高粱C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分子克隆及其转基因水稻的培育

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大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达作者：何晓亮李竹梁立强孟万利来源：《河北科技大学学报》2019年第02期摘要：为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的結构和功能，采用PCR（聚合酶链式反应）、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析，扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上，并导入到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。

通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。

所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。

关键词：基因工程;大肠杆菌;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶;基因表达;二氧化碳中图分类号：Q812文献标志码：AAbstract：In order to better study the structure and function of phosphoenolpyruvate carboxylase， the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is cloned and expressed by PCR （polymerase chain reaction）， double enzyme digestion and cell transformation. The results showthat the new phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Escherichia coli is successfully amplified andcloned into the prokaryotic expression vector pET-30a， and then introduced into Escherichia coli BL21 expression system. The phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli is successfully induced by IPTG. The phosphoenolpyruvate carboxylase can be efficiently expressed by using the proposed method， which provides preparation for further scale expression， purification and application.Keywords：genetic engineering; Escherichia coli; phosphoenolpyruvate carboxykinase; protein expression; CO2磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是一种存在于磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳反应生成草酰乙酸过程中的催化酶[1-3]。

花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建

潘昱名，刘风珍，万勇善，郑成超 ’
（．山东农业大学农学院；２１．作物生物学国家重点实验室，山东泰安２１１）７０８
摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＥＣｓ）是控制植物籽粒中蛋白质／ＰＰａｅ油脂含量比例的关键酶。本研究利用ＲＰＲ技术，克隆ＰＰａｅ基因的ｃＮＴ— ＣＥＣｓＤＡ片段，并将克隆的ＰＰａｅ因片段反向连接替代植物表达载体ＥＣｓ基
ｐＧＥ。为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体。ＢＰＰ
关键词：花生；ＰＰ羧化酶；ＲＰＲ；反义表达载体ＥＴ— Ｃ中图分类号：Ｓ１．３８７文献标识码：Ａ文章编号：１０００—２２（００ｌ００ —０３４２１）Ｏ一０１５
（．ＡｒｎｍｏｌｅｏｈｎｏｇＡｃｌｒｌｎｖｒｔ；２ＳａｅａｏａｒｏｒｐＢｏｏｙ，Ｔｉ７０８，Ｃｉａ１ｇｏｏｙＣｌｇｆａｄｎｕｔａＵｉｓｙ．ｔｅＫｙＬｂｒｔｙｆｏｉｌｅＳｕｅｉｌｏＣｇａａ２１１ｎｈｎ）
ＰＩ２Ｂ１１的ＧＳ基因。从花生栽培品种荔蒲大花生中克隆获得编码ＰＰａｅ基因的ｃＮＵＥＣｓＤＡ片段（８ｐ，测序８６ｂ）
结果显示其核苷酸序列与已报道的花生（Ｕ９６９、棉花（Ｙ０９９）Ｅ３１２）Ａ０８３、大豆（１７７）Ｄ０１、拟南芥
Ａｂｔａｔｈｓｈｅｏｐｒｖｔｃｒｏｙａｅ（ＥＣｓ）ｐａｓａｐｒｎｒｌｉｅｃｎｒｌｆｈａｏｏｅｓｒｃ：ＰｏｐｏｎｌｙｕａａｂｘｌｅｓＰＰａｅｌｙｎｉｏｔｔｏｔｏｔｅｒｔｆｈｍａｅｎｈｏｏｔｉｔ

002植物磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其编码基因研究进展

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其编码基因研究进展杨玲玲（化学与生命科学学院2009级食品质量与安全监测专业学号091004024）指导教师：蔡英卿副教授摘要：本文主要介绍了C4植物中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）及其编码基因在近年来的研究进展，以及对PEPCK的结构，功能,影响其活性的因素等方面进行讨论。

关键词：C4植物磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因光合速率磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK，EC4．1．1．49)催化如下的反应：OAA +ATP →PFP+ADP+CO2。

PEPCK主要作用是参与C4代谢途径的CO2固定作用。

其主要分布在C4植物的叶肉细胞的叶绿体内，形成CO2的浓缩机制为维管束鞘细胞的C3途径提供CO2。

近些年来利用生物技术已将编码该酶的基因(ppc)转移到C3作物中并得到了超量表达，因此，PEPCK成为改善C3作物光合作用重点关注的酶。

对PEPCK有两种形式：一种是存在于哺乳类、鸟类和昆虫等动物内的PEPCK．它利用GTP为底物，Mt 为70000 ；另一种存在于植物、细菌、酵母和藻类中，利用ATP作底物，这种PEPCK的蛋白质分子序列与动物中的不同。

植物的PEPCK与细菌、酵母和藻类的氨基酸序列比较接近，都有一个与ATP结合的保守序列，但来自植物的PEPCK 相对分子质量较太。

本文主要简述近年来对C4植物PEPCK的研究进展。

1 PEPCK的分布与定位1.1 PEPCK的分布1.2 PEPCK的定位2 PEPCK的蛋白结构和生理功能2.1 PEPCK的蛋白结构2.1.1相对分子质量2.1.2活化中心2.2 PEPCK的生理功能2.2.1 生糖作用2.2.2 浓缩CO22.2.3 细胞内的PH平衡2.2.4 其他作用3 PEPCK酶的调节3.1磷酸化调节3.2产物调节4 PEPCK的分子生物学4.1 PEPCK基因的结构特征4.2 PEPCK基因的克隆5 结语。

甘蔗C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表达载体构建

第３期
・研究探计
１材料与方法
１１材料．
１１１质粒．．
因构建含不同启动子的植物表达载体，到ｐ用ＵＣｐｐ、Ｓ０４、ＵＣ１、Ｂ１１ｅｃｐＣＬ０１ｐ９ｐＩ２
四个不同的质粒。ｐｐｐＵＣｅｃ为ｐＵＣ１９克隆载体，Ｘａ经ｂＩ内切酶位点插人甘蔗ＣＰｐｃ基因。ｐＣＬ０１为植物表达载体，左右边界内含有ｈｇ和带内含子的ｇｓ因，各自带有３ＳＳ０４在ｙｕ基且５启动子和３Ｓｐｌ（、ｏｏｙＡ）外源基因的启动子为２３Ｓ，止子为３Ｓｐｌ（。５ｏｙＡ）ｎｓｐｌ（。ｘ５终５ｏｙＡ）ｐＵＣ１９为克隆载体，于构建含２３Ｓ启动子和３Ｓｐｌ（载体。ｐＩ２用ｘ５５ｏｙＡ）Ｂ１１为植物表达载体，
供了良好的前景Ｌ。３Ｊ
甘蔗是生产力最高的Ｃ作物之一，养生长期长，其生长发育过程中既有高温潮湿强营在光下的快速生长期，有在较低温或干燥下的糖分积累期。因此，玉米或高粱ＣＰｐ也与ｃ基因比较有其自身的表达特点。从高粱和玉米基因表达与转入Ｃ作物表达中发现，然两者是目前。虽

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展

2021年 2月 Journal of Science of Teachers′ College and University Feb. 2021文章编号：1007-9831（2021）02-0054-07植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展于济1，2，沙伟1，2，张梅娟1，2，马天意1，2（齐齐哈尔大学 1. 生命科学与农林学院，2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006）摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31）是广泛存在的一种细胞质酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO3-生成草酰乙酸．PEPC作用的产物在植物的生长发育过程和植物应对环境胁迫反应中起到调控的作用，因而被广泛关注．介绍了植物PEPC的种类、结构特征、不同物种中PEPC基因的克隆与分离、在植物逆境反应中的应用、植物PEPC 的活性调节，为深入研究PEPC基因提供理论依据．关键词：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；植物；植物逆境胁迫中图分类号：Q945 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1007-9831.2021.02.011Research progress of plant phosphoenolpyruvate carboxylaseYU Ji1，2，SHA Wei1，2，ZHANG Meijuan1，2，MA Tianyi1，2（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering andProtection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）Abstract：Plant phosphoenolpyruvate carboxylase（PEPC，EC 4.1.1.31）is a ubiquitous cytoplasmic enzyme that catalyzes the production of Oxaloacetate by phosphoenolpyruvate and HCO3-．The products of PEPC play important roles in the growth and development of plants and the responses of plants to environmental stresses，so that the PEPC is widely concerned．Introduced the types，structural characteristics，the cloning and isolation of PEPC genes in different species，the applications in plant stress responses，and the researches of plant PEPC activity regulation，which provides a theoretical basis for further studiesof PEPC genes．Key words：phosphoenolpyruvate carboxylase；plant；plant stress responses磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31）是一种胞质酶，在HCO3-存在的情况下，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）的β-羧化反应，以Mg2+为辅因子生成草酰乙酸（Oxobutanedioic acid，OAA）和无机磷酸[1]70，此反应为不可逆反应．PEPC存在于所有植物中，如绿藻、蓝细菌、大多数古细菌、非光合细菌中，但在动物和真菌中不存在[2]15． PEPC以其在C4和景天酸代谢（Crassulacean acid metabolism，CAM）光合作用中的作用而闻名，在此过程中，其初步固定了大气中的CO2[3]274．然而，PEPC在C3植物的非光合和光合组织中也发挥着广泛的作用，它可以通过补充C4-二羧酸进行能量和生物合成代谢，主要起抗衰老作用[4-5]．在C3植物叶片和非光合收稿日期：2020-11-15基金项目：齐齐哈尔大学大学生创新创业训练计划项目（202010232817）；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费青年创新人才项目（135309364）；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目植物性食品加工技术特色学科专项（YSTSXK201876）；黑龙江省人力资源和社会保障厅2018年省级留学回国人员择优资助项目作者简介：于济（1997-），女，吉林松原人，在读硕士研究生，从事植物逆境分子遗传学研究．E-mail：*****************通信作者：马天意（1989-），男，黑龙江齐齐哈尔人，讲师，博士，从事植物逆境分子遗传学研究．E-mail：********************组织中，PEPC的主要作用是在三羧酸循环中补充中间体，以及后面的氮同化和各种生物合成途径[3]274．此外，PEPC还参与了广泛的生理和发育过程，包括种子萌发和发育、果实成熟、豆科植物根瘤固氮等，在气孔保卫细胞中提供苹果酸以及增强了对渗透压和生物胁迫的耐受性[2，6-9]．正是因为PEPC在植物中发挥着非常重要的作用，因此被人们广泛关注．为了更好地了解植物体中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的作用机制，本文概括分析了植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分类、功能、分离与克隆、活性调节以及在植物抵抗逆境过程中的作用等方面的研究结果，介绍了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在基因工程方面的应用，也为进一步研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因提供了理论基础．1 PEPC的基本结构1984年，首先从大肠杆菌（Escherichia coli）克隆的PEPC基因推导了PEPC的一级结构[10]．目前，已经分别在植物和细菌中发现了许多PEPC序列，包括同一生物体中的同工型，并且大约500个部分序列已经记录在GenBank中，主要用于系统发育重建[11-12]．系统进化树显示，这些PEPC是从相同的祖先进化而来的[3，13]．PEPC多肽的大小随生物体的种类而异：细菌、维管束植物、蓝细菌、原生动物（如疟疾病原体）的氨基酸残基数量大约为870（100 kDa），970（110 kDa），1010（116 kDa）或1150（134 kDa）[1]71．尽管已知古细菌的亚基大小非常小（约60 kDa），并且没有常见的变构调节子，但尚无来自古细菌的PEPC 序列数据[14-15]．此外，还寻找了藻类PEPC的序列数据，因为硒的纯化亚型之一是由3种不同的亚基组成的[16]，这种新的PEPC类型也在发育中的蓖麻（Ricinus communis）种子中被发现[17]．在拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组序列中确定了另一种新的进入高等植物PEPC的第4种亚型[18]，在分子大小上与蓝细菌的PEPC相似，并且缺少N端磷酸化位点，这是植物PEPC的标志．在植物和微生物界的多样性和广泛分布使得PEPC成为系统发育分析中最有趣的目标之一．对PEPC序列的比对表明，大约100个残基始终是保守的（相同的），另外100个残基是保守的具有相似的氨基酸残基的，对于成对的陆地植物酶，其识别率超过71%，因为C末端是高度保守的，所以长度的任何差异似乎是由于在N末端或内部区域（大约10个基因位点）处添加或插入了额外的序列而引起的．所制备的重组PEPCs的数量和特征仍是有限的，所涉及的物种目前不超过15个[1]71，因此有必要做进一步的工作．2 植物PEPC的分类及生理生化功能PEPC基因已大致分为2个亚家族，分为植物型PEPC（PTPC）和细菌型PEPC（BTPC）[19]11．PTPC表现出高度的遗传保守性，并在其100~110 kDa蛋白质中包含高度保守的N末端丝氨酸磷酸化基序和关键的C末端四肽QNTG[1，20]．相比较而言，116~118 kDa的BTPC蛋白质显示低序列相似性并包含1个类似原核的C端（R/K）NTG四肽基序[17，21]．PTPC典型地存在于同型四聚体-1类PEPCs中，而BTPCs作为调节和催化亚基存在于超常的异质配合物中（2类PEPCs）[2]26．PTPC又可以分为C4，C3和根特异亚型[21-22]，它们在植物细胞中发挥着不同的功能．植物中PEPC的C3，C4类型至少在3个关键方面不同[23]：（1）C4型的PEPC通过吸收C4和CAM物种中的大气CO2参与了CO2浓缩机制的第1步，C3型PEPC存在于所有植物中，它参与多种生理功能，如三羧酸循环中中间体的补给，OAA的合成以及随后的苹果酸及其衍生物的合成[2]15．（2）C4型PEPC存在于叶肉细胞中，其表达方式对实现C4光合循环具有重要意义[24]，而C3型的PEPC分布在C3和/或C4植物的不同组织中，起到管家的作用[22]865．（3）C4型PEPC的底物（PEP）饱和常数（Km）高于C3型，并且显示更多对苹果酸的耐受性，但是在一些植物物种中（如南美白菊科（Chenopodiaceae）植物和异子蓬（Suaedaaralocaspica））尚未将不同的PEPC区分为C3或C4类型，仅命名为ppc-1，ppc-2[25]，它们的功能需要进一步验证．3 植物PEPC基因的分离与克隆1953年，植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶从菠菜（Spinacia oleracea）叶中首次被分离出来．目前，PEPC基因已在多种植物中被鉴定和研究，拟南芥和水稻（Oryzasativa）中分别报道4，6个PEPC家族成员[18，26]，在大豆（Glycine max）中共鉴定到10个PEPC基因（GmPEPC1~10），其中GmPEPC6，GmPEPC8，GmPEPC9被铝毒、寒害、盐害等非生物胁迫诱导表达[27]．花生（Arachis hypogaea）基因组报道5个PEPC 基因（AhPEPC1~5）[28]，涂嘉琦[29]等从蔓花生（Arachis duranensis）基因组中鉴定到9个PEPC基因．马海洋[30]等从菠萝（Ananas comosus）基因组中鉴定出3个PEPC基因．邵姁[31]等从蓝莓（Vaccinium corymbosum）果实中克隆到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因VcPEPC，该基因开放阅读框全长为2 907 bp，可编码968个氨基酸，分子量为110.59 kD．赵晋锋[32]等从谷子（Setariaitalica）基因组中鉴定出1个SiPEPC基因，进一步研究表明，SiPEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应，推测SiPEPC基因参与了谷子对非生物逆境的应答，可能在干旱和其它逆境胁迫信号途径中起关键作用．4 植物PEPC基因在植物逆境反应中的作用非生物胁迫（如盐度、干旱、高温）通常会对植物的光合作用产生负面影响[33]901．PEPC已被建议用于支持主要的生理代谢途径（即三羧酸循环中中间体的补给等），以帮助植物和微生物避免和/或耐受极端的环境胁迫[7，34]．在水分胁迫下，PEPC介导PEP的羧基化为OAA，随后合成苹果酸和渗透活性化合物（糖、氨基酸、糖醇）以帮助植物耐受水分胁迫[34-35]．铝的积累、磷和铁的缺乏导致PEPC的上调，从而增加了包括苹果酸和柠檬酸在内的有机酸合成[36-38]．有机酸向土壤中的排泄不仅可以增加磷和铁的可溶性形态并为植物所利用，还可以与Al3+形成稳定的配合物，从而降低毒性[39]．生物应激（如病毒感染）也可以诱导PEPC的高活性，推测PEPC可以在防御作用中增强植物抗毒素、氨基酸、蛋白质的合成[40-41]．也有研究表明，番茄（Lycopersicon esculentum）PEPC基因在盐、冷、植物激素胁迫下均有不同表达[19]15．可以推测PEPC 对植物的生长发育和抗逆性起一定作用．5 PEPC基因的应用目前，已经在多种植物物种中使用了不同PEPC基因作为改善作物的手段．如在水稻中，C4-PEPC使转基因水稻具有耐旱性，但叶绿体定位的PEPC对铵同化至关重要[42]．玉米（Zea mays）C4型PEPC基因在小麦（Triticum aestivum）受体内实现了正确的转录和准确的剪接，也证明了玉米C4型PEPC基因在小麦中表现了一定的光合生理效应[43]．以转甘蔗（Saccharum officinarum）PEPC基因的籼稻植株和非转基因的植株为研究材料，发现在光合效率和产量相关性状方面，转甘蔗PEPC基因植株都有较大提高，可以实现增产目的[44]．张桂芳[45]等首次将含有稗草（Echinochloacrusgalli）根型的PEPC基因对水稻进行遗传转化，研究结果表明，转基因水稻的PEPC活性最高，为对照的5.85倍，植株叶片的净光合速率（Pn）较对照相比提高了20.0%．尹吴[46]等发现，与对照相比，转玉米PEPC基因的杨树表现出较强的光利用能力，其羧化能力和酶活性与对照相比最高可分别增加62.3%，38.6%．最近有研究表明，许多PEPC基因在增强对各种非生物和生物胁迫的耐受性中起调节作用．在干旱和盐胁迫下，PEPC的过度表达增强了耐受性[8]1513，但抑制导致转基因植物对渗透胁迫的敏感性增加[47]．同样，拟南芥AtPPC4也可能在干旱胁迫中发挥作用[33]906．然而，表达PEPC的马铃薯（Solanum tuberosum）转基因植株表现出整体有机氮含量的增加，但淀粉和可溶性糖含量有所损失[48]．6 植物组织中PEPC的活性调节PEPC通常由4个相同的亚基组成，相对分子质量约为95~110 kDa．大多数PEPC是变构酶，具有多种变构效应物，具体取决于生物的种类[1]70．此外，维管植物PEPCs通过位于N末端附近的保守丝氨酸处的可逆磷酸化来调节[49]．目前解析了来自大肠杆菌和玉米的PEPC三维结构[50-51]，这种结构信息以及通过定点诱变获得的信息为长期以来一直深入研究的催化和变构调节的分子机理提供了启示．大多数PEPC都受变构调节，维管植物的效应仅限于一组效应类型，双子叶植物的PEPCs被葡萄糖6-磷酸（G6P）激活，并被L-苹果酸或天冬氨酸抑制，而单子叶植物的PEPC被甘氨酸或丙氨酸进一步激活[52]154．相反，大肠杆菌PEPC受更复杂的方式调节，被乙酰辅酶A、果糖1，6-双磷酸、长链脂肪酸、鸟苷3′-二磷酸5′-二磷酸激活，并被天冬氨酸或L-苹果酸抑制[53]．此外，细菌PEPC中不存在的调节性磷酸化是植物PEPC中固有的[1]73．调节性磷酸化后，PEP的半饱和浓度略有降低，而抑制剂的半饱和浓度在包含底物和Mg2+生理浓度的反应混合物中增加了约2.7倍[52]155．Tovar-Mendez[52，54-55]等采用目前可用的最明确的玉米C4-PEPC制剂进行了全面的动力学分析，从生理条件下的动力学测量清楚地表明了变构效应子和磷酸化的重要性．S形PEP饱和度曲线归因于附加的PEP与G6P位点的结合[1]73，这些研究成功地应用了变构调控的协调过渡模型来描述玉米C4-PEPC的动力学行为，并且通过快速动力学分析观察到伴随变构过渡的构象变化[56]．PEPC的活性在多个层次上受到调节．变构控制由调节PEPC活性（尤其是在细胞质pH值下）的正（葡萄糖6-P，甘氨酸）、负（L-苹果酸，天冬氨酸）效应子施加[3]280．此外，C4-PEPC通过光依赖性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PEPCK）进行调节性磷酸化[57]．PEPC的磷酸化形式与去磷酸化形式的动力学性质不同，如更高的最大反应速率对PEP的亲和力更高，对变构效应子的敏感性有所改变，从而减轻了苹果酸对其抑制作用，并增强了其对葡萄糖-6-P和甘氨酸的活化作用[58-59]．高粱（Sorghum bicolor）中所有PTPC（SbPPC1-5）均含有带有保守丝氨酸的N末端磷酸化结构域，BTPC （SbPPC6）中不存在此域，PEPCK基因家族包括3个基因（SbPPCK1~3）[60]，在叶肉细胞中，SbPPCK1的表达是由光触发的，其转录本在叶肉中比束鞘细胞更为丰富，由于这些原因，它被认为是光合异构体，其中SbPPCK2和SbPPCK3的功能未知[61]．另一种可能调控PEPC活性的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）是保守的赖氨酸残基的单泛素化作用，使该酶对苹果酸和天冬氨酸更加敏感[62-64]．据报道，该PTM（仅针对C3型PEPCs）存在于蓖麻种子[62]、Hakea prostata种子[63]、高粱种子[64-65]、拟南芥叶片[65-66]中．此外，在不同的植物组织（叶片、保卫细胞、根、果实）[67-70]以及大麦（Hordeum vulgare）、小麦、高粱种子[71-74]中还报道了2条免疫反应性PTPC条带，表明上部条带是下部条带的单泛素化形式．PEPC改变了该酶的动力学特性，从而干扰了其与PEP结合的能力，并增强了其对大多数代谢物效应子的敏感性[62]29656．7 展望植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作为C4型光合途径的关键酶，对其结构特点、代谢途径已有较为深入的研究[75]．现在PEPC基因已经在越来越多的植物中被发现，并对其功能进行研究探索．在C4和CAM植物中，PEPC的作用以及其基因表征信息比较详细，但在C3植物中PEPC表达的细节报道很少，仍需进一步探索．转PEPC基因植物也在不同方面表达出PEPC基因对植物的调控功能，PEPC作为植物中广泛存在的酶，其在植物应对环境胁迫过程中的作用逐渐被发现，尤其是CAM植物中的大多数物种具有较高抗逆性，而这之中PEPC的相关功能机制还有待进一步挖掘，因此有必要进一步对PEPC基因在植物抗逆性研究中的作用进行详细探索．参考文献：[1] Izui K，Matsumura H，Furumoto T，et al．Phosphoenolpyruvate carboxylase：a new era of structural biology[J]．Annual reviewof plant biology，2004，55：69-84[2] O′Leary B，Park J，Plaxton W C．The remarkable diversity of 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C4关键酶基因研究

C4关键酶基因研究磷酸烯醇式丙酮酸狡化酶基因基因克隆及其序列比较分析研究近二十年来，引起人们关注较多的C4途径关键酶首先是磷酸烯醇式丙酮酸梭化酶。

PEPC存在于所有能进行光合作用的有机体中，包括高等植物、绿藻、蓝细菌和光合细菌。

而且大多数非光合细菌和原生动物中也存在这种酶，但在动物、真菌和酵母中不存在。

从1984年来，许多物种诸如大肠杆菌、蓝藻、谷氨酸棒杆菌、冰叶日中花、马铃薯、大豆、玉米、高粱、水稻、黄花菊属等植物的PEPC 基因相继克隆成功。

并且其序列特征及结构也得到了详尽的解析。

研究证明，高等植物的PEPC是由多基因家族编码的。

家族中的多个成员已在不同植物如玉米，高粱，冰叶日中花中被确认。

即PEPC蛋白存在多种同工酶形式：C4光合型、C3光合型、CAM型及非绿色型等，甚至在每种植物的不同组织中，其Ppc基因可能存在着不同的类型，如C4光合型PEPC主要在叶肉细胞中表达，并且受光照的调控，具有组织特异性。

PEPC基因在玉米和高粱中以单拷贝形式存在，而在Flacerai属植物中则以多拷贝形式存在。

根据序列特征和功能结构，植物Ppc基因被划分为三个亚族。

C4型，主要叶片中大量表达；C3-1型，主要在黄色叶片、茎等许多部位表达，C3-2型即根型，主要在根组织中特异表达。

而且不同的PEPC基因家族成员也分别位于不同的染色体上。

如在玉米中，C4型Ppc位于第9染色体上，C3-1:型的Ppc位于第7染色体上，C3-2型的Ppc有两个拷贝，分别位于第4和5染色体上，每一种成员编码一定的异构体，并各自在生理学反应中担当特定的角色。

由于C4形式的PEPC在C4光合作用中起到的重要作用，目前大量的研究主要集中在C4形式的PEPCP上。

对Ppc基因研究较多还有高粱和Flvaeria属的植物，在高粱的基因组克隆和cDNA克隆研究分析认为高粱仅仅有3个单拷贝的Ppc 基因，分属于三个不同的基因亚族。

而在光合代谢途径更具特殊性的双子叶植物Flaveria属植物，它们的Ppc基因也至少由3个基因亚族组成，每一个亚族都是由多基因编码的。

第三单元专题突破2 不同生物固定二氧化碳的方式比较

专题突破2不同生物固定二氧化碳的方式比较课标要求说明植物细胞的叶绿体从太阳光中捕获能量，这些能量在二氧化碳和水转变为糖与氧气的过程中，转换并储存为糖分子中的化学能。

考情分析不同生物固定二氧化碳的方式比较2023·湖南·T172021·辽宁·T22 2021·天津·T152021·全国乙·T29典例示范某研究小组在研究小麦、玉米和芦荟的光合作用时，分别测得三种植物一昼夜CO2吸收速率的变化量，结果如图1：(1)图1中小麦在10～12 h光合作用速率下降的原因是______________________________。

(2)据图1判断芦荟在10～16 h光合作用速率________(填“是”或“不是”)0。

(3)小麦进行暗反应时，CO2被C5固定后，形成C3，但科学家在研究玉米等原产在热带地区绿色植物的光合作用时发现，这类植物固定CO2时，CO2中的碳首先转移到含有四个碳原子的有机物(C4)中，然后才转移到C3中，科学家将这类植物叫作C4植物，将其特有的固定CO2的途径叫作C4途径；此类作物没有“光合午休”的现象。

而像小麦等仅有C3参与CO2固定的植物叫作C3植物，将其固定CO2的途径叫作C3途径。

若用14C标记大气中的CO2，则小麦植株中14C的转移途径为________________________；玉米植株中14C的转移途径为____________________________________________________。

(4)请据图2比较C3、C4植物的结构并完善表格。

细胞类别C3植物C4植物维管束鞘细胞形态小①________叶绿体无有，但无基粒或基粒发育不良叶肉细胞排列栅栏组织、海绵组织部分叶肉细胞与维管束鞘细胞形成“花环型”结构叶绿体②________ 有，但不能进行暗反应(5)C3途径的CO2固定是通过Rubisco来实现的；C4途径的CO2固定是通过PEP羧化酶催化完成的，PEP羧化酶催化CO2连接到PEP上，形成四碳酸。

高粱5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基N(Epsps)叶绿体转运肽(CTP)的克隆及其在转基因玉米中的功能验证

ＣｏｒｒｅｓＤｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｊｌａｉ＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ５－ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ－３一ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ＥＰＳＰＳ），ｗｈｉｃｈｈａｓａｎａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｗｉｔｈｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ｃａｎｃａｔａｌｙｚｅ５－ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ－３一ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＥＰＳＰ）ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｗｉｔｈｓｈｉｋｉｍａｔｅ一３一ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓ３Ｐ）ａｎｄ
合成５一烯醇式丙酮酰莽草酸一３一磷酸（ＥＰＳＰ），具有与草甘膦结合的活性位点，且结合后会抑制ＥＰＳＰＳ的活性，在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值。为了培育抗草甘膦玉米（Ｚｅａｍａｙｓ），本研究通过对高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）ＥＰＳＰＳ基因的结构分析，克隆了该基因５ ’ 端的叶绿体转运肽（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｉｔｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＴＰ）。将该转运肽与来源于农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＣＰ４Ｅ基因整合，以Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ为启动子，３５ＳｐｏｌｙＡ为终止子，构建表达载体，同时以不含有转运肽的ＣＰ４Ｐ５基因为对照，遗传转化玉米得到稳定转基因株系；用ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ等方法检测转基因玉米ＣＰ４ＥＰＳ基因的表达量并对其进行草甘膦抗性检测，研究发现，不含转运肽的转化事件虽然ＣＰ４Ｅ基因表达量与含有转运肽的基本一致但却不具有草甘膦抗性，而含有转运肽的转化事件则抗性明显。说明转运肽并不影响ＣＰ４ＥＰＳ基因的表达，但对转基因植株草甘膦抗性起着重要作用，说明本研究克隆的叶绿体转运肽能够正常行使其生物学功能。研究结果为利用Ｅ关键词基因培育抗草甘膦作物提供了重要参考资料。叶绿体转运肽，高粱，５一烯醇式丙酮酰莽草酸．３一磷酸合酶，转基因，玉米

一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因[发明专利]

专利名称：一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因专利类型：发明专利
发明人：刘进元,乔志新
申请号：CN200710117816.2
申请日：20070625
公开号：CN101100661A
公开日：
20080109
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因。

该磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

该磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因可用于提高植物中的油脂含量。

申请人：清华大学
地址：100084 北京市海淀区清华园
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
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一种转化高粱cDNA文库改良水稻品种的方法[发明专利]

专利名称：一种转化高粱cDNA文库改良水稻品种的方法专利类型：发明专利
发明人：乔保建,付锡江,任代胜,夏祥华,陶元平,彭冲
申请号：CN201810733069.3
申请日：20180705
公开号：CN108823243A
公开日：
20181116
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种转化高粱cDNA文库改良水稻品种的方法，涉及分子生物学领域。

本发明通过构建高粱的cDNA文库，并通过农杆菌介导转化进入水稻基因组中，高通量改良水稻品种，在获得的转基因系中筛选具有优良基因特性的个体，转基因系与野生型相比，在株高，分蘖、抽穗期、抗性淀粉含量方面均呈现出明显的变化，考种分析显示部分水稻转基因系与产量提升相关。

本发明具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。

对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良。

申请人：安徽袁粮水稻产业有限公司
地址：241000 安徽省芜湖市弋江区中山南路717号服务外包产业园A12栋
国籍：CN
代理机构：芜湖思诚知识产权代理有限公司
代理人：杨涛
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《水稻ARP基因功能鉴定及高粱转基因体系建立研究》

《水稻ARP基因功能鉴定及高粱转基因体系建立研究》一、引言水稻作为全球重要的粮食作物，其遗传育种和基因功能研究对于农业发展具有重大意义。

近年来，随着分子生物学技术的进步，基因功能鉴定和转基因技术已成为作物育种的重要手段。

本研究以水稻ARP基因功能鉴定和高粱转基因体系建立为研究重点，为水稻和高粱的遗传改良提供理论依据和技术支持。

二、材料与方法1. 材料（1）水稻和高粱的基因组DNA；（2）相关酶类、载体、试剂等；（3）转基因受体材料。

2. 方法（1）水稻ARP基因的克隆与序列分析；（2）利用生物信息学方法预测ARP基因的功能；（3）构建ARP基因的过表达和敲除载体；（4）利用农杆菌介导法将载体转入水稻和高粱中；（5）转基因植株的筛选与鉴定；（6）转基因植株的表型分析。

三、结果与分析1. 水稻ARP基因的克隆与序列分析通过PCR扩增和测序，成功克隆了水稻ARP基因，并进行了序列分析。

结果表明，ARP基因具有典型的开放阅读框，编码一个具有特定功能的蛋白质。

2. 生物信息学预测ARP基因的功能利用生物信息学方法对ARP基因进行预测，发现其编码的蛋白质具有与已知功能蛋白相似的结构域和保守的氨基酸序列，可能具有相似的功能。

此外，ARP基因的表达模式分析表明，其在特定组织中表达较高，可能参与植物的生长和发育过程。

3. 转基因体系的建立与转基因植株的筛选与鉴定（1）高粱转基因体系的建立：通过农杆菌介导法，成功将ARP基因的过表达和敲除载体转入高粱中，建立了高粱转基因体系。

（2）转基因植株的筛选与鉴定：通过对转基因植株进行PCR检测和RT-PCR分析，确认了外源基因的成功导入和表达。

同时，对转基因植株进行了表型分析，发现过表达ARP基因的转基因植株表现出较强的生长势和抗逆性。

4. ARP基因的功能鉴定通过对转基因植株进行表型分析和生理生化指标的测定，发现过表达ARP基因的转基因植株在生长速度、抗逆性等方面具有明显优势。

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆及序列分析

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆及序列分析王重;樊哲儒;张跃强;李剑峰;高新【摘要】Objective] To clone the phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) gene obtained from Zea mays and analyze it by bioinformatics. [ Method] Primarily, the cDNA clone was constructed by RT-PCR amplified with the gene specific primers, then positive clones were se-quenced and analyzed by bioinformatics.[ Result] The electrophoresis showed that the coding sequence( CDS) of PEPC gene in Zea mays was 2 913 bp and the polypeptide chains coded by PEPC included 926 amino acids, which were hydrophobic amino acids consists of-helix (61.44%), random coil (34.43%) and extended strand (4.12%), with located in the cytoplasm.There was no transmembrane domain. The 175-970 amino acid composition the functional domains of phosphoenolpyruvate carboxylase, in 173-184;597-609 bits had two phos-phoenolpyruvate carboxylase active site with pyruvate orthophosphate dikinase basing on amino acids sequences comparison.[ Conclusion] The PEPC gene in Zea mays has been obtained and the amino acids sequence coded by the gene was conserved and contained active catalyst central site of PEPC.%[目的]获得玉米的PEPC基因，并对其生物信息学进行分析。

甘蔗C_4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表达载体构建

甘蔗C_4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表达载体构建杨荣仲;张木清;陈如凯
【期刊名称】《甘蔗（福建）》
【年(卷),期】2002(9)3
【摘要】根据用于转化的甘蔗 C4Ppc基因的特点 ,分别构建了无启动子、35 S启动子、2 x35 S启动子的植物表达载体 p BIpepc、p L Apepc、p CBIpepc;用盐冻融法将其导入农杆菌 LBA4 40 4 ,可用于烟草、水稻、大豆、甘薯等 C3 作物遗传转化。

【总页数】10页(P9-18)
【关键词】甘蔗;C4磷酸烯醇式;丙酮酸羧化酶;基因植物;表达载体;构建;遗传转化【作者】杨荣仲;张木清;陈如凯
【作者单位】福建农林大学甘蔗综合研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S566.2
【相关文献】
1.花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建 [J], 潘昱名;刘风珍;万勇善;郑成超
2.玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建 [J], 曹路遥;周岩;魏琦超;陈燕绘;陈亚东;蔺一帆;田瑞婷
3.甘蔗C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表达载体构建 [J], 杨荣仲;张木清;陈
如凯
4.香格里拉水韭磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的克隆及其表达载体构建 [J], 鲁维维;刘星
5.香格里拉水韭磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的克隆及其表达载体构建 [J], 鲁维维;刘星
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广东深圳高级中学2019高三上年末试题-生物

广东深圳高级中学2019高三上年末试题-生物生物1.科研工作者对某种常见病进行调查，得到如下结果：①同一地区发病率因环境因素的巨大变化而出现明显变化②同卵双胞胎的发病情况高度一致③在某些种族中发病率高④不表现明显的孟德尔遗传方式⑤发病有家族聚集现象⑥迁徙人群与原住地人群的发病率存在差别。

由此推断该病最可能是A 、只由遗传物质改变引起的遗传病B 、只由环境因素引起的一种常见病C 、单基因和环境共同导致的遗传病D 、多基因和环境共同导致的遗传病2.在高光强、高温柔高氧分压的条件下,高粱由于含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其利用CO 2的能力远远高于水稻。

从高粱的基因组中分离出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因〔Ppc 基因〕，利用农杆菌介导的转化系统将其转入水稻体内，从而提高水稻的光合效率。

以下说法不正确的选项是A 、在此过程中会用到限制性核酸内切酶、DNA 连接酶和载体等工具B 、此技术与花药培养技术相结合，能够快速获得纯合子，缩短育种周期C 、Ppc 基因导入受精卵是此技术的关键，否那么不能达到该基因在各组织细胞都表达的目的D 、此项技术是否成功必须测定转基因植株与对比植株同化二氧化碳的速率3.以下对图中有关生物学意义描述正确的选项是A 、图1中假如横坐标表示氧气浓度，那么纵坐标能表示人成熟红细胞中钾离子的吸收量B 、图2中ab 段和bc 段都能代表一个细胞周期，因为所用时间相同C 、图3中曲线A 点时人的胰岛A 细胞分泌增强，胰岛B 细胞分泌随后增强D 、图4中B 点时害虫种群抗药性个体所占百分比小于A 点时的百分比4.据2017年9月《新安晚报》消息：上海科学家破解了神经元“沉默突触”沉默之谜。

此前发明，在脑内有一类突触只有突触结构而没有信息传递功能，被称为“沉默突触”。

请推测上海科学家对此所取得的研究成果可能是①突触小泡内没有细胞核②突触后膜缺乏相应的受体蛋白③突触前膜缺乏相应的受体蛋白④突触小泡不能释放相应的递质A 、①②B 、③④C 、①③D 、②④5、下图是高中生物有关实验过程，其中操作和表达正确的选项是 A 、甲图是用低倍显微镜观看到的图像，如要用高倍镜观看细胞有丝分裂期的细胞，应甲乙丙① ③②将装片适当向右移动B 、乙图是某生物小组的同学在2m ×2m 样方范围内进行的苦荬菜种群密度的调查，圆圈表示个体。

高考模拟题5

生物模拟题五
1．将下列装置放在光照充足、温度适宜的环境中，观察并分析实验现象能得出的结论是
A．小球藻产生 O2 和酵母菌产生 CO2 均在生物膜上进行
B．小球藻光合作用和呼吸作用的共同产物有 ATP、CO2 和 H2O
C．乙试管中小球藻与丙试管中小球藻的光合速率相同
D．实验后期甲瓶和丁瓶中的生物都只进行无氧呼吸
2．下图是两种细胞增殖方式染色体行为示意图，相关叙述不正确的是 A．甲种方式姐妹染色单体分开，使子细胞都含有
P1、P2、M1、M2 B．乙种方式 P1 和 M1、P2 和 M2 分离，子细胞具有不同组合的染色体 C．利用甲种方式繁殖后代，有利于生物遗传性状的稳定和物种的进化 D．繁殖过程中存在乙种方式的生物，有利于种群适应环境和发展进化
29．（16 分）（1）物质循环和能量流动稳态分解者（2）（2）分类计数
(3)不同浓度的 Cu（1 分）在小麦不同生长发育时期（1 分）对土壤线虫数量的影响 36 相同处
理在小麦不同生长发育时期对土壤线虫数量的影响不同 [ 幼苗期随 Cu 浓度增加土壤线虫数量
减少（1 分），拔节期和成熟期随 Cu 浓度增加土壤线虫数量先升后降（1 分）]
（4）获得表达 VP1 蛋白的番茄植株以后，需要进行免疫效力的测定。具体方法是：将转基因番茄
叶片提取液注射到豚鼠体内，每半个月注射一次，三次后检测豚鼠血液内产生的特异性抗体的数量。
为了使结果可信，应设两组对照，分别注射
和弱毒疫苗。
（5）口蹄疫疫苗注射到豚鼠体内后，首先由吞噬细胞进行处理和呈递，最终激活 B 细胞，使其大量
白脂雌×黄脂雄
F1
白脂雌：白脂雄＝１：１
雌雄随机交配
F2
幼兔饲喂含黄色素的食物

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