一锅法制备C18硅胶杂化毛细管整体柱及其应用

２０１１年９月Ｖｏｌ．２９　Ｎｏ．９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１１　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ８３０～８３６谨以此文庆贺张玉奎院士七十华诞ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１１．００８３０＊通讯联系人：邹汉法，博士，研究员，博士生导师，主要从事生物分离分析新材料与新技术等相关研究工作．Ｔｅｌ：（０４１１）８４３７９６１０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈａｎｆａｚｏｕ＠ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ．欧俊杰，博士，副研究员，主要从事整体材料的制备及应用研究工作．Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｕｎｊｉｅｏｕ＠ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ．基金项目：国家自然科学基金项目（２０７３５００４，２０９７５１０１）和国家自然科学基金创新研究群体项目（２１０２１００４）．收稿日期：２０１１－０８－０３“一锅法”制备Ｃ１８－硅胶杂化毛细管整体柱及其应用张振宾１，２，　欧俊杰１＊，　董　靖１，　王方军１，　吴明火１，　林　辉１，２，　邹汉法１＊（１．中国科学院分离分析化学重点实验室，中国科学院大连化学物理研究所，国家色谱研究分析中心，辽宁大连１１６０２３；２．中国科学院研究生院，北京１０００３９）摘要：发展了一种“一锅法”制备有机－无机杂化毛细管整体柱的方法。

首先将四甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷在弱酸条件下水解，然后加入有机单体（甲基丙烯酸－Ｎ，Ｎ－二甲基十八烷基溴化铵乙酯）及自由基聚合引发剂，同步原位完成硅羟基间的缩聚反应及双键间的自由基聚合反应，从而制成Ｃ１８－硅胶杂化整体柱；同时用毛细管电色谱（ＣＥＣ）和毛细管液相色谱（ＣＬＣ）对其柱效和分离能力进行了初步评价，并将其应用到微柱液相色谱－串联质谱对牛血清白蛋白酶解液的分离分析。

结果表明，该Ｃ１８－硅胶杂化整体柱具有较高的柱效和较好的重现性，在分离分析复杂生物样品方面具有较大的应用前景。

此外，本文所发展的方法在制备杂化整体柱的过程中不借助相应的硅烷试剂，为杂化整体柱的制备提供了一种新的思路。

关键词：整体材料；有机－无机杂化；一锅法；毛细管电色谱；毛细管液相色谱；蛋白质组分析中图分类号：Ｏ６５８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８７１３（２０１１）０９－０８３０－０７Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ１８－ｓｉｌｉｃａ　ｈｙｂｒｉｄ　ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ　ｃａｐｉｌｌａｒｙｃｏｌｕｍｎ　ｂｙ“ｏｎｅ－ｐｏｔ”ｐｒｏｃｅｓｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＺＨＡＮＧ　Ｚｈｅｎｂｉｎ１，２，ＯＵ　Ｊｕｎｊｉｅ１＊，ＤＯＮＧ　Ｊｉｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｆａｎｇｊｕｎ１，ＷＵ　Ｍｉｎｇｈｕｏ１，ＬＩＮ　Ｈｕｉ　１，２，ＺＯＵ　Ｈａｎｆａ１＊（１．ＣＡＳ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄａｌｉａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｒ．＆Ａ．Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｌｉａｎ１１６０２３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００３９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：：Ａ“ｏｎｅ－ｐｏｔ”ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ－ｓｉｌｉｃａ　ｈｙｂｒｉｄ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃｃｏｌｕｍｎ　ｂｙ　ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＴＭＯＳ），ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＶＴＭＳ）ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｇａｎｉｃ　ｍｏｎｏｍｅｒ，Ｎ－（２－（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＤＯ－ＡＢ），ｉｓ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｏｌｙｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｋｏｘｙｓｉｌａｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＤＯＡＢ　ａｎｄＶＴＭＳ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｆｉｎｅｓ　ｏｆ　ａ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｅｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ１８－ｓｉｌｉｃａ　ｈｙｂｒｉｄ　ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ　ｃｏｌｕｍｎ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｃａｐｉｌ－ｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　Ｃ１８－ｓｉｌｉｃａ　ｈｙｂｒｉｄｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ　ｃｏｌｕｍｎ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｒｙｐｔｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｓ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕ－ｍｉｎ　ｂｙ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＣＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）ｆｏｒ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａ－ｔｉｎｇ　ｉｔｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｉｓ　ｉｎ　ｓｉｔｕｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎｔｏｓｉｌｉｃａ　ｍｏｎｏｌｉｔｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｎｅｗ　ｗａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｒｇａｎｉｃ－ｓｉｌｉｃａ　ｈｙｂｒｉｄ　ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ　ｃｏｌ－ｕｍｎ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｏｎｏｌｉｔｈ；ｏｒｇａｎｉｃ－ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｈｙｂｒｉｄ；ｏｎｅ－ｐｏｔ；ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＣＥＣ）；ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＣＬＣ）；ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　第９期张振宾，等：“一锅法”制备Ｃ１８－硅胶杂化毛细管整体柱及其应用 毛细管整体柱采用原位聚合的方式在毛细管内形成均一、多孔结构的整体式固定相。

它不仅避免了填充毛细管柱制备过程中柱塞烧制和颗粒装填等繁琐步骤，还具有比填充柱更好的通透性，可实现快速分离［１，２］。

由于固定相的孔结构和表面化学性质容易控制，毛细管整体柱成为微柱分离技术发展的重要方向之一。

按照制备单体的不同，毛细管整体柱可以分为三类：有机聚合物整体柱［３，４］、硅胶整体柱［５－７］和杂化整体柱［８，９］。

不同类型的整体柱具有各自的优缺点。

由于杂化整体柱在一定程度上结合了有机整体柱和硅胶整体柱的优点（如制备简单、ｐＨ稳定性好、机械强度高等），自从Ｍａｌｉｋ等［１０］首次通过溶胶－凝胶法制备杂化整体柱后，杂化整体柱的制备及应用日益引起了人们的重视。

杂化整体柱的制备方法主要有一步法和两步法：一步法是在合适的酸碱条件下，硅烷试剂的水解和缩聚同时进行，最后形成多孔结构；而两步法则先让硅烷试剂在酸性条件下完全水解，然后加入碱性催化剂，使其发生缩聚反应并形成多孔结构。

到目前为止，已经制备得到辛基［１１］、苯基［９，１２］、氨丙基［１３］、烯丙基［１４］、巯基［１５］等多种类型的杂化整体柱。

然而，可用于制备杂化整体柱的硅烷试剂有限而且很多具有特定官能团的硅烷试剂制备困难或价格昂贵。

最近我们课题组发展了一种“一锅法”制备杂化整体柱的方法［１６，１７］。

首先将四甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷水解后，加入带有双键的有机单体及自由基聚合反应引发剂，在适当的条件下同步原位完成硅羟基之间的缩聚反应及双键之间的自由基聚合反应从而制成杂化整体柱。

该方法的优点是在制备杂化整体柱的过程中不依赖相应的硅烷试剂，为制备各种类型的杂化整体柱提供了新的思路。

本文以甲基丙烯酸－Ｎ，Ｎ－二甲基十八烷基溴化铵乙酯（ＭＤＯＡＢ）为有机单体，经过系统的优化制备条件，采用“一锅法”成功制备了Ｃ１８－硅胶杂化整体柱，用毛细管电色谱（ＣＥＣ）和毛细管液相色谱（ＣＬＣ）对其柱效和分离能力进行了初步评价，并将其应用到毛细管液相色谱－串联质谱（ＣＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）中对牛血清白蛋白酶解液进行了分离分析。

１　实验部分１．１　仪器和试剂 电色谱仪Ａｇｉｌｅｎｔ　ＣＥ　ｓｙｓｔｅｍ购自安捷伦公司（Ｈｅｗｌｅｔｔ－Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＣＬＣ系统为实验室自行搭建，包括高效液相色谱（ＨＰＬＣ）泵（Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００，Ｈｅｗｌｅｔｔ－Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒ－ｍａｎｙ）、进样阀（Ｍｏｄｅｌ　７１２５，Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）和Ｋｎａｕｅｒ紫外检测器（Ｋ－２５０１，Ｋｎａｕｅｒ），数据采集器（ＣＴ－２１）及色谱工作站均为北京彩陆科学仪器有限公司产品；ＬＴＱ线性离子阱质谱仪购自美国热电公司（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱ＡｕｔｏｆｌｅｘＴＭ（ｍａｔｒｉｘ－ａｓ－ｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）购自布鲁克公司（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ　Ａｕｔｏｆｌｅｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。

四甲氧基硅烷（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ，ＴＭＯＳ）购自武汉大学化工厂；偶氮二异丁腈（ａｚｏｄｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＡＩＢＮ，分析纯）购自上海化学试剂厂，用乙醇重结晶后使用；尿素（ｕｒｅａ）、二硫苏糖醇（ｄｌ－ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ）、碘乙酰胺（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ，ＩＡＡ）购自华美生物工程公司；乙烯基三甲氧基硅烷（ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ，ＶＴＭＳ），聚乙二醇（ＰＥＧ，Ｍｒ：１０　０００），牛血清白蛋白（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅ－ｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）、胰蛋白酶购自Ｓｉｇｍａ公司（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；甲基丙烯酸二甲氨乙酯（２，２－（ｄｉｍｅｔｈ－ｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ　ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ，ＤＥＭＡ）购自南京康满林化工实业有限公司；溴代十八烷（１－ｂｒｏｍｏｏｃｔａｄｅ－ｃａｎｅ）购自北京化工厂；乙腈（ＡＣＮ）为色谱纯，甲醇（ＭｅＯＨ）、氢氧化钠、三氟乙酸（ＴＦＡ）、醋酸（ＨＡｃ）、盐酸、甲酸（ＦＡ）、碳酸氢铵、乙酸乙酯、正己烷、磷酸二氢钾等试剂均为分析纯，购自天津市化学试剂二厂。