固定化酵母非水相催化羰基不对称还原反应的研究

文章编号:100421656(2001)0620632204固定化酵母非水相催化羰基不对称还原反应的研究何　成,许建和3,刘幽燕,庄英萍(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室生物催化研究室,上海　200237)摘要:用海藻酸钙包埋法对增殖培养的酵母细胞进行了固定化,并用于催化有机溶剂中乙酰乙酸乙酯的不对称还原反应。

考察了固定化时所用缓冲溶液的pH 、催化剂颗粒大小与用量、辅助底物种类、底物浓度、以及重复利用批次等因素对反应产物(S )232羟基丁酸乙酯的浓度和光学纯度的影响。

结果表明,固定化时应采用pH 为7的T ris 2HCl 缓冲溶液,颗粒的直径以2mm 左右为较佳;反应时应以正己烷为溶剂,正己醇为辅助底物,固定化酵母颗粒的最适用量为6g/20ml 反应液;底物的初始浓度以100mm ol/L 为佳,浓度过高对反应有一定的抑制作用;固定化细胞重复利用三次对映选择性基本保持不变。

关键词:固定化酵母;乙酰乙酸乙酯;(S )232羟基丁酸乙酯;不对称还原;非水相系统中图分类号:O62411 文献标识码:A ΞΞΞ 光学活性的β2羟基酯类化合物是有机合成中一类重要的中间体,对其制备的研究正受到普遍的重视[1,2]。

其中,利用酶的立体选择性将前手性的β2羰基酯类化合物不对称还原为手性的β2羟基酯类化合物,是较有应用前景的方法之一[3]。

与水解酶不同的是,氧化还原酶的作用必须要有辅因子的参与,因此在实际应用时更倾向于利用完整的微生物细胞而非提取的酶。

面包酵母(Baker ’s yeast ,学名Saccharomyces cerevisiae )中含有较为丰富的氧化还原酶系,是一种较为理想的生物还原剂[4]。

同时它非常便宜,易从市场上购得,培养方法也比较简单,反应时无需灭菌,只要将底物与细胞混合,在室温下即可进行反应[5]。

本文选用β2羰基酯中的乙酰乙酸乙酯为模型底物,用海藻酸钙包埋法对增殖培养的酵母细胞进行了固定化,并在摇瓶中考察了以正己烷为有机溶剂时固定化酵母细胞的催化性能,为进一步的放大实验及反应器的构建提供了坚实的技术基础。

1　材料与方法111　材料面包酵母,由日本Oriental Y east 公司生产,为固体颗粒状产品,在本工作中作为种子经增殖培养后使用;乙酰乙酸乙酯、海藻酸钠、正己烷、氯化钙、乳酸、甘油等为国内产品,分析纯试剂;蛋白胨、酵母膏为生物试剂。

112　实验方法11211　酵母的培养方法根据文献[6],每次配制培养基2～3升,其中含有:酵母膏10g/L 、蛋白胨20g/L 、乳酸30g/L 、甘油30g/L ,pH 为5.0。

经灭菌后,分别在含有200ml 培养基的1000ml 容量的摇瓶中,接入0.12g的固体颗粒状酵母,在30℃、175rpm 摇床中进行增殖培养(一般为24h )。

11212　酵母细胞的固定化培养结束后离心收集酵母细胞,并用0.9%的生理盐水洗涤三次。

将收集的菌体(约2.6g 湿重/200ml 培养基)重新悬浮在25ml T ris 2HCl 缓冲溶液(20mm ol/L ,pH7.0)中,充分混合后,加入75ml 溶有2%(W/V )海藻酸钠的T ris 2HCl 缓冲液(pH 同前),并置于摇床上振荡30分钟,使之分散均匀后用注射器吸取上述混合液,滴加到0.1m ol/L CaCl 2溶液中,待形成球状颗粒后,收集颗粒,置于新鲜的CaCl 2溶液中(浓度同前)浸泡30分钟,第13卷第6期2001年12月 化学研究与应用Chemical Research and Application V ol.13,N o.6Dec.,2001ΞΞΞ通讯联系人收稿日期:2000208222;修回日期:2000211208 基金项目:国家自然科学基金资助项目(29776018)待颗粒充分硬化后滤干,冷藏备用。

为了获得不同直径大小的颗粒,可以分别采用注射器不安装针头(<3mm)、安装9#针头并缓慢注射(<2mm)、或安装9#针头并快速注射(<1mm)。

11213　还原反应本文中的反应都在100ml摇瓶中进行。

除非特别说明,将用200ml培养基培养24h的新鲜酵母固定化后,称取6g、平均直径为<2mm的固定化颗粒投入到20ml含有0.1m ol/L底物与0.1m ol/L 正己醇的正己烷溶液中,混合后置于摇床(30℃, 160rpm)上反应24h。

11214　产物的浓度和光学纯度的测定反应结束后,取5ml反应液至旋光管中,并加入6ml正己烷充满旋光管,用旋光仪(上海物理光学仪器厂WZZ21S型)测量旋光度(α);然后取0.5ml该溶液与0.5ml内标溶液(50mm ol/L正辛醇)混合均匀,通过气相色谱仪(上海分析仪器厂1102G C型)分析即可知旋光管中产物32羟基丁酸乙酯(EH B)的浓度(c旋,g/ml)。

通过计算求取比旋光度[α]=α/(l3c旋)和对映体过量值e.e= [α]/[α]标。

其中:l-旋光管管长(1.0dm);c旋= c3测132.16/106,c测为气相色谱测得的旋光产物的摩尔浓度(mm ol/L);而反应体系中产物的实际浓度为c实=2.2c测;公式中的132.16为EH B的分子量;[α]标为正己烷中的标准比旋光值(39. 3°)。

2　结果与讨论211　对酵母培养及固定化条件的考察考察了酵母培养不同时间后的细胞得率,并将培养不同时间后的鲜酵母固定化后用于还原反应,考察不同培养时间对产物浓度的影响,结果如图1。

可以看出,随着培养时间的延长,总的细胞量有所增加,反应的速度也相应地提高了,但在48h之后变化不大,故酵母的培养时间以48h较为合适。

此外,还对固定化时所用缓冲溶液pH值的影响进行了考察,发现其对反应速度的影响不大,但对e.e.值的影响比较显著。

当固定化的pH值为6,7,8时,反应结束后产物的e.e.(%)分别为78,90,65。

因此,应在pH=7的T ris2HCl缓冲液中对酵母进行固定化。

图1　培养时间对细胞得率和产物浓度的影响◆:细胞干重;○:产物浓度Fig.1　E ffect of cultivation time on dry cellweight(◆)and product concentration(○)212　固定化酵母颗粒大小及用量的影响酵母细胞固定化后,扩散过程可能会成为整个反应的限制步骤。

本文分别选用平均直径为<1,<2,<3(mm)的固定化颗粒催化反应时,发现随着颗粒直径的增大,反应的速度相应地降低,说明固定化颗粒内部的确存在着扩散限制。

为此,在本文其它实验中,均选用直径为2mm的固定化酵母细胞。

分别取不同量的固定化颗粒进行反应,以考察固定化酵母的用量对反应的影响,结果如图2。

可以看出,当增加催化剂用量时,产物的浓度随之增大;产物的e.e.值虽有所波动,但变化不大。

当催化剂颗粒超过8g/20ml时,产物的浓度达到一个极限值,此时扩散成为限速因素。

因此,本文将固定化颗粒的用量控制在6g/20ml,即3%(W/ V)。

图2　固定化酵母用量对还原反应的影响○:对映体过量值;◆:产物浓度Fig.2　E ffect of the am ount of imm obilized yeaston the e.e.(○)and concentration(◆)of product213　固定化酵母在不同溶剂体系中的比较由于有许多种有机溶剂,选择一种温和而又常用的溶剂作为反应介质是十分必要的。

因此,我们对常用的溶剂如正己烷、正庚烷、环己烷进行336第6期 何成等:固定化酵母非水相催化羰基不对称还原反应的研究了比较,其结果如图3所示。

可以看出,正己烷与正庚烷作溶剂时对反应的对映选择性变化不大,而产物的浓度的变化却较大;以环己烷为溶剂时,产物的浓度和对映体过量值都是较差的。

因此,选用正己烷作溶剂比较合适。

图3　不同溶剂对还原反应的影响Fig.3　Bioreductions in different s olvents□:e.e ;■:EH B concentration214　不同辅助底物对反应选择性及转化率的影响氧化还原酶的作用需要辅酶(NAD (P )H/NAD (P )+)的参与。

由于面包酵母中辅酶的含量很少,因而需要使辅酶不断地再生才能使反应持续下去。

再生过程是由辅助底物的氧化来实现[6]。

为此,考察了不同辅助底物对还原反应的影响(表1)。

表1　辅助底物种类的影响T able 1　In fluence of co 2substrates on the yeast 2mediated bioreductionC o 2substrateEH B (mm ol/L )e.e.(%)n 2Hexanol18.779.4Is opropanol 29.768.5E thanol 18.018.8Lauryl alcohol2.6 由表1可以看出,以正己醇为辅助底物时,产物的e.e.值最好;而以异丙醇为辅助底物时,产物的浓度最高;以十二醇为辅助底物时,虽然可获得2.55mm ol/L 的产物却无旋光性。

此外,正戊醇和正丁醇不能作为辅助底物而使辅酶再生。

故本文选择正己醇作为辅酶再生反应的底物。

215　底物表观浓度对反应的影响前人的研究[7]已表明,面包酵母中至少有两种酶参与β2羰基链烷酯的不对称还原。

由于同一底物对于不同酶的动力学参数(如K m ,V max )是不同的。

因此,底物的浓度也是影响反应速度和选择性的重要因素之一。

从图4可以看出底物浓度较高时,反应的初速度较低,并对产物的最终浓度有一定的影响。

测得底物浓度为0.05、0.1、0.15、0.2m ol/L 时相应的e.e.(%)值为78、90、82、80。

图4　底物浓度的影响Fig.4　Dependence on substrate concentration○:0.05m ol/L ;△:0.10m ol/L ;◇:0.15m ol/L ;□:0.20m ol/L216　固定化酵母的重复利用性我们注意到,乙酰乙酸乙酯的还原反应在产物达到20mm ol/L 左右即出现停滞现象,此时即使补加固定化酵母也无济于事,说明反应的停滞并非酵母失活所致,而是受到某种物质的抑制。

经实验发现,辅酶再生的辅助底物正己醇氧化后产生的副产物醛会严重抑制酵母酶的催化活性;而将固定化酵母回收后投入新的反应液,却可以顺利地进行反应,且重复反应3次后,仍有较高的对映选择性(图5)。

这表明,设法除去反应的副产物醛、或寻找更好的辅助底物,可能是提高反应转化率的关键之所在。

图5　固定化酵母的重复利用○;对映体过量值;◆:产物浓度Fig.5　Per formance of imm obilized yeastin repeated reactions综上所述,将市场上能很方便买到的面包酵母,通过简单的培养然后用温和的海藻酸钙包埋法固定化后,能在有机溶剂系统中有效地催化羰基化合物的不对称还原。