农杆菌转化法将拟南芥基因导入油菜
将目的基因导入植物细胞的方法
将目的基因导入植物细胞的方法随着生物技术的不断发展，基因编辑和转基因技术在农业领域中得到了广泛的应用。
将目的基因导入植物细胞，可以使植物获得更好的抗病性、耐旱性、耐盐性等性状，从而提高植物的产量和品质。
本文将介绍几种常见的将目的基因导入植物细胞的方法。
1. 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是将外源DNA导入植物细胞的一种常见方法。
农杆菌是一种土壤细菌，具有天然的基因转移能力。
它可以将Ti质粒（土壤杆菌肿瘤质粒）导入植物细胞，并在植物细胞中形成肿瘤。
利用这种特性，科学家可以将目的基因植入Ti质粒中，然后通过农杆菌介导的转化将其导入植物细胞中。
这种方法适用于多种植物，包括拟南芥、玉米、水稻等。
2. 基因枪法基因枪法是将外源DNA通过压缩气体或加速粒子的方式直接送入植物细胞的一种方法。
这种方法不需要农杆菌或其他转化载体的介入，因此可以避免由于介导体的限制而导致的转化效率低下的问题。
基因枪法可以用于多种植物，包括玉米、大豆、小麦等。
但是，由于该方法需要使用高压气体或加速粒子，因此设备成本较高，操作难度较大。
3. 电穿孔法电穿孔法是将外源DNA通过电场脉冲的方式导入植物细胞的一种方法。
在这种方法中，植物细胞被置于含有外源DNA的缓冲液中，并受到电场脉冲的作用，使得细胞膜发生短暂的孔隙，外源DNA通过这些孔隙进入细胞质。
该方法适用于多种植物，包括拟南芥、玉米、水稻等。
电穿孔法具有转化效率高、设备成本低、易于操作等优点，因此被广泛应用于植物基因转化中。
4. 直接DNA转化法直接DNA转化法是将外源DNA与植物细胞一起置于含有多种物质的缓冲液中，通过一系列的化学反应和电化学反应使外源DNA进入植物细胞的一种方法。
该方法适用于多种植物，包括拟南芥、玉米、水稻等。
直接DNA转化法具有操作简单、无需特殊设备等优点，但转化效率相对较低。
总之，将目的基因导入植物细胞是一项重要的技术，可以为农业生产提供更多的选择。
不同的转化方法各有优缺点，选择适合的方法需要考虑多种因素，包括植物种类、实验目的、设备和技术条件等。
农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究初报
农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究初报近年来，随着转基因技术的发展，农业生产力增加的问题也越来越受到重视。
然而，研究人员发现，目前主要的转基因技术都有一定的局限性，它们不能解决农作物生长发育、抵抗病虫害以及适应新的环境的问题。
因此，研究人员正在努力开发新的转基因技术来解决这些问题。
一种新的转基因技术是农杆菌介导法，它可以有效地将植物所需的基因移植到另一个基因组中。
最近，国内研究者在探究农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究初报上取得了积极的结果。
本文将概述这一研究内容，并就其对农业生产的意义进行分析。
农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究内容FPF1是绿植基因家族成员，可以在多种生理环境中调节花色、光合作用和抵抗胁迫，从而提高植物的生产效率。
本研究利用农杆菌介导法将fpf1基因插入油菜基因组中，并通过实验发现fpf1基因可以有效地抑制油菜植株的叶绿素含量，提高植株的耐旱性，明显提高植株的生长速度和抗逆性。
以上实验结果表明，fpf1基因可以有效地提高油菜的种植效率，使油菜更快、更有效地完成其生长发育过程，从而为油菜的种植奠定良好的基础。
关于农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究的意义利用农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜，不仅可以提高油菜的长势和抵抗性，而且还可以提高油菜的种植效率。
据估计，这将有助于提高中国油菜的种植面积，从而提高中国油菜的种植效率。
同时，把fpf1基因植入油菜也有助于提高植物抗病虫害能力，从而保护种子作物免受病虫害的侵袭，同时减少农药的使用，从而改善农业的环境质量。
结论农杆菌介导法将fpf1基因导入油菜的研究为转基因技术的发展和应用提供了一个新的路径，具有重要的实用价值和推动意义。
通过这项技术，可以在油菜中提高抗病虫害能力，增加农作物的生长速度和抗逆性，提高农作物的生产效率，改善农业的环境质量，使更多的农产品获得良好的品质。
有关转基因技术的研究仍有很多问题需要解决，因此未来的研究需要加强，以期在更多的农作物品种上取得成功。
eha105 拟南芥原理
EHA105 拟南芥原理详解拟南芥简介拟南芥（学名：Arabidopsis thaliana）是一种小型的模式植物，属于十字花科，是研究植物生物学和遗传学的重要模式生物。
拟南芥的基因组相对简单，具有短的生命周期和快速的生长速度，使其成为研究植物基因功能和表达调控的理想模型。
拟南芥转化技术拟南芥转化技术是将外源基因导入拟南芥植株中，使其表达特定的基因或蛋白质。
其中，EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，通过农杆菌介导的转化方法将目标基因导入拟南芥。
拟南芥转化技术的基本原理如下：1.农杆菌介导的转化：农杆菌是一种常见的土壤细菌，具有天然的遗传转化能力。
利用农杆菌的特性，可以将目标基因导入拟南芥细胞中。
转化过程中，农杆菌通过寄生在植物细胞上的线粒体和质体，将外源基因导入植物细胞的染色体中。
2.构建转化载体：为了将目标基因导入拟南芥细胞中，需要构建一个转化载体，其中包含了目标基因的DNA序列。
转化载体一般由多个功能模块组成，包括选择标记基因、启动子、终止子等。
选择标记基因可以在转化后的拟南芥中表达，用于筛选转化成功的植株。
3.转化条件优化：转化过程中，需要优化一系列的条件，以提高转化效率。
包括农杆菌的培养条件、拟南芥的生长条件、转化载体的浓度和转化时间等。
通过优化这些条件，可以提高转化效率，增加转化成功的概率。
4.筛选转化植株：转化后的拟南芥植株需要经过筛选，以确定哪些植株成功地导入了目标基因。
常用的筛选方法是通过选择标记基因的表达来鉴定转化植株。
选择标记基因一般与目标基因共同构建在转化载体中，通过选择标记基因的表达来判断转化是否成功。
5.遗传稳定性验证：转化后的拟南芥植株需要进一步验证其遗传稳定性。
通过后代分析，确定转化基因是否稳定地遗传给下一代。
通常，通过PCR、Southern blot等方法来检测目标基因的存在，并验证其在后代中的稳定性。
EHA105的特点和应用EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，具有以下特点和应用：1.高转化效率：EHA105具有较高的转化效率，可以在较短的时间内实现大量的拟南芥转化。
农杆菌介导的高赖氨酸基因在油菜中的转化的开题报告
农杆菌介导的高赖氨酸基因在油菜中的转化的开题报告
作为一种重要的油料作物，油菜具有广泛的应用前景。
然而，传统育种方法耗时耗力，效率低下，而利用遗传工程手段进行改良则成为了优选的选择。
农杆菌介导的基因转
化技术作为一种可重复、可控、可靠的遗传工程手段在农作物改良中得到了广泛应用。
本研究旨在利用农杆菌介导的高赖氨酸基因在油菜中的转化，以提高油菜的营养价值
和抗逆能力。
具体研究内容包括以下几个方面：
1.高赖氨酸基因的克隆和构建载体：通过NCBI数据库检索高赖氨酸合成相关的基因序列，利用PCR技术将其扩增出来，然后将其插入到适合农杆菌介导转化的植物表达载
体中，最终构建出高赖氨酸基因携带的载体。
2.农杆菌介导转化油菜根垂直培养法：使用含有高赖氨酸基因载体的农杆菌进行转化，在油菜种子上进行感染，然后放入含有适宜激素和抗生素的培养基中，进行繁殖，得
到转化后的油菜幼苗。
3.转化效率的评价：采用PCR技术或蛋白质表达分析等方法，对转化后的油菜幼苗进
行基因水平和表型水平的鉴定和评价，以此来评估农杆菌介导转化油菜的效率和稳定性。
4.抗逆能力和营养价值的测定：对转化后的油菜幼苗进行逆境胁迫试验和化学成分测
定等实验，以验证高赖氨酸基因的表达是否能够提高油菜的抗逆能力和营养价值。
通过以上研究，本项目旨在验证高赖氨酸基因在油菜中的转化效果和提高油菜的营养
价值和抗逆能力。
这对于油菜品种的改良以及开发更为优质的油菜产品具有重要意义。
花分生组织决定基因APETALA1转化油菜
（ｎｔｕｅｏ ｇｏｂ ｔ ｈ ｏ ｇ ， ｉｎｓ ｃｄｍ ‘ｇｉｕ ｕａ ｃ ｎｅ， ａ ｎ １０ ４ ｈｎ ） Ｉｓｔｔ ｆＡ ｒ—ｉ ｅ ｎｌ ｙ Ｊａ ｇｕＡａ ｅ ｙｏ Ａ ｒ ｌ ｒｌ ｉ ｃｓＮ ｇ２０ １ ，Ｃ ｉ ｉ ｏｃ ｏ ｊ ｃｔ Ｓｅ ａ
Ａ ｓ ａ ｔ Ｔ ｅ Ｐ Ｔ Ｌ １（ Ｐ ）ｇｎ ｆ ｒｂ ｏｓ ａｉｎ ｐ ｃ ｅ ｆ ｗ ｒ ｒ ｔｍ ｉｅ ｔｙａ ｄ ｉ ｒ ｕｒ ｒ ｂ ｔ ｃ ： ｈ Ｅ Ａ Ａ Ａ １ ｅ ｅｏ Ａ ａ ｉ ｐｉ ｔ ｌ ａ ｓ ｅｉ ｓ ｏ ｅ ｍｅｉ ｅ ｎｉ ｎ ｑ ｉ ｄｆ ｒ Ａ ｄ ｓｈ ａ ｉ ｌ ｆ ｓ ｄ ｔ ｓｅ ｅ ｏ
ｗｔ Ａ １ｗ ｓｎｒｄ ｃｄｉ ｏ ｈ ｅｏ ｅｏ Ｂａｓ ａｎｐ ｓ ｙ ｇｏａｔ ｉｍ ｔｍｆｃ ｎ ｄ ｔ ａｓ ｒ ｔ ｎ Ｔ ｅＡ １ ｉ Ｐ ａ ｉｔ ｕ ｅ ｔ ｔｅｇｎｍ ｆ ｒｓｃ ａ ｕ ｂ ｒｂｃ ｒ ｅｚｉ ｓ ｈ ｏ ｎ ｉ Ａ ｅ ｕ ｕ ｉ ｅ ｍｅｉ ｅ ｔ ｎｆ ｍａ ｏ ． ｈ Ｐ ａｄｒ ｏ ｉ
维普资讯
江 苏农 业 学报 （ ｉｎｓ ．ｆＡ ｒＳｉ）２ ０ ，３ ６ ：６ ５ ７ Ｊ ｇｕ， ｏ ｇ． ｃ ，０ ７ ２ （ ） ５４～ ６ ａ ．
花 分 生 组 织 决定 基 因 Ａ 船
（ 江苏省农业科学 院农业生物技术研究所 ， 江苏 南京 ２０ １ ） １０ ４
拟南芥基因的克隆和在油菜花中的表达
m iR395d前体基因的 前体基因的PCR扩增结果 前体基因的 扩增结果
3. PCR产物的回收与测序 产物的回收与测序
PCR 产 物经 琼 脂糖凝 胶电泳回收试剂盒回 收 后 与 克 隆 载 体 pMD19 TVector连接, 转化DH5α感受态细胞, 在含有Isop ropyl2β2D 2thiogalactoside( IPT G) 、 X2gal 和 Amp 的 LB平板上挑选单克隆, 单克隆经鉴定后送金 思特生物公司测序。
1. 拟南芥 拟南芥DNA的提取 的提取
法从幼嫩的拟南芥叶片中提取DNA。 用CTAB法从幼嫩的拟南芥叶片中提取 法从幼嫩的拟南芥叶片中提取 。
拟南芥m 拟南芥 iR395d前体茎环发夹图 前体茎环发夹图
2.拟南芥 iR395d前体基因的克隆 拟南芥m 拟南芥 前体基因的克隆
参照拟南芥miR395d前体基因序列设计引物, 为了便于 miR395d过表达载体的构建, 在上游引物的5′端加入了B glⅡ酶切位点, 下游引物5′端加入了SpeⅠ酶切位点, 以拟 南芥DNA为模板, PCR扩增466 bp左右的miR395d前体 基因。引物序列如下: 上游引物S1: 上游引物S1: 5’AGATCTATGTCACCCATCCTATCTTCCTCA23′ 下游引物S2: 下游引物 5′ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA2ACCTGTA23′ PCR反应体系 10 ×缓冲液(含Mg2 + ) 5µL, 10 mmol·L - 1 反应体系: 反应体系 dNTP 2µL, 10µmol·L - 1引物各2 µL, cDNA 第1 链模板2 µL, Taq酶( 5 U ·µL - 1 ) 1 µL, ddH2O 38 µL。扩增条件如 下:94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个 循环; 72 ℃ 7 min。
油菜植株的农杆菌介导转化及其抗虫性研究
导人农作物 ． 可提高转基 因植物对害虫的抗性 。因此转 基 因技 术在农业上 的应 用前景 十分广阔 。虽然世界上
转基 因油菜的种植面积 已高达 ３ ０万公顷 ，但 直到 目 ６ 前国外 尚无真 正具有应 用价 值的抗 虫转 基因油 菜 ， 国
内也仅仅是在最近 几年才成功将苏 云金杆 菌杀虫晶体
摘 要： 采用 农杆 菌介 导法把 质粒 ｐ ｌ０ 一 ｈ－ ｍ （ 虫 、 病 ） Ｂ ｌ１Ｃ ￣Ｂ ｋ 抗 抗 导入 油菜 ， 得抗 卡那 霉 素植 株 １３ 。经 Ｐ Ｒ 检测 ， 取 ８棵 Ｃ 在 １７ 转 化植株 中检测 到待 检 成分 的存 在 ， 化率 为 ５．％。 活虫 喂养 试验 表 明 ， ０株 转 ８ ５ 大部分 转化植 株 对 油菜 菜粉 蝶具 有 较强 抗性； 同对 照植株 比较 ， 虫存 活率 明显减 少 ， 活幼 虫 的发 育也 受到 不 同程度 的影 响。 同 时 Ｅ ＩＡ检 测 的结 果也 证 明 目 幼 存 ＬＳ
体。
１ ． 根瘤农 杆菌培养及 油菜外植体 转化 ．２ ２
挑取所 用
农杆菌 质粒 单菌 落 ， 接种 在 Ｐ Ｂ培 养基 中 （８ ，４ Ｅ ２ ℃）２ ３ ６小时后 ， 离心收 集细菌 ， 并将细 菌重新悬浮 于 ＭＳ培 养基中 ２ ℃继续培养 ６ ８小时 ．使细菌活化并逐 步适 ８ 应转化时 的培养基条件 。 将制备好的 已经预培养 ２天 （ Ｍ 在 Ｓ培养基上 ） 的 外植体浸泡在 农杆菌液 （ 菌液 Ｄ ＝ ． Ｄ ｏ ５或 ０１ 中 ５ ８ ０ ．） — 分钟 ， 用滤纸吸干外植体 表面 上附着 的农杆 菌 ． 放置于 ＭＳ培养 基上共 培养 ２天 ，然 后转 移到含 有卡 那霉素 （５ ｇＬ 和羧 卞青霉 素 （０ ｍ ／） Ｍ ２ｍ ／） ５ ０ ｇＬ 的 Ｓ培养基 上继续
农杆菌介导法将fad2基因的ihpRNA表达框转入甘蓝型油菜
序列表达框的特定条带 。初步证 明目的基 因序列 已经整合到 了油 菜的基因组 中。
关键词 ： 转基 因油 菜 ；农杆菌 ；油酸脱饱 和酶基 因 ；ｉｐ Ｎ ｈ Ｒ Ａ表达框
中图 分 类 号 ： Ｓ６ ．０ ．３ ５５ ４ ３５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： １０ ４４ ０ ２０ ） ２０ ３ －６ ０ ０ ４ （ ０ ８ ０ －１００
Ｔ ａ ｓ ｒｉｇ ａ ｎ ｅｔｄ Ｒｅ ｅ ｔＥ ｐ ｅｓ ｎ Ｃ ｓｅｔ ｆ ａ ２ Ｇｅ ｅ ｉｔ ｒ ｎｆ ｒ ｎ Ｉｖ ｒｅ ｐ ａ ｘ ｒ ｓｉ ａｓｔ ｏ ｄ ｎ ｎｏ ｅ ｎ ｏ ｅ ｆ Ｂ ａｓ ａ ｎｐ ｓｂ ｇ ｏ ａ ｔｒ ｍ ｍｅａ ｉｎ ｒｓｉ ａ ｕ ｙＡ ｒｂ ｃ ｉ ｔ ｆ ｃ ｓ ｃ ｅｕ ｕ ｅ
（ 江苏省农业科学院经济作物研究所 ， 江苏 南京 ２ ０ １ ） １０ ４
摘要 ： 为获得转基 因高油酸油菜新种质 ， 以甘蓝 型油菜 品种 宁油 １ ２号带 柄子 叶为转基 因受体 ， 通过 与含有 油酸脱饱 和酶基因 （ ２ ｈ Ｒ Ａ表达载体 （ Ｃ ＦＲ ｏ ） 丘ｄ ）ｉｐ Ｎ ｐ Ｎ Ｉ ｎｓ 的农 杆菌 Ｌ Ａ ４ ４共培养 ， Ｂ ４０ 将油菜 丘ｄ ２基因 的反 向重 复 序列表达框转入宁油 １ ， ２号 获得 转基 因植 株。结果表 明 ： 日龄 的带柄子 叶在含有 ２ ４Ｄ １ｍ ／ ４ ，． ｇ Ｌ的共 培养基 中预
利用农杆菌介导法将γ-生育酚甲基转移酶基因导入油菜的研究
（ ． ｏｔ ｃｏａ Ｓ ｉ ｔｉ Ｒ ｓａｃ ｔ ｉ ｆ ａ ｓ ａｈ ｎ ｄ ｓｉｌ ｏ ｔ，Ｂ ｉｎ ｒｎ ｈ Ｂ ｉｎ ０ １ １ １Ｐ ｓ ｏ ｔ ｌ ｃ ｎｉｃ ｅｅｒｈＳａ ｏ ｏ ｎｕＹ ｓｅｇＩ ｕｔａ Ｃ 、Ｌｄ ｅ ｉｇＢａ ｃ ， ｅ ｉｇ１０ ０ ， ｄ ｒ ｅ ｆ ｔｎ Ｇ ｎ ｒ ｊ ｊ
Ｃ ｉａ ２ Ｎ ｒ ｗ ｓ Ｉｓ ｔｔ ｏ ｌｅｕＢｏ ｇ ， ｈｎｓ ｃｄ ｍｙｏ ｃ ｎｅ ；Ｘｎｎ ０ ８ ｉ ｈｉ Ｃ ｉａ ｈｎ ； ， ｏ ｈ ｅｔ ｎｔｕｅ ｆ ａ ａ ｉｏｙ Ｃ ｉｅｅＡ ａ ｅ ｆ ｉ ｃｓ ｉｉ ８ ０ ０ ，Ｑｎ ａ， ｈ ； ｔ ｉ Ｐｔ ｌ Ｓｅ ｇ １ ｇ ｎ ３ Ａ ｒｎ ｍ ｏｌ ｅ Ｘｎｉｎ ｇｉ ｌ ｒ ｎｖｒ ｔ， ｒｍｑ ８０ ５ Ｘｎｉｎ ， ｈｎ ． ｇｏｏ ｙＣ ｌｇ ， ｉｊ ｇＡ ｒ ｕｔ ａ Ｕ ｉ ｓｙ Ｕ ｕ ｉ ３ ０ ２， ｉ ａ ｇ Ｃ ｉａ） ｅ ａ ｃ ｕｌ ｅｉ ｊ
拟南芥m iR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的 转化
引言
• miRNAs是一类内生、非编码蛋白长度约为21-24个核苷酸的单链小分子RNA，在生物体内起 着基因转录后的调控作用。 • 成熟的miRNA先于一种叫RISC的复合物接合， 引起靶mRNA的降解；而当mRNA与靶mRNA不 完全互补时，mRNA则通过与对应的靶mRNA的 3’端非翻译区（3’UTR）结合阻止其转录后 的翻译。 • 植物中的miRNA与其靶mRNA具有高度的碱基 互补性，因而植物miRNA可能更像sRNA的作用 方式对靶基因进行降解。
材料与方法
农杆菌对外植体的侵染与共培养:
将含pre-miR395d过表达载体的农杆菌接种于LB + 20 mg ／ L Rif+ 50mg／ L Kan液体培养基中( 5 mL), 28 。Ｃ 振 荡培养过夜, 再转入40 mL新鲜的上述液体培养 基中振荡培养3~ 5 h, 当菌液处于对数生长期(D 600为0． 3~ 0．4) 时6 000 r／ m in离心5 m in, 弃上清液, 加入5倍体积的MS液体培养基悬浮菌液备用。 将预培养3 d的外植体浸入侵染液中, 子叶 浸泡5m in, 下胚轴浸泡30 s, 用滤纸吸去多余液体, 紧密排 列在MS固体培养基中, 黑暗培养2 d。
过表达载体构建的原理和步骤：
原理：将外源基因片段与载体连接（载体通常选用质粒或者 噬菌体或其他病毒），将重组的载体转染受体细胞，使之 整合入宿主基因组或者在稳定存在于胞质内，是宿主细胞 能够表达载体上的外源基因，从而获得新性状或者新产物 。 步骤： 1）从基因组或cDNA上克隆得到完整的目的基因（至少包 含CDS区），通常在两端加粘性末端或重组位点； 2）选择合适的表达载体（真核、原核、噬菌体、某些病毒 、标记等）； 3）将克隆得到的目的基因与载体连接； 4）将重组载体通过某种手段转入受体，即宿主中（化学转 染、脂质体、电转、显微操作等）； 5）筛选阳性的宿主细胞并扩繁。
根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥
维普资讯
安徽农 业科 学 ． ｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ｒ Ｓｉ２ Ａ ｈ ｉ ｇｉ ｃ．０ ８３ （４ ：７５ ５７ ｏ ．
责 任编 辑 王 森 责任校 对 况玲玲
根癌 农 杆 菌 介 导油 菜 Ｃ Ｆ１ 因转化 拟 南 芥 Ｂ 基
Ｄ Ａ ｎ ＿ｎ ｉ （ｏｅｅ ｆ ｉ ｃ ｎｅＨ ｎｎ ｏｍ ｌ ｎｖｒ ｔ Ｘｎｉｎ， ｅａ ５０ ７ Ｕ ＮＨｏ ｇｙ ｇ ｔ ｉ ｅ ａ Ｃ ｌｇ ｆ Ｓｉ ｃ， ｅａ ｒ ａＵ ｉｅ ｉ ， ｉｘ ｇＨ ｎｎ ３０） ｌ ｏＬ ｅ ｅ Ｎ ｓｙ ａ ４
Ａｂ ｔａ ｔ ［ ｊｃｉｅ ｈ ｕｐ ｓ ａ ｏｓｐ ｌ ｈ ｏｅｉａ ａｉ ｆｒａ ｐ￣ｎ ｓｒ ｃ Ｏｂｅｔ ］Ｔ ｅｐ ｒｏｅｗ ｓｔ ｕ ｐｙｔｅ ｒｔ ｌｂ ｓｓ ｏ ｐ ｌ ｇ∞ Ｆｌｇｎ ｒｍ ａ ｅｏ ｈ ｅ ｅｉ ｉ ｐ ｏｅ ｎ ｆｃｏ ｖ ｃ ｅ ｅｆ ｒｐ ｎ ｔｅｇ ｎｔ ｍ ｒｖ ｍｅ ｔ ｒｐ ｏ ｃ ｏ ｒｓ ｔ ｃ ．『 ｔｏ ］ Ｂ ｌ ｅ ｅ ｒ１ ｒｐ ａ ｔ ｎｆ ｍ ｄｉ ｏ ｒ ｉ ｐ ｉ ｔ ａ ａ ｙ ｇｏａ ｔ ｉ ｍ ｆ ｅ ｎ － ｅ ｉ ｅ ｅ ｏ ｒ ｎ ｅｉ ａ ｅ Ｍｅ ｄ Ｃ Ｆ ｎ ｏｑ ａ ｅ ｓｒ ｓ ｒ ｅ ｔ Ａ ａ ｄ ｓ ｉ ｒ ｅ ｒ ｍ ｔ ｅ ｉ ｓ ｄａ ｄｍ ｔ ｄ ｏ ｃｅ ｓｎ ｈ ｇ ｆ１ ｗ ａ ｏ ｎ ｂ ｏ ｓｈ ｎ ｂ Ａ ｂ ｅｕ ｕ ａ ｅ ｍ ｔ ｈ ｔｓ ｅ ｉ ａ ｓｅ ｉ ｐａ ｔ ｗ ｔ ｅｉ ａ ｃ ｎ ｏ ｄ ｃ Ｐ Ｒ ｅｅｔ ｎａ ｄＧ ｔｉｉｇ 『 ｓ ｌ ｏ ａｅ ｉ ｉ ｔ ｉｎ ｅｄｉｇ ｉ ｏ ｔ ｔ ｔ ｎｇ ｎｃ ｌｎｓ ｉ ｒｓ ｔｎ ｅａ ｄｃｎ ｕ ｔ Ｃ ｄｔｃ ｏ ｎ ＵＳｓ ｎｎ ． Ｒｅｕｔ ｍｐ ｒｄｗ ｔ ｗ ｌ Ａ． ｈ ａ ａｓｅｌ ｓｗｔ ｕ ｓｒ ｈ ｓ ｉ ａ ］Ｃ ｈ ｄ ｎ ｈ
农杆菌介导的油菜脂肪酸调控基因工程研究
有必要在潮霉素对油菜子叶柄再生能力的影响方面 进行研究。 切取萌发 4 ~ 5 天的甘蓝型油菜 H165 无菌苗子 叶柄用做试验材料。以文献中的潮霉素筛选浓度为 参考， 分别配制了两组分化培养基， 在第一组中附加 浓度为 0mg / L，10mg / L，20mg / L，30mg / L，40mg / L， 在第二组中附加浓度为 0mg / L， 50mg / L 的潮霉素； 0.5mg / L，1.0mg / L，1.5mg / L，2.0mg / L，2.5mg / L， 3.0mg / L， 3.5mg / L， 4.0mg / L， 4.5mg / L， 5.0mg / L 的 潮霉素。将子叶柄插入以上培养基， 25 ~ 28C ， 121 光照 / 121 黑暗培养。观察再生芽的产生及子叶柄 的变化情况。 1 . 2 . 2 农杆菌介导的油菜的遗传转化 将一 含 有 表 达 载 体 的 农 杆 菌 单 菌 落 接 入 含 25mg / L Kan、 20mg / L Rif、 20mg / L Str 的 YEP 培养基， 28C ， 250r / min 摇菌 201 左右。然后用 MS 液体培养 基将菌液稀释 5 ~ 10 倍， 切取油菜子叶柄放入菌液 中浸泡 5 ~ 10min 后， 再将子叶柄上多余菌液用滤纸 吸干放于分化培养基上暗培养 1 ~ 2 天， 待有明显的 菌斑出现时将其转入筛选培养基， 25 ~ 28C ， 121 光 照 / 121 黑 暗 培 养。先 将 子 叶 柄 放 入 含 有 3.0mg / L 潮霉素的筛选培养基上培养两个星期左右， 待绿色 再生芽长出后， 将其转入含有 5 . 0mg / L 潮霉素的筛 选培养基上继续筛选 1 个月， 再生苗长至 3 ~ 4cm 时， 即可转入生根培养基上诱导生根， 待根系发育茁 壮再将其移入花盆。 1 . 2 . 3 油菜再生苗的田间抗生素涂抹筛选 将花盆中生长旺盛的油菜再生苗， 移栽至本所 农场试验田， 为减少因潮霉素筛选浓度较低而造成 的 “逃逸” 现象， 当再生苗移栽至试验田后又进行了 潮霉素的叶片涂抹实验。 首先确定涂抹叶片所用抗生素溶液的合适浓 度： 选取高度约为 15cm 的对照植株 （非转基因油菜 苗） 健壮的叶片 1 ~ 2 片， 以配制的潮霉素梯度浓度 液 （200mg / L，300mg / L，400mg / L，500mg / L，600mg / 涂抹其上， L，700mg / L，800mg / L） 2 ~ 3 天后观察结 果， 选择使叶片产生敏感反应的潮霉素溶液， 进行转 基因油菜的再次筛选实验。 转基因植株的抗生素涂抹筛选实验： 选取转化 的油菜再生苗健壮的叶片， 涂抹浓度合适的潮霉素 溶液， 2 ~ 3 天后观察结果； 5 ~ 7 天后重复一遍涂抹 实验， 将产生敏感反应的植株弃去。 1 . 2 . 4 转基因油菜的分子生物学检测 （1） 转基因油菜的 PCR 检测 — 2 —
农杆菌介导油菜转化实验
农杆菌介导的油菜遗传转化操作流程一、所需试剂母液配制方法1. MS母液配制方法见小孢子培养部分。
2. 6-BA（6-苄基嘌呤）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 6-BA用微量HCl溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
3. NAA（α-萘乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g NAA用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
4. 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 2,4-D用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
5. AgNO3：称取0.5 g AgNO3溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤。
6. AS（乙酰丁香酮）：溶解于DMSO（二甲基亚砜），母液浓度为100 mM，0.22 μm有机系滤膜过滤，分装成小份保存。
7. Kan（卡那霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
8. Carb（羧苄青霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
9. Cef（头孢霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
二、操作流程1. 无菌受体材料的准备选取饱满、干净的油菜种子用75%乙醇浸泡1 min，然后在0.1%升汞中灭菌10~15 min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余的水分，接种于1/2 MS（添加10 g/L 蔗糖，0.7 % 琼脂，pH 5.8）培养基上，25~28℃下暗培养，待种子萌发再移至光下培养，光照16 h/d，强度2000 lx左右。
2. 受体材料的预处理取4~6 d的无菌苗子叶或下胚轴作为转化受体。
用解剖刀切下完整的子叶（带1~2 mm子叶柄）或下胚轴（5~10 mm），将切下的外植体置于预培养基（MS +30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼脂 + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D，pH 5.8）上进行预培养2~3 d，材料切口处刚开始膨大时即可进行接种浸染。
拟南芥——精选推荐
拟南芥⽤农杆菌介导法将拟南芥miR395d基因转⼊油菜中的⽅法研究⽬的基因的来源⽬前由于油菜的核酸序列库相对较⼩,通过⽣物信息学分析尚未在油菜中找到miR395前体序列,⽽油菜与拟南芥同属于⼗字花科,亲缘关系⽐较近,且miR395在各物种间序列保守,因此为了进⼀步研究miR 395对油菜中sulfate trans porter 2; 1和ATP硫酸化酶的作⽤机制, 提⾼油菜在缺硫等逆境中的适应性,本研究采⽤PCR⽅法从拟南芥中克隆到了miR395d前体基因。
⽬的基因的研究近况MicroRNAs(miRNAs)是⼀类内⽣、⾮编码蛋⽩长度约为21～24个核苷酸的单链⼩分⼦RNA在⽣物体内起着基因转录后的调控作⽤作为重要的调节分⼦,miRNA参与⽣命过程中⼀系列的重要进程, 包括⽣长发育、信号转导、病毒防御、造⾎过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发⽣等也有⼀些研究报道指出,miRNA在调节植物对环境胁迫如⼲旱、盐害和养分胁迫反应等⽅⾯起着重要的作⽤。
⽬的基因作⽤机理⽬前在拟南芥中已有研究证实,miR39与硫同化途径中的第1个关键酶ATP硫酸化酶mRNA (APS1、APS3、APS4)存在互补序列。
经初步Northern杂交分析显, 缺硫植株中的miR395被诱导表达, ⽽APS的积累量明显减少, 表明拟南芥miR395在缺硫条件下参与对其靶基因APS1的负调控。
此外, 5′RACE结果显⽰, 编码拟南芥的⼀个低亲和硫转运体sulfate trans porter 2; 1 ( AST68)的mRNA 也是miR39的⼀个靶基因, 说明miR395在植物硫同化和转运途径中可能起到了⾮常重要的调节作⽤。
实验意义油菜作为⼀种重要的油料和经济作物, 在硫的吸收、转运及代谢中同样需要硫转运体和ATP 硫酸化酶的协助为研究miR395对油菜中sulfate trans porter 2;1和ATP硫酸化酶的作⽤机制, 提⾼油菜在缺硫等逆境中的适应性, 采⽤PCR⽅法从拟南芥中克隆到了miR395d前体基因, 并构建过表达载体, 通过采⽤根癌农杆菌介导法将miR395d前体基因导⼊⽢蓝型油菜特选号中, ⽬前已获得了转基因植株。
将基因导入植物细胞的方法
将基因导入植物细胞的方法
将基因导入植物细胞主要有以下几种方法：
1. 农杆菌转化法（Agrobacterium-mediated transformation）：这是一种常用的植物基因转化技术。
首先，将目标基因通过重组DNA技术导入到农杆菌的转化质粒中，并将转化质粒引入农杆菌细胞中。
然后，利用农杆菌的自然感染能力，将转化质粒中的目标基因转移到植物细胞中。
最后，通过适当的选择压力来筛选出含有目标基因的转化植物细胞。
2. 生物颗粒枪法（Biolistic particle bombardment）：这是一种将基因导入植物细胞的物理方法。
将目标基因包裹在微小金属颗粒或微小DNA颗粒上，并将这些颗粒射击到植物细胞中。
这些颗粒能够穿透植物细胞壁和细胞膜，并将目标基因导入植物细胞核。
最后，通过适当的选择压力来筛选出含有目标基因的转化植物细胞。
3. DNA化学转化法（Chemical transformation of DNA）：这是一种利用化学物质将目标基因导入植物细胞的方法。
首先，将目标基因与转化载体进行连接，并将连接后的DNA分子与一些化学物质混合。
这些化学物质能够破坏植物细胞壁和细胞膜的完整性，并促使DNA分子进入细胞。
最后，通过适当的选择压力来筛选出含有目标基因的转化植物细胞。
这些方法都可以在实验室中进行，并且在不同的植物种类中都有应用。
不同的方法适用于不同的植物种类和目标基因，选择合适的方法可以提高基因导入的效率。
拟南芥miR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化
第２期张芸，等：拟南芥ｒｎｉＲ３９５ｄ基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化２７脱菌培养和筛选培养：将共培养２ｄ的子叶和下胚轴转移至脱菌培养基（ＭＳ＋２ｍｇ·Ｌ～６一ＢＡ＋０．１ｍｇ·Ｌ。
１ＮＡＡ＋６ｍｇ·Ｌ～ＡｇＮ０３＋５０ｍｇ·Ｌ～Ｔｉｍｅｎｔｉｎ，ｐＨ６．２）中，６ｄ后转入筛选培养基（ＭＳ＋２ｍｇ·Ｌ一１６一ＢＡ＋Ｏ．１ｍｇ·Ｌ一１ＮＡＡ＋６ｍｇ·Ｌ。
１ＡｇＮ０３＋５０ｍｇ·Ｌ一１Ｔｉｍｅｎｔｉｎ＋２０ｍｇ‘Ｌ一１Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（潮霉素），ｐＨ６．２）中，１５ｄ更换１次培养基。
将分化约１～２ｅｍ的绿芽切下转入壮苗培养基（ＭＳ＋２ｍｇ·Ｌ一１６ＢＡ＋０．１ｍｇ·Ｌ一１ＮＡＡ＋６ｍｇ·Ｌ一１ＡｇＮ０１＋５０珈ｌｇ·Ｌ一‘Ｔｉｍｅｎｔｉｎ，ｐＨ６．２）中。
待分化芽苗长至３—５ｃｍ时转入生根培养基（Ｉ／２ＭＳ）中。
１．２．６转基因油菜ＰＣＲ检测ＣＴＡＢ法提取油菜总ＤＮＡ，并用３５Ｓ启动子序列设计上游引物Ｓ３：５’．ＴＧＴＧＡＴＧＧＴＣＣＧＡ＇ＩＴＧＡＧ－３７，与ｍｉＲ３９５ｄ下游引物ｓ２（见１．２．２）进行ＰＣＲ，扩增片段长度为８５０ｂｐ左右，ＰＣＲ阳性对照模板为质粒ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０４．ｍｉＲ３９５ｄ；阴性对照为未经转化的油菜基因组ＤＮＡ。
２结果与分析２．１拟南芥ｍｉＲ３９５ｄ前体基因的克隆ｍｉＲ３９５在拟南芥基因组中有６个位点（ｍｉＲ３９５ａ—ｆ）¨６｜，均定位于染色体１。
本试验选取ｍｉＲ３９５ｄ（ＥＵ５４９５２０）为研究对象（图１）。
根据已知的ｍｉＲ３９５ｄ前体基因序列设计引物，拟采用ＰＣＲ扩增出４６６ｂｐ的片段。
以拟南芥总ＤＮＡ为模板，用ｓ１和Ｓ２引物进行ＰＣＲ扩增，电泳结果如图２。
片段经回收、连接、转化、测序及比对，发现所得序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的ｍｉＲ３９５ｄ前体基因序列同源性为１００％，表明已成功克隆出该序列。
拟南芥 CRY1 基因在转基因甘蓝型油菜中的遗传及表达研究
拟南芥CRY1基因在转基因甘蓝型油菜中的遗传及表达研究农学院植物科学与技术02-1 畅乃迪（指导教师牛应泽教授）摘要：采用卡那霉素抗性鉴定、PCR技术研究了拟南芥CRY1基因在转基因甘蓝型油菜中的遗传行为，同时应用GUS组织染色和花色素苷积累量的比较研究了CRY1基因在转基因油菜中的表达。
结果表明，拟南芥CRY1基因多以杂合、少数以单拷贝形式整合到转基因油菜的基因组中，目的基因的遗传行为呈现非孟德尔遗传现象，但能够稳定地遗传给后代。
转基因植株T11、T12、T13、T14、T15的GUS检测结果均呈阳性，其中T11、T12、T13的花色素苷积累量增加，说明目的基因在转基因油菜中得到了表达，但T14、T15的花色素苷积累量与对照相当，几乎没有变化，说明目的基因在转基因油菜中出现了沉默现象。
关键词：floral-dip CRY1基因转基因油菜遗传表达The inheritance and expression research of Arabidopsis thaliana CRY1 gene in the transgenic Brassica napus L.Chang NaidiAbstract: Km fastness authentication, PCR technology were adopted to study the genetic behavior of A.thaliana CRY1 gene in B.napus, and comparasion between GUS assay and anthocyanin accumulation quantity was also applied to research its experssion. The results indicated that A.thaliana CRY1 gene integrated into rape genome generally in form of integrate, but seldom in form of single copy, and its genetic behavior was abMendelian model. Objective gene can stably transmit to progeny except for some losing. GUS assay results of the transform palnts T11，T12，T13，T14，T15 were positive. There into the anthocyanin accumulation quantity of T11，T12，T13 increased,which showed that objective gene had expessed in transform rape, but the anthocyanin accumulation quantity of T14，T15 were similar to comparasion, which indicated that objective gene had silenced in transgenic rape.Key Words：floral-dip，CRY1 gene，transgenic rape，inheritance，expression1 前言1.1 植物基因工程与转基因油菜自1983年第一个转基因植物问世以来只有23年的时间，但植物基因工程的发展却是日新月异、硕果累累。
农杆菌介导法将β—1，3-葡聚糖酶基因导入油菜
农杆菌介导法将β—1，3-葡聚糖酶基因导入油菜
佚名
【期刊名称】《作物育种信息》
【年(卷),期】2005(000)004
【摘要】菌核病是油菜生产中的主要病害，目前通过常规育种的方式还未寻找到合适的抗源，因此利用生物技术手段将外源抗病基因导入油菜已成为必然趋势。
Grison等人将几丁质酶基因导入油菜中，表现出对菌核病的明显抗性。
目前利用葡聚糖酶基因已对烟草进行了转化，表达此基因的转基因植株对黑胫病、赤星病及根腐病均有一定抗性，但将此基因导入油菜还未见报道。
【总页数】1页(P6)
【正文语种】中文
【中图分类】S512.1
【相关文献】
1.利用农杆菌介导法将γ-生育酚甲基转移酶基因导入油菜的研究 [J], 苏秀娟;王煜;陈正华;刘桂珍;郑巨云
2.农杆菌介导法将β-1，3-葡聚糖酶基因导入油菜的研究初报 [J], 蓝海燕;王长海;陈正华
3.利用农杆菌介导法将抗虫基因导入油菜的研究 [J], 侯丙凯;黄健
4.几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因导入甘蔗 [J], 顾丽红;张树珍;杨本鹏;蔡文伟;黄东杰;王文治;李娇
5.农杆菌介导法将FPF1基因导入油菜的研究初报 [J], 黄琼华;杨光伟;李德谋;罗小英;裴炎
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
农杆菌转化法将拟南芥基因导入油菜
拟南芥 miR 395d前体基因过表达载体构建
• 重组 pMD19T质粒 双酶切 回收 插入表达载体pCAMBIA1304 PCR验证 得到条带（ 850bp） miR395d前 体基因已成功导入农杆菌,可用于油菜转化。
• 预期结果： • 油菜外植体经预培养、农杆菌侵染、共培 养、脱菌培养、生根培养等一系列过程后 部分长成了潮霉素抗性植株。
用农杆菌介导法将拟南芥miR395d 基因转入油菜中的方法研究
组员：
内容目录
一.目的基因的来源 二.转基因过程 模板DNA的提取 引物的设计 PCR扩增 目的基因的获取
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
连接 载体的构建 转化 检测 三.遗传转化 1.农杆菌培养 2.无菌苗培养 四.转化 五.检测
目的基因的来源
• 1.miRNA在调节植物对环境胁迫如干旱、盐 害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用 • 2.油菜与拟南芥同属于十字花科,亲缘关系 比较近,且miR395在各物种间序列保守。 • 3.采用PCR法从拟南芥中克隆到miR395d前 体基因。
谢谢
载体的构建
• 1. PCR产物的回收与测序
• PCR产物 琼脂糖凝胶电 回收 克隆载体
泳回收试剂盒 pMD19TVector
连接
DH5α感受 态细胞
转化
含有Isopropyl-β- D 挑选单克隆 thiogalactoside(IPTG)、Xgal和Amp的LB平板
鉴定
测序
2.拟南芥miR395d前体基因过表达载 体构建
4.转基因油菜PCR检测
• 油菜总DNA
CTAB法 对照
• PCR（850bp）
阳性：模板质粒pCAMBIA 1304-miR395d ; 阴性：未经转化的油菜基因组DNA 拟南芥 miR 395d。
反义芥子酶基因转入甘蓝型油菜的研究
反义芥子酶基因转入甘蓝型油菜的研究油菜为双子叶十字花科芸薹属植物，包括甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜三个栽培品种，其中以甘蓝型油菜分布最广，面积最大。
作为人类的主要油料作物，油菜种植面积正在逐渐扩大。
中国油菜面积和总产量约占世界1／3。
随着人们生活的不断提高和工业用油的需要，油菜在我国的发展尚有很大的潜力，也促使研究人员不断改良油菜品质。
植物基因工程是指将目的基因与载体相连形成重组体DNA，将其导入寄主细胞中进行增殖和表达，得到突变体植株。
基因工程技术主要包括农杆菌介导转化法，PEG原生质体融合法，电激法，基因枪法，显微注射法，花粉管通道法等。
在油菜研究领域，基因工程技术可用来提高油菜品质，培育抗除草剂、抗虫、抗病转基因油菜。
在国外，转基因油菜已进入大规模商业化应用阶段。
硫代葡萄糖苷(以下简称硫苷)是广泛存在于十字花科植物中的含硫次级代谢产物，广泛存在于植株的各个部位。
硫苷本身是稳定存在的化合物，但当植株受到病虫侵犯或机械损伤时，植物内源芥子酶(myrosinases)会降解硫苷并生成多种有毒降解产物，可以起到抵御某些病虫害的作用。
这就是油菜著名的自身防御系统：芥子酶—硫苷系统。
但仍然有某些害虫可以克服这一防御系统，并通过识别硫苷或其降解产物来取食油菜。
本研究转换思路，利用基因工程抑制油菜体内芥子酶基因的翻译与表达，则得到的转基因植株中芥子酶表达量受到抑制，并进一步研究硫甙的降解情况和油菜的抗虫性品质。
拟南芥(Arabidopsi)的芥子酶基因与甘蓝型油菜芥子酶基因高度同源。
本研究已得到拟南芥反义芥子酶基因载体，利用农杆菌介导法将其转入甘蓝型油菜中双6号，主要研究成果如下：1．选择中双6号，浙双3号，湘油15号，华油杂7号做再生检测，最终选定中双6号作为受体材料。
2．对GV3101，LBA4404，EHA105，AGL1，C58共五个农杆菌菌种进行抗性筛选，结合外植体组织培养状态，最终确定农杆菌GV3101作为转化菌种。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
拟南芥 miR 395d前体基因过表达载体构建
• 重组 pMD19T质粒 双酶切 回收 插入表达载体pCAMBIA1304 PCR验证 得到条带（ 850bp） miR395d前 体基因已成功导入农杆菌,可用于油菜转化。
• 预期结果： • 油菜外植体经预培养、农杆菌侵染、共培 养、脱菌培养、生根培养等一系列过程后 部分长成了潮霉素抗性植株。
谢谢
目的基因的获取
• 模板DNA的提取 （CTAB法） 引物的设计
上游引物5′端 加BglⅡ酶切位 点,下游引物 5′端加入 SpeⅠ酶切位点 ，拟南芥DNA 为模板
PCR扩增
466 bp左右 的miR395d 前体基因
上游引物S1:5′-AGATCTATGTCACCCATCCTATCTT CCTCA-3; 下游引物S2:5′-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA-ACCTGTA-3′ 。
载体的构建
• 1. PCR产物的回收与测序
• PCR产物 琼脂糖凝胶电 回收 克隆载体
泳回收试剂盒 pMD19TVector
连接
DH5α感受 态细胞
转化
含有Isopropyl-β- D 挑选单克隆 thiogalactoside(IPTG)、Xgal和Amp的LB平板
鉴定
测序
2.拟南芥miR395d前体基因过表达载 体构建
用农杆菌介导法将拟南芥miR395d 基因转入油菜中的方法研究
组员：
内容目录
一.目的基因的来源 二.转基因过程 模板DNA的提取 引物的设计 PCR扩增 目的基因的获取
连接 载体的构建 转化 检测 三.遗传转化 1.农杆菌培养 2.无菌苗培养 四.转化 五.检测
目的基因的来源
• 1.miRNA在调节植物对环境胁迫如干旱、盐 害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用 • 2.油菜与拟南芥同属于十字花科,亲缘关系 比较近,且miR395在各物种间序列保守。 • 3.采用PCR法从拟南芥中克隆到miR395d前 体基因。
• 双酶切
限制性内切酶 BglⅡ→pCAMBIA1304； SpeⅠ→pre-miR395d
凝胶电泳 T4DNA连接酶 16℃过夜
• 回收
连接
表达
载体（pCAMBIA1304- miR395d）
Байду номын сангаасPCR和序列测 定
3. 根癌农杆菌介导法转化油菜
农杆菌的培养
含pre-miR395d过表达载体的农杆菌 (5 mL)LB+20 mg·L-1Rif+50 mg·L-1 Kan液体培养基 28 ℃振荡培养1d 40 mL新鲜的上 述液体培养基中振荡培养3 ～ 5 h 对数 生长期 离心弃上清 5倍体积的 MS液体培养基悬浮菌液备用
4.转基因油菜PCR检测
• 油菜总DNA
CTAB法 对照
• PCR（850bp）
阳性：模板质粒pCAMBIA 1304-miR395d ; 阴性：未经转化的油菜基因组DNA 拟南芥 miR 395d。
• 上游引物S3:5′-TGTGATGGTCCGATTGAG-3′, • 下游引物S2:5′-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTAACCTGTA-3′
无菌苗的培养
油菜种子 70%乙醇表面消毒30 s 1 g·L-1 HgCl2 消毒5 min 冲洗 种子萌发(MS) 25 ℃光照培养 7d
转化
• 子叶和下胚轴 预培养基黑暗预培养 3d 浸入侵染液（子叶浸泡5 min, 下胚 轴浸泡30 s） MS固体培养基黑暗培养 2d 脱菌培养基6d 筛选培养 基 15 d 换1次培养基 约1 ～ 2 cm的绿芽切下转入壮苗培养基 分化芽苗长至3 ～ 5 cm时转入生根培养基(1 /2MS)中
BglⅡ和SpeⅠ 目的片段
转基因油菜 PCR检测
• 提取潮霉素抗性植株及阴性对照的DNA , 以 质粒DNA为阳性对照, 进行PCR扩增 ,扩增产 物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
• 抗性植株中, 有能扩增出与质粒DNA大小一 致850bp左右的条带 ,说明拟南芥 miR395d 前体基因已整合到油菜基因组中。