Wnt3a诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究

现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine 2009Vol.9No.20W nt3a 诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究高胜利1△高淑红2刘丽霞1（1山西医科大学汾阳学院生理学教研室山西汾阳032200；2山西医科大学汾阳学院统计学教研室山西汾阳032200）摘要目的：研究Wnt3a 在诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化中的作用和原理。

方法：设计不同浓度，不同成分的Wnt3a 条件培养基对小鼠胚胎干细胞诱导分化，对分化细胞进行形态学鉴定，通过免疫细胞化学检测心肌肌钙蛋白-T （cTnT ）的表达，通过RT-PCR 检测肌球蛋白重链（α-MHC ）和肌球蛋白轻链（MLC -2v ）的表达。

结果：Wnt3a 诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌样细胞，分化细胞具有自动收缩性，免疫细胞化学检测心肌肌钙蛋白-T（cTnT ）表达阳性，RT-PCR 检测肌球蛋白重链（α-MHC ）和肌球蛋白轻链（MLC -2v ）表达阳性。

经典Wnt 信号途径的抑制剂Frizzled-8/Fc ，能够抑制Wnt3a 的诱导分化作用。

结论：Wnt3a 通过经典Wnt 信号途径诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化。

关键词：胚胎干细胞；心肌分化；Wnt3a ；经典Wnt 信号途径中图分类号：Q95-3，Q813文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009）20-3852-03Effect of Wnt3a in Inducement of Mouse Embryonic Stem Cells toDifferentiate into Cardiac Muscle CellGAO Sheng-li 1△,GAO Shu-hong 2,LIU Li-xia 1（1Department of Physiology Fenyang College Shanxi Medical University Fenyang 032200,China;2Department of Statistics Fenyang College Shanxi Medical University Fenyang 032200,China ）ABSTRACT Objective:To investigate the role and principle of Wnt3a in the induction of mouse embryonic stem cells cardiac differentiation.Methods:Different concentrations and components of Wnt3a conditioned medium were used to induce mouse ES cells.Differentiated cells were identified on the morphology .Cardiac troponin-T （cTnT ）is detected by immunocytochemical,Myosin heavy chain （α-MHC ）and myosin light chain （MLC -2v ）is detected by RT-PCR.Results:Wnt3a induces mouse ES cells to differentiate into myocardial cells that contraction is automatic.Cardiac troponin-T （cTnT ）expression is positive by immunocytochemical.Myosin heavy chain （α-MHC ）and myosin light chain （MLC -2v ）expresses positive by RT-PCR.Canonical Wnt signaling pathway inhibitors Frizzled-8/Fc could inhibit the differentiation efficiency of Wnt3a.Conclusion:Wnt3a induces cardiac differentiation of embryonic stem cells through canonical Wnt signal pathway.Key Words:Embryonic stem cell;Cardiomyocyte differentiation;Wnt3a;canonical Wnt signal pathwayChinese Library Classification （CLC ）:Q95-3,Q813Document code:A Article ID:1673-6273（2009）20-3852-03作者简介：高胜利（1975-），男，硕士，主要研究方向：干细胞研究通讯作者：高胜利E-mail ：gao1583@ （收稿日期：2009-09-03接受日期：2009-09-30）胚胎干细胞（ES 细胞）在体外诱导条件下能分化成心肌细胞[1]，高效获得纯化的心肌细胞可以为治疗心肌坏死性疾病（如心肌梗死）源源不断提供细胞移植体。

为提高心肌细胞分化率，多种化学物质和细胞因子应用于ES 细胞向心肌细胞分化的研究[2]。

Wnt 信号途径对许多物种的胚胎心肌细胞分化、早期心脏形态发生、管状胚胎心脏到四腔心形成、成熟心脏组织重塑具有多重作用[3]。

作为Wnt 信号途径的一种蛋白质，Wnt3a 能促进小鼠胚胎发育早期心肌细胞分化[4,5]，由此推测Wnt3a 能够诱导ES 细胞分化为心肌细胞，为此建立ES 细胞分化体系，检测Wnt3a 在体外诱导心肌细胞分化作用，并对其机理作初步的探讨。

1材料和方法1.1材料 1.1.1干细胞来源小鼠胚胎干细胞来自于129纯系小鼠胚胎干细胞系（ES-D3），25-30代。

1.1.2主要试剂DMEM 高糖培养基，胎牛血清，Frizzled-8/Fc Chimera ，Wnt3a peptide ，小鼠抗小鼠心肌肌钙蛋白-T （cardiac Troponin T,cTnT ），SP 试剂盒及DAB 显色试剂盒，RNA 提取试剂盒，Taq 酶及其它分生试剂。

引物设计见表1。

1.1.3主要仪器医用净化工作台，CO 2培养箱，倒置显微镜，凝胶成像系统，PCR 仪。

1.2实验方法1.2.1小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）的复苏培养制备凝胶处理的生长抑制小鼠胚胎成纤维细胞（MEF ），ES 细胞复苏后，接种于凝胶铺板的MEF 饲养层上。

将已培养2～3天生长旺盛的细胞克隆，消化成单细胞悬液，加入MEF 条件化培养基，以1：3～1：6传代，培养基颜色变黄时半量换液。

2～3天传代一次。

1.2.2细胞分化培养取对数生长期的ES 细胞，消化吹打成单个细胞悬液，以基础培养基调密度至1×l05/ml ，转入无凝胶铺板的培养皿，培养箱中悬浮培养4天。

悬浮的ES 细胞聚集成团3852··现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine 2009Vol.9No.20块状的拟胚体，以微吸管吸取拟胚体，转入含有0.1%明胶包被的盖玻片的24孔培养板中，每孔一个拟胚体。

分别加入不同的ES 细胞分化培养基（即基础培养基加入不同浓度的Wnt3a ）。

隔天换液。

1.2.3分化细胞鉴定倒置显微镜下观察ES 细胞生长速度、形态，拟胚体是否出现自动节律性收缩，记录搏动频率和搏动持续时间。

对自动节律性收缩的分化细胞做免疫细胞化学和RT-PCR 鉴定。

1.2.4Wnt3a+Frizzled-8/Fc Chimera 诱导ES 细胞分化Wnt3a （400ng/ml ）诱导分化培养基中加入Frizzled-8/Fc Chimera （200ng/ml ），诱导ES 细胞分化，检测拟胚体出现自动节律性收缩的百分率，并与Wnt3a （400ng/ml ）组作对比。

1.3统计学处理应用SPSS 统计软件包11.5对数据进行处理。

数据均用s 表示，采用student t 检验进行分析，两两比较用LSD 法。

2结果2.1Wnt3a 诱导ES 细胞心肌细胞分化ES 细胞贴壁培养2天，各分化组可见自动节律性收缩的细胞，频率为45～75次/分，持续10天。

分化细胞的形态逐渐改变，数目逐渐增多，16天左右彼此相连成条索状（见图1：A ，B ，C ，D ）。

与不加诱导剂比较，不同浓度的Wnt3a 均有诱导心肌细胞分化的作用，其中400ng\ml 能显著提高诱导分化率，分化率达59.16%（见表2）。

2.2分化细胞的鉴定免疫细胞化学技术检测心肌肌钙蛋白（TnT ）表达阳性（见图1：E ，F ）。

RT-PCR 检测肌球蛋白重链（α-MHC ）和肌球蛋白轻链（MLC -2v ）的表达阳性（见图2）。

2.3Wnt3a+Frizzled-8/Fc Chimera 诱导分化率降低Wnt3a （400ng/ml ）诱导分化液加入Frizzled-8/Fc Chimera（200ng/mL ），可见自动节律性收缩的细胞，分化率为15.8%，与Wnt3a （400ng/ml ）组相比，分化率降低(p<0.01)（见表3）。

表1引物设计Table 1Primer designPrimersequence α-MHC(301bp)5'-CTG CTG GAG AGG TTA TTC CCT CG -35'-GTG AGC GGC GCA TCA AGG -3''MLC-2V(500bp)5'-GCC AAG AAG CGG ATA GAA GG-3'5'-CTG TGG TTC AGG GCT CAG TC-3'β-actin(427bp)5'-GT CAG AAG GAC TCC TAT GT -3'5'-ATG AGG TAG TCT GTC AGG TC -3β-actin(280bp)5'-CAG AAG GGT GAC TCC TAT GT-3'5'-AGG ATG TAG TCT AGG GTC TC-3LSD 两两比较结果：分别与0ng\ml 浓度比较：△p <0.01,分别与200ng/ml 浓度组比较：*p <0.01，**p >0.05，与400ng/ml 浓度组比较：#p<0.01。