξ 决定的。 重链不同，Ig的类型就不同。
抗体的特性
①Ig都是大分子蛋白质，既具有免疫 原性，又具有能与相应抗原结合的抗体活 性。
② 免疫原性的类属特异性是由Ig分子 的重链和轻链恒定区特定的氨基酸序列所 决定。
抗体特异性结合抗原的活性位点存在于 Ig的可变区。
③Ig由B淋巴细胞衍生的浆细胞生成，主要 以可溶性蛋白的形式存在于体液中。
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酶反应产物的分辨力 不及颗粒标记物
适合电镜观察
****
应用最广的标记物
第六节：激光扫描共聚焦显微镜技术
共轭光路使非焦平面的光 线被抑制，减少了干扰， 以及使用光色较纯的激光， 所以成像分辨率更高增加 了激光扫描部分，可连续、 固定范围内小功率扫描， 记录动态变化光学结构为 共轭聚焦结构，此结构可 使样品中间固定层面被激 光扫描，通过调节参数可 实现样品的多层扫描，俗 称“细胞CT”
胶体金与标记物预试验：
固定胶体金用量，加不同稀释度的蛋白。 蛋白量少—不能稳定胶体金，呈现由红至兰的聚沉效 应。 蛋白超过最低量时，则保持红色不变。
以红色不变而蛋白含量最低的试管蛋白含量 为稳定1ml胶体金所需的蛋白量，在此基础上 再加10-20％，即为实际量。
胶体金与标记物结合 按最适量搅拌，胶体金加入蛋白中去，10分钟后加入 稳定剂，防止胶体金与蛋白聚合沉淀。 根据胶体金颗粒大小和蛋白种类，设定离心条件，取 沉淀物溶解就是粗提的金标物。
胶体金制备
胶体金颗粒大小区间及适用范围： 小于5nm：标记抗原或组化法检测。 5-20nm：适用于液相免疫技术。 大于20nm：用于免疫沉淀技术。 小颗粒胶体金能吸附更多的银离子。
免疫胶体金标记物的制备
一.影响标记效果的因素： 1.胶体金对蛋白吸附取决于pH，应该调节胶体金至蛋白 PI偏碱最易标记，低于PI发生凝聚不能结合。 2.待标记的电解质影响标记效果。 3.金颗粒、蛋白分子量亦有影响。 4.胶体金与待标记物用量的比例非常重要。 5.为使标记物稳定，应该加入BSA稳定剂。
胶体金标记物的纯化与鉴定 纯化方法：1.超速离心 2.凝胶过滤 质量鉴定：
1.有支持膜的镍网蘸取金标蛋白，电镜测量直径。 2.免疫组化滤纸模型鉴定特异性和敏感性。
免疫金（银）组化染色技术
金标记物上的胶体金在银显色剂作用下起液化作用， 使显影剂里的银离子还原成银原子沉淀，在抗原-抗体 复合物的金颗粒周围形成黑色“银壳”，银显影剂是起 到放大作用。
间接法（二步法）
原理：在直接法的基础上使用酶标二抗。
这里就是区别， 间接法加入了酶 标的二抗。
非标记抗体免疫酶组化染色法
原理： 由于酶与抗体的共价性连接而导致酶的生物活 性降低。若与非特异性抗体结合会出现干扰染色。 用酶免疫动物，产生抗酶抗体，再将酶与抗酶抗 体形成复合物，通过酶的底物显色而检测抗原。
第一节：免疫组织化学技术要点
免疫组织化学技术的一般步骤： ① 抗原的提取与纯化 ② 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体和纯化 ③ 标记物与抗体结合形成标记抗体 ④ 标本的处理 ⑤ 抗原抗体反应和呈色反应 ⑥ 显微镜下观察
一、标本的处理
标本的主要来源： 活体组织 各种体液 培养细胞
人血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞
分层扫描、
光学切片
较厚层面 (平滑肌损伤可见) 较薄层面
兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞
植物切片三维重建
三维重建 -生物结 构分析
免疫荧光 定量、定 位测量
随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值
胞浆
细胞内离子测定
胞核
细胞胞浆胞核同时动态测量Ca离子
过氧化物酶-抗过氧化物酶法
酶标记抗体免疫组化染色法直接（一步）法
原理： 用酶标抗体与处理过的组织标本中相应抗原反应， 继而用底物“二氨基联苯胺”和H2O2进行显色，颜 色物沉积到抗原抗体反应部位，从而可以定位、定 性和定量。
操作步骤
水洗后室温加0.3％ H2O2和80％甲醇20-30Min 用正常血清或BSA封闭非特异性。 加入酶标抗体。 加入底物显色。
免疫标记电镜技术
原理：将抗原抗体反应的特异性与电镜的高分辩率结 合一起，可在亚细胞结构或超微结构上对抗原进行定 位的技术。 示踪物：铁蛋白；胶体金；酶
技术的关键问题 1.对细胞超微结构的完好保存。 2.保证细胞或亚细胞器抗原不变。 3.选择的免疫制剂能透过组织细胞达到抗原位置。
非包埋法免疫染色：抗原性保持最好，超薄冷冻切片， 仪器昂贵，不利于普及。 包埋前免疫染色：能对大块组织染色，免疫酶技术，不 利于亚细胞器进行标记，不能多重标记。 包埋后免疫染色：是在切片以后进行染色，不用考虑组 织细胞渗透问题。
酶桥染色法
原理： 利用酶、抗酶抗体和底物形成显色系统，抗原和特异 性抗体形成免疫反应系统，用二抗将抗酶抗体结合在 与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗 体上，经显色呈现染色结果。
酶桥染色法
特点： 1.任何抗体均未与酶标记。 2.酶是应用免疫原理与抗体标记的。 3.二抗与一抗和三抗均可免疫反应。 4.二抗过量，保证有足够的抗原位点。 5.提高敏感度，又节省一抗用量。
授课老师： 郑 军
荧光免疫组织化学技术
概念： 采用荧光素标记已知抗原或抗体做为探针，检测组织与细 胞标本中的靶细胞。。
第一节：技术要点
直接荧光免疫组化： ① 方法操作方便，省时。 ② 敏感性不及间接法。 ③ 一种抗体只能检测一种抗原。 ④ 主要用于病原体检测。
间接荧光免疫组化技术： ① 一个抗原可结合3-5个。 ② 中间抗体又可以结合3-5个。 ③ 可放大2-4倍。 ④ 敏感性增强。 ⑤ 用于自身抗体及淋巴细胞表面标志。
三、免疫染色
标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物。 用缓冲液洗去未结合的成分。 在显微镜下观察（直接法）。 或待标本显色后观察（酶法）。 处理方法： 1.酶消化法：显露抗原和增加通透性。 2.非特异性吸附：可使用牛Alb封闭。
四、设立对照试验
1. 2. ① ② ③ ④ 阳性对照 阴性对照 替代对照：用无免疫原性物质替代。 空白对照：排除自发荧光和内源性酶。 吸收对照：已知抗原与抗体在4度下结合。 抑制试验：
细胞膜流动性测定
样品基本要求与荧光探针的选择
由于LSCM检测活细胞，故应该贴壁生长 悬浮培养细胞要做贴壁化处理。
荧光探针的选择：
LSCM的功能与应用
显微CT功能 观察立体形态，三维重建 分析亚细胞结构 细胞膜功能测定
第七节：免疫组化技术的应用
荧光免疫组化技术 病原体感染的早期诊断 自身抗体检测 淋巴细胞表面标志物 抗原抗体的免疫组化定位
酶免疫组化技术 组织切片检测 抗原定位检测 ？几种常用方法的比较
一步法：肾活检中的Ig和补体成分 二步法：广泛应用于组织细胞中的抗原成分 PAP法：特异性，敏感性好，石蜡包埋的免疫组化。 碱磷酶-抗碱磷酶法：T细胞表面CD分子检测 生物素法：敏感性更优于PAP法
其他
免疫标记电镜 激光扫描共聚焦显微镜技术：
标本的固定与保存
目的： 固定剂的选择： 1.能快速固定抗原。 2.防止抗原物质扩散。 3.固定后的抗原能被抗体识别。 切片方法的选择： 1.冰冻切片。 2.石蜡切片
二、抗体的处理与保存
抗体是免疫组化染色的首选试剂。 选用高特异性、高效价的“多克隆”抗体 抗体稀释的原则： 1.阳性物质着色应该明显，背景浅。 2.抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感，抗 体稀释倍数越多。
可得到细胞形态学资料 多种细胞动力学参数 对细胞断层扫描 亚细胞结构
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X X 焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
较厚层面
较薄层面
五、免疫组化结果判断
注意的问题： ① 准确判断阳性和阴性。 ② 区分假阴性和假阳性。 ③ 区分特异性和非特异性染色。 阳性染色：胞质型、细胞核型及细胞膜型
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ LOGO
酶免疫组织化学技术
enzyme Immunohischemistry technique, EIHCT
• 酶标记抗体免疫组化染色 直接法（一步法） 非标记抗体免疫酶组化染色 间接法（二步法） 酶桥染色法
LOGO
免疫组织化学技术 Immunohischemistry technique, IHCT
授课老师： 郑 军
免疫组织化学技术
概念： 组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈 色反应，借助可见的标记物，对相应抗原或抗体进行 定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。可以检 测到细胞或亚细胞水平。
双标记荧光免疫法： 两种不同的荧光素标记两种抗原来检测同一组织或 细胞上的不同抗原。
胶体金（银）组化技术
胶体金是由四氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸 橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒， 并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体 金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白分子的 正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结 合，所以不影响蛋白质的生物特性。还可结合如SPA、 PHA、ConA等。
常用免疫标记电镜技术
铁蛋白标记免疫 标记成分 透膜难易度 铁蛋白 难
酶标记免疫技术 HRP 易
胶体金标记免疫 胶体金 较易
用途
优点
病毒和细胞表面抗原 定位
显像清晰，容易辨认
细胞内抗原定位
特异性强，敏感性好
细胞表面抗原及细胞 亚细胞结构
可以双标记和多重标 记
缺点
应用前景
分子量太大，透膜困 难
适用范围小，有被取 代趋势。
？
被检测物是抗原还是抗体？
过氧化物酶-抗过氧化物酶法PAP法是酶桥法的改进
酶标记亲和素生物素技术
亲和素-生物素-过 氧化物酶技术 （ABC) 可用于植物血凝素、 糖类、生物素亲和 素、SPA与IgG、激 素与受体