磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶检测试剂盒(PEP比色法)

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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)检测试剂盒(PEP比色法)简介：

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是C4植物和CAM植物固定CO2的关键酶，为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，在植物和细菌中广泛存在，在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。大肠杆菌中的酶分子量约36万的四聚体，可受很多因素的影响，例如可为乙酰辅酶A活化，可受天门冬氨酸抑制。此酶是变构酶，主要功能为供给三羧酸循环以草酰乙酸，另外也与C4植物光合二氧化碳固定反应(C4二羧酸循环)及景天科植物的苹果酸形成(景天酸代谢)等有关。

Leagene磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)检测试剂盒(PEP比色法)检测原理是利用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为一种的酶显色底物，在弱碱条件下，PEPC催化PEP，形成草酰乙酸(OAA)，OAA在MDH催化下被NADH还原为苹果酸(Mal)。在碱性条件下每吸收1分子CO2伴随1分子NADH氧化，通过分光光度比色法(分光光度计)测定处吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：

自备材料：

1、研钵或匀浆器

2、离心管或试管

3、低温离心机

4、恒温箱或水浴锅

5、比色杯编号

名称TE0453

50T

Storage

试剂(A): PEPC Lysis buffer 500ml 4℃避光试剂(B): PEPC Assay buffer40ml 4℃

试剂(C): PEP Solution 3.5ml -20℃

试剂(D): MDH Solution 3.5ml -20℃

试剂(E): NADH 2支-20℃

使用说明书1份

6、分光光度计

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品：

①植物样品：取植物组织清洗干净，切碎，植物组织：PEPC Lysis buffera按一定的比例，加入预冷的PEPC Lysis buffer，冰浴情况下充分匀浆或研磨。经4层纱布或滤纸过滤，留取滤液，离心，留取上清液即为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶粗提液。短期4℃保存，长期-20℃冻存待用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的检测。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PEPC Lysis buffer进行适当匀浆，离心，取上清液，冻存，用于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的检测。

④高活性样品：如果样品中含有较高活性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，可以使用PEPC Lysis buffer进行恰当的稀释。

2、配制NADH工作液：取出NADH，恢复至室温后溶解于ddH2O，混匀，预冷备用。

-20℃保存2月有效。注意：该NADH工作液为过量。

3、配制PEPC Assay buffer工作液：取出PEPC Assay buffer、PEP Solution、MDH

Solution、NADH工作液、ddH2O，恢复至室温，按PEPC Assay buffer：PEP Solution：MDH Solution：NADH工作液：ddH2O，混匀，即为PEPC Assay buffer工作液。

最好即配即用，预冷备用，保存1月有效。

4、PEPC加样：按照下表设置对照管(备选，一般可以不设对照管)、测定管，溶液应按照

顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。

加入物质(ml) 对照管(备选) 测定管

ddH2O 0.07 —

待测样品—0.07

PEPC Assay buffer工作液 1.96 1.96

5、PEPC测定：混匀，恒温孵，置于分光光度计中，比色杯光径，测定吸光度，记为A0。

加入PEPC启动剂，立即计时，每隔30s测定一次吸光度，其中至1min时处吸光度记为A1，记录其变化。

注意：该反应系统是利用速率变化，求得相应OD的变化，进而推算出NADH的消耗速率，再进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。因此加入PEPC启动剂立即计时很重要，每次检测指标不宜过多，否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。

计算：

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性：在碱性条件下，每吸收1分子CO2伴随1分子NADH氧化。

组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%

PEPC(μmol/ml·min)=ΔA×N×2.1×(106/6220)/0.07

式中：ΔA=A0−A1

N=酶液稀释倍数

6220=NADH的吸光系数

2.1=反应液的总体积(ml)

0.07=待测样品体积(ml)

注意事项：

1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，但应考虑根据酶标仪的最大检

测体积。

3、该反应系统是利用速率变化，求得相应OD的变化，进而推算出NADH的消耗速率，

再进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。因此加入PEPC启动剂立即计时很重要，每次检测指标不宜过多，否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。

4、所测样本的浓度过高，应用PEPC Lysis buffer稀释样品后重新测定。

5、待测样品中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性较低时，可适当延长孵育时间。

6、PEPC启动剂易挥发，应密闭保存。

7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效。