农杆菌转化法将拟南芥基因导入油菜

载体的构建
• 1. PCR产物的回收与测序
• PCR产物 琼脂糖凝胶电 回收 克隆载体
泳回收试剂盒 pMD19TVector
连接
DH5α感受 态细胞
转化
含有Isopropyl-β- D 挑选单克隆 thiogalactoside(IPTG)、Xgal和Amp的LB平板
鉴定
测序
2.拟南芥miR395d前体基因过表达载 体构建
BglⅡ和SpeⅠ 目的片段
转基因油菜 PCR检测
• 提取潮霉素抗性植株及阴性对照的DNA , 以 质粒DNA为阳性对照, 进行PCR扩增 ,扩增产 物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
• 抗性植株中, 有能扩增出与质粒DNA大小一 致850bp左右的条带 ,说明拟南芥 miR395d 前体基因已整合到油菜基因组中。
Leabharlann Baidu谢
目的基因的获取
• 模板DNA的提取 （CTAB法） 引物的设计
上游引物5′端 加BglⅡ酶切位 点,下游引物 5′端加入 SpeⅠ酶切位点 ，拟南芥DNA 为模板
PCR扩增
466 bp左右 的miR395d 前体基因
上游引物S1:5′-AGATCTATGTCACCCATCCTATCTT CCTCA-3; 下游引物S2:5′-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA-ACCTGTA-3′ 。
拟南芥 miR 395d前体基因过表达载体构建
• 重组 pMD19T质粒 双酶切 回收 插入表达载体pCAMBIA1304 PCR验证 得到条带（ 850bp） miR395d前 体基因已成功导入农杆菌,可用于油菜转化。
• 预期结果： • 油菜外植体经预培养、农杆菌侵染、共培 养、脱菌培养、生根培养等一系列过程后 部分长成了潮霉素抗性植株。
用农杆菌介导法将拟南芥miR395d 基因转入油菜中的方法研究
组员：
内容目录
一.目的基因的来源 二.转基因过程 模板DNA的提取 引物的设计 PCR扩增 目的基因的获取
连接 载体的构建 转化 检测 三.遗传转化 1.农杆菌培养 2.无菌苗培养 四.转化 五.检测
目的基因的来源
• 1.miRNA在调节植物对环境胁迫如干旱、盐 害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用 • 2.油菜与拟南芥同属于十字花科,亲缘关系 比较近,且miR395在各物种间序列保守。 • 3.采用PCR法从拟南芥中克隆到miR395d前 体基因。
• 双酶切
限制性内切酶 BglⅡ→pCAMBIA1304； SpeⅠ→pre-miR395d
凝胶电泳 T4DNA连接酶 16℃过夜
• 回收
连接
表达
载体（pCAMBIA1304- miR395d）
PCR和序列测 定
3. 根癌农杆菌介导法转化油菜
农杆菌的培养
含pre-miR395d过表达载体的农杆菌 (5 mL)LB+20 mg·L-1Rif+50 mg·L-1 Kan液体培养基 28 ℃振荡培养1d 40 mL新鲜的上 述液体培养基中振荡培养3 ～ 5 h 对数 生长期 离心弃上清 5倍体积的 MS液体培养基悬浮菌液备用
无菌苗的培养
油菜种子 70%乙醇表面消毒30 s 1 g·L-1 HgCl2 消毒5 min 冲洗 种子萌发(MS) 25 ℃光照培养 7d
转化
• 子叶和下胚轴 预培养基黑暗预培养 3d 浸入侵染液（子叶浸泡5 min, 下胚 轴浸泡30 s） MS固体培养基黑暗培养 2d 脱菌培养基6d 筛选培养 基 15 d 换1次培养基 约1 ～ 2 cm的绿芽切下转入壮苗培养基 分化芽苗长至3 ～ 5 cm时转入生根培养基(1 /2MS)中
4.转基因油菜PCR检测
• 油菜总DNA
CTAB法 对照
• PCR（850bp）
阳性：模板质粒pCAMBIA 1304-miR395d ; 阴性：未经转化的油菜基因组DNA 拟南芥 miR 395d。
• 上游引物S3:5′-TGTGATGGTCCGATTGAG-3′, • 下游引物S2:5′-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTAACCTGTA-3′