奶牛粪便纤维素降解菌的筛选
纤维素降解菌的筛选分析研究 环境工程专业
纤维素降解菌的筛选及特性研究摘要生物堆肥是大部分养殖场固废资源化利用的主要手段，具有投资小、效益高、有机固体废弃物重复资源化利用效率高等优点，但堆肥过程中也存在一些缺陷，如发酵周期长、有臭味、纤维素木质素分解不彻底等。
牛粪中含有大量未能消化的纤维素和半纤维素，它们是影响堆肥腐熟进程、决定其堆肥产品质量的关键因素。
因此，在牛粪堆肥发酵中选择添加合适的堆肥发酵菌剂和高效纤维素降解菌剂，是解决畜禽粪便堆肥周期长，降解率低等问题的有效途径。
本研究采用富集培养及纯培养法从牛粪中将纤维素降解细菌进行分离并分析其降解特性，以期获得一些高效纤维素降解菌。
采用水解圈法和3，5-二硝基水杨酸（DNS）法进行菌株筛选与酶学特性研究，结合形态学方法对其初步鉴定，分子生物学方法对其鉴定其种属，共得到降解效果良好的菌株3株，分别命名为DH01、DH02、DC02，其中DH01为枯草芽孢杆菌，其纤维素酶活性最高；DH02为苏云金芽孢杆菌，纤维素酶活性次之；DC02为贝莱斯芽孢杆菌，纤维素酶活性低于前两者。
三种菌株均能不同程度分解纤维素，因此，可为牛粪堆肥发酵提供菌种思路，具有重要应用价值。
关键词：纤维素降解菌，纤维素酶，分离，酶学特性AbstractBiological composting is the main method for the utilization of solid waste resources in most farms. It has the advantages of low investment, high efficiency, and high efficiency in the reuse of organic solid waste. However, there are also some shortcomings in the composting process, such as long fermentation cycles and Odor, incomplete decomposition of cellulose and lignin, etc. Cow manure contains a large amount of undigested cellulose and hemicellulose, which are the key factors that affect the maturity of compost and determine the quality of the compost product. Therefore, selecting and adding appropriate composting fermentation inoculants and high-efficiency cellulose degrading inoculants in the cattle manure composting fermentation is an effective way to solve the problems of long composting cycle of livestock and poultry manure and low degradation rate. In this study, enrichment culture and pure culture methods were used to isolate cellulose-degrading bacteria from cow manure and analyze their degradation characteristics, in order to obtain some high-efficiency cellulose-degrading bacteria. Using hydrolysis circle method and 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method for strain screening and enzymatic characteristics research, combined with morphological methods for preliminary identification, molecular biological methods to identify its species, a total of Three strains with good degradation effects were named DH01, DH02, and DC02. Among them, DH01 is Bacillus subtilis with the highest cellulase activity; DH02 is Bacillus thuringiensis, followed by cellulase activity; DC02 is Bacillus velezs Bacillus,cellulase activity is lower than the former two. The three strains can decompose cellulose to different degrees, so they can provide strain ideas for cattle manure composting and fermentation, which has important application value.Key words: cellulolytic bacteria，Cellulase，isolation，enzymatic properties目录1. 引言 (1)2. 材料与方法 (2)2.1 试验材料 (2)2.1.1样品来源 (2)2.1.2培养基 (2)2.1.3供试溶液 (2)2.1.4供试仪器 (2)2.2 试验方法 (3)2.2.1纤维素降解菌的富集 (3)2.2.2纤维素降解菌的初筛 (3)2.2.3纤维素降解菌的复筛及酶活测定 ............................................................ 错误!未定义书签。
纤维素分解菌的筛选方法
纤维素分解菌的筛选方法
纤维素是一种重要的营养物质，是细菌中含量最丰富的有机物质，具有重要的生物学
功能，常被用于制备肥料和饲料等。
研究纤维素分解菌种类及其分解的反应特性，是研究
纤维素降解机理的重要基础。
纤维素分解菌的筛选方法主要有几种，包括淀粉膜电泳筛选，扩增隔离法，等电点筛选，微量培养筛选，补液筛选，微量测定等。
1. 淀粉膜电泳筛选：采用放大型电泳仪，用淀粉溶液构成膜，将单细胞菌悬浮液流
过该膜，其中纤维素分解菌可形成淀粉膜电泳状态，能在该膜中形成一定的结构，从而被
检测到。
2. 扩增隔离法：将一定浓度的纤维素溶液，与培养基或植物提取物按比例混合，在
适宜的条件下，加入适量的细菌，构成纤维素溶液底物，配制培养基，进行培养，根据培
养结果来筛选出对纤维素感兴趣的菌株。
3. 等电点筛选：利用膜膜过滤，在纤维素分解反应的同时，膜膜滤过的细菌会因等
电点变化而被选择。
4. 微量培养筛选：在不同营养条件和温度条件下，采用微量的纤维素细胞悬液，进
行培养，根据形态生长变化、颜色变化等特征，来判断哪些细菌对纤维素有分解能力。
5. 补液筛选：在细胞处理步骤中，常常采用补液筛选方法，利用纤维素溶液作为营
养基底，进行补液筛选，通过补液来影响纤维素分解速度，筛选具有良好分解能力的菌株。
6. 微量测定：取液量较小的细菌悬液，进行分离、培养，在相应的条件下，采用固
体纤维素的含量来微量测定纤维素分解菌的数量，从而筛选出纤维素分解菌菌株。
通过以上各种方法，可以有效筛选出纤维素分解菌的种类，从而更好的研究纤维素降
解的机理和分解效率。
牛粪中兼性厌氧纤维素降解菌的分离及酶活测定
－215－农林论坛牛粪中兼性厌氧纤维素降解菌的分离及酶活测定樊川1杨旭升2张欣1郭春景2（1、黑龙江省科学院生物肥料研究中心，黑龙江哈尔滨1500862、黑龙江省科学院，黑龙江哈尔滨150001）利用微生物产生的纤维素酶降解纤维素，具有纤维素分解效率高、无二次污染等特点，以往的报道中，研究较多的纤维素降解菌是好氧真菌，对厌氧和兼性厌氧纤维素降解菌研究的较少，而二者在乙醇生产、饲料发酵等方面的应用相对于好氧菌更具优势[1，2]。
存在于反刍动物粪便中的纤维素降解菌虽然具有一定的纤维素降解活力，但因其培养条件苛刻而研究较少。
本研究从奶牛的牛粪中分离出一种复合菌系，对其进行了分析，并初步研究了该菌系的纤维素降解特征[3]，为进一步的研究和应用奠定了基础。
1材料与方法1.1材料来源：试验分离所用的奶牛粪便样品来自黑龙江省大庆地区的寒地草场、奶牛养殖农场和奶牛养殖个体户的新鲜牛粪。
1.2培养基培养基A ：蛋白胨3g ，CaCl 2·2H 2O 1.36g ，酵母1g ，蒸馏水1000ml ，PH 7.2；培养基B ：酵母1g ，NH 4Cl 1g ，MgSO 47H 2O 1g ，K 2HPO 40.2g ，Fe －Cl 30.001g NaCl 2g ，蒸馏水1000ml ，PH7.2；培养基C ：酵母1g ，蛋白胨1g ，NaCl 24.7g ，KCl 0.7g ，MgSO 47H 2O 6.3g ，MgCl 26H 2O 4.6g ，蒸馏水1000ml PH 7.2。
1.3分离方法1.3.1纤维素降解菌的初筛：称取0.1g 样品，加入到含0.9ml 培养基的离心管内，置离心机中离心，取上清液。
1.3.2纤维素降解菌的分离：每种样品随机挑选10支离心管，将10支管中的上清液混匀，取出4ml 上清液加入含16ml 培养基的厌氧管内，放入0.15g 滤纸，置42.5℃培养箱内培养100h ，再挑选生长较快的厌氧管，取出4ml 加入含16ml 培养基的厌氧管内，放入0.3g 滤纸，置42.5℃培养箱内培养100h ，然后将A.B.C 三种培养基的氮源，碳源统统减半后，每支厌氧管加入16ml 氮源碳源减半后的培养基，防御0.3g 滤纸，各加入4ml 生长较快的厌氧管中的上清液，置42.5℃培养箱内培养100h 。
纤维素降解微生物的分离与鉴定方法解析
纤维素降解微生物的分离与鉴定方法解析纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，它是一种由大量葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的多糖。
纤维素的降解对于生物能源开发、废弃物处理和环境保护具有重要意义。
而纤维素降解微生物则扮演着关键的角色。
因此，分离和鉴定纤维素降解微生物的方法显得尤为重要。
本文将介绍几种常用的纤维素降解微生物的分离与鉴定方法。
一、平板法平板法是最为常用的纤维素降解微生物分离方法之一。
具体操作如下：1. 准备培养基：将适合纤维素降解微生物生长的培养基高温固化。
常用的培养基包括CMC培养基和Avicel培养基。
2. 稀释样品：将待分离的纤维素降解微生物样品进行适当稀释，通常采用百倍至千倍的稀释倍数。
3. 倒平板：将稀释后的样品均匀倒在高温固化的培养基上，并利用均衡板将其平均分布。
4. 培养：将平板培养在适当的温度下，一般为30-37℃，孵育时间根据需要而定。
5. 分离：观察培养基上的菌落情况，挑取个别菌落进行分离纯化。
二、液体培养法液体培养法是另一种常用的纤维素降解微生物分离方法。
主要包括以下步骤：1. 准备液体培养基：选取适合纤维素降解微生物生长的液体培养基，如液体CMC培养基、液体Avicel培养基等。
2. 接种：将待分离的纤维素降解微生物样品接种到含有相关培养基的试管中。
3. 培养：将试管放置于摇床或恒温培养箱中，在适当的温度和转速条件下培养一定时间。
4. 分离: 通过稀释方法，将培养液中的微生物进行分离纯化，得到单菌株。
三、生理生化特性分析对于分离的纤维素降解微生物，进一步进行鉴定需要进行生理生化特性分析。
常见的特性分析包括以下内容：1. 糖类利用能力：在各种糖类培养基上观察微生物的菌落形态和生长情况。
2. pH和温度适应性：分析微生物在不同pH和温度条件下的生长状况。
3. 酶活性检测：测定微生物产酶的能力，如纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等。
4. 生理代谢产物分析：通过气相色谱-质谱联用技术或其他适当的方法，分析微生物在纤维素降解过程中产生的代谢产物。
纤维素降解菌的分离和筛选
纤维素降解菌的分离和筛选1.实验目的：1.掌握纤维素降解菌的的分离和筛选的方法2.学会会培养基的制备3.再次了解菌落的形态2.实验原理：从美术楼后面树林中取适量的土壤，用无菌水将得到的样品经适当稀释, 在28℃下培养1d，稀释10-6、10-7、10-8三个浓度，分别接种于鉴别培养基中培养, 每组3个平行，在37℃下培养2-3 d，然后进行初筛，重复以上步骤，直至获得纯的菌株。
最后镜检。
3.试验方法：1. 取样先从树林中取10g土壤(10—15cm深)。
用灭菌的塑料袋盛装。
2．饥饿培养秤取10g土壤，置于250ml的装有90ml无菌水的锥形瓶中，摇匀，在37℃下培养1d。
3.梯度稀释所需仪器：试管（8支）、洗耳球、移液管。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、移液管。
用移液管从饥饿培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。
然后用移液管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-1,10-2,10-310-4,10-5,10-6,10-7,10-8不同稀释度的土壤溶液。
4.选择培养○1刚果红培养基的制备所需要的仪器有：500ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、培养基，用2层纱布加棉花做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层报纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
灭菌后，倒9个灭菌平板，凝固后待用。
○2涂布平板将上述已倒培养基的9个平板底面分别用记号笔写上10-6、10-7、10-83种稀释度（每个稀释度划3个平板）。
然后用移液管分别由10-6、10-7,10-8三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。
38℃倒置培养2-3d，至菌落长出，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。
畜禽粪便纤维素降解菌的诱变与筛选
畜禽粪便纤维素降解菌的诱变与筛选摘要：畜禽粪便中的纤维素含量高且由于其组成结构的复杂性，转化利用纤维素一直是个难题，故在畜禽粪便生物转化研究中提高菌株的纤维素酶活性的研究尤为重要。
本实验是在前人从养殖场旁的土壤中获取的菌株通过多次筛选所选出纤维素酶活性较高的菌株的基础上，通过紫外线与亚硝酸复合诱变，终筛后选出对畜禽粪便降解较好菌株。
关键词：畜禽粪便；纤维素酶；诱变选育中图分类号：s182 文献标识码：a1 引言随着畜牧业的迅速发展，畜禽粪便对环境的污染日益受到人们的重视。
畜禽粪便的综合利用成为当前的研究热点，而畜禽粪便的处理主要着眼于将其中所含的物质与能量进行再一次利用。
畜禽粪便中含有大量的有机物，其中有较多的纤维素。
若能将畜禽粪便中的纤维素利用纤维素降解菌降解，便既防止畜禽粪便污染环境，又能将纤维素转换成葡萄糖，继续进行发酵可得到乙醇这样的清洁能源。
真正实现污染物的减量化、无害化、资源化，对我国经济的可持续发展将产生深远的影响，必将有着较好的应用前景。
目前，对可再生资源生产燃料乙醇的研究主要集中在农业废弃物（如秸秆、稻壳）、林业废弃物（如树枝、木材边角料）、水果渣（如桔皮）、生活垃圾等方面，只有少量关于奶牛场粪便的研究报道。
而我国在对畜禽粪便纤维素降解菌株的选育这方面的研究还几乎是一个空白。
本实验是在前人从养殖场旁的土壤中获取的菌株通过多次筛选所选出活性较高的菌株的基础上，通过紫外线、亚硝酸复合诱变选育高效产纤维素酶的菌株以求得到高效降解畜禽粪便的菌株。
2 试验材料与方法2.1 试验材料2.1.1 出发菌种西南大学资源环境学院微生物实验室保藏菌种f7为放线菌2.1.2 自备材料滤纸条：将滤纸剪为1cm×6cm的纸条，用1%醋酸浸泡过夜除去淀粉，再用2%碳酸氢钠洗至中性，晾干备用。
畜禽粪便：分别用5%的酸和碱将畜禽粪便进行预处理，调试ph 至中性，烘干备用。
2.2 实验方法2.2.1 诱变剂处理孢子悬浮液制备取30℃培养5 d的试管斜面菌种，加入ph 7.0的磷酸缓冲液洗下孢子，倒入装有玻璃珠的三角瓶中，30℃，180 r/min恒温振荡2 h，使孢子分散和活化，用灭菌的脱脂棉过滤，诱变处理前调节孢子浓度为106/ml。
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离纤维素是一种广泛存在于自然界中的有机化合物，它是植物细胞壁的主要组成部分。
纤维素具有高度的生物降解性，然而，其高度结晶性和复杂的结构使其难以被常规的酶解系统降解。
在生物领域中，微生物分解是一种有效且环保的方法，因此，筛选和分离纤维素降解菌对于提高纤维素降解效率具有重要意义。
一、筛选纤维素降解菌的方法1.1 培养基的选择筛选纤维素降解菌的第一步是选择合适的培养基。
常用的纤维素降解培养基包括CMC（羧甲基纤维素钠）、Avicel（微晶纤维素）、Whatman No.1滤纸等。
这些培养基能够提供纤维素降解菌所需的碳源和营养物质，有利于菌群的生长和繁殖。
1.2 筛选方法传统的筛选方法是利用纤维素作为唯一的碳源，在培养基中培养环境中的微生物，通过测定产酶能力来判断纤维素降解菌的存在。
常用的方法有：（1）红色亚甲基纤维素（RAC）将纤维素培养基添加亚甲基蓝等指示剂，在纤维素降解区域由蓝色转变为红色，表明纤维素被降解。
（2）半定量筛选利用葡萄糖法测定纤维素降解能力。
在培养基中添加不同浓度的纤维素，观察菌落的生长情况和菌液中的葡萄糖含量，评估纤维素降解能力。
（3）放射标记纤维素将放射性同位素标记在纤维素分子上，通过测定纤维素的解脱率来评估菌株的降解能力。
二、纤维素降解菌的分离与鉴定2.1 分离方法从自然环境中分离纤维素降解菌是筛选过程的关键步骤之一。
常用的分离方法包括：（1）稀释平板法将适当稀释的样品在纤维素培养基上均匀涂布，经过一段时间后，将生长的菌落分离并培养纯种。
（2）可溶性物质包埋法将样品与纤维素培养基搅拌均匀，接种到含有纤维素的胶状物上，培养一段时间后，可分离出纤维素降解菌。
2.2 鉴定方法为了确定分离的菌株是否为具有纤维素降解能力的菌株，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法包括：（1）形态学鉴定观察菌落的形态、颜色和菌落边缘等特征，使用显微镜观察细胞的形状和结构。
（2）生理生化特性鉴定测定菌株的氧耗、氧释等生理特征，通过测定菌株对不同碳源和氮源的利用情况来判断其代谢特性。
纤维素降解细菌筛选及降解特性分析
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牛粪中纤维素的分离与鉴定1
牛粪中纤维素降解菌的分离和纯化（河西学院生命科学与工程系）摘要:本实验利用纤维素为唯一碳源从牛粪中分离纯化纤维素降解菌。
先通过在振荡培养箱中饥饿处理2-3d，静置后取上清液接入刚果红培养基于35℃-37℃下富集培养2-3d，再经刚果红培养基划线培养，获取单菌落，经菌落及菌体形态观察，确定此纤维素降解菌为放线菌。
关键词: 纤维素降解菌；刚果红培养基；牛粪The dung of cellulose degradation bacterium separation andpurificationChen Mengen Deng Haibo Liu Panpan Zhao Yongjiao(Hexi university life science and engineering)Abstract: Collecting dung from zhang ye peasant diluted appropriate in oscillation incubator with hunger in 2-3d, quiet place take supernatant access Congo red training based on 35 c - 37 ° c, 2-3d enriched by Congo Red Cross cultureLine, for single colonies, appraisal of classics the cellulose degradation bacterium actinomycosis.Key words: cellulose degradation bacterium,Congo red medium, The dung 全世界每年大约形成 1.0×1012～2.0×1012植物有机物质 ,其中有一半是纤维素物质 .我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣 (稻草、秸秆等 )就约有 7亿ｔ,工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物 .这些废弃物即没有得到充分的利用 ,又污染环境 ,因此合理开发和科学利用这一丰富的自然资源，具有极其重要的意义和光明的发展前景。
筛选纤维素分解菌方法
筛选纤维素分解菌方法纤维素分解菌是一类具有良好纤维素降解能力的微生物，能够有效分解植物细胞壁中的纤维素，并将其转化为可利用的产物，如糖类和有机酸。
筛选纤维素分解菌的方法主要包括传统培养方法和分子生物学方法。
传统培养方法是最常用的筛选纤维素分解菌的方法之一。
首先，可以选择一些富含纤维素的底泥、土壤或植物残渣等样品作为菌种源，并在适当的培养基中培养。
然后，通过进行连续传代培养，筛选出具有较高纤维素酶活性的菌株。
常用的培养基成分包括纤维素、氮源、无机盐等。
培养过程中，可以通过测定菌株的纤维素酶活性来评估其降解能力。
常用的纤维素酶活性检测方法包括纤维素降解圈法和滴定法等。
分子生物学方法是近年来发展起来的一种筛选纤维素分解菌的方法。
这种方法利用纤维素酶基因的特异性序列，设计引物，并通过PCR扩增的方法进行筛选。
一般选择纤维素酶结构基因（如celA和celB等）作为目标基因，进行PCR扩增。
通过比较不同菌株的基因片段序列，可以筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株。
此外，还可以利用转基因技术将纤维素酶基因导入到目标微生物中，提高其纤维素降解能力。
除了传统培养方法和分子生物学方法，还可以利用高通量筛选技术来筛选纤维素分解菌。
高通量筛选技术包括微流体技术、光学筛选技术和生物芯片技术等。
通过这些技术，可以快速并高效地筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株，并进一步研究其降解机制。
总的来说，筛选纤维素分解菌的方法多种多样，其中传统培养方法和分子生物学方法是最常用的。
未来随着技术的进一步发展，相信会有更多更高效的筛选方法出现，有助于挖掘和利用更多具有纤维素降解能力的微生物，促进纤维素资源的利用和环境减排。
畜禽动物纤维素降解菌株筛选和高效分离培养
畜禽动物纤维素降解菌株筛选和高效分离培养畜禽动物纤维素降解菌株的筛选和高效分离培养对于动物饲料的研究和开发具有重要意义。
纤维素是植物细胞壁的主要成分，而动物无法直接消化纤维素，因此需要通过降解纤维素的菌株来提高饲料的利用率。
本文将探讨畜禽动物纤维素降解菌株的筛选和高效分离培养方法。
首先，畜禽动物纤维素降解菌株的筛选是一个关键步骤。
常见的筛选方法包括土壤样品的接种培养和基于血清瓶的选择培养。
土壤样品接种培养是一种简便有效的方法，可以通过接种含有纤维素的培养基来筛选纤维素降解菌株。
在选择培养方法中，可以添加纤维素作为唯一碳源，通过对培养基的溶解度和菌落数量的监测，筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株。
其次，高效分离培养是为了保证菌株的纯度和活性。
在筛选出的菌株中，可以通过传代培养、逐级稀释和单菌分离等方法，逐步提高纯度并获得单纯菌落。
逐级稀释法可以通过使用不同浓度的培养基来连续稀释菌悬液，从而分离出单菌落，保证菌株的纯度。
在单菌分离过程中，可以利用荧光显微镜或PCR技术来确认菌株的单纯性。
对于畜禽动物纤维素降解菌株的培养条件，合适的环境和培养基是关键因素。
常见的培养条件包括温度、pH值、培养基成分和搅拌速度等。
纤维素降解菌株多数生活在微生物丰富的环境中，因此模拟其自然环境条件是有效培养菌株的方法之一。
在培养基成分方面，除了纤维素作为碳源外，还可添加适量的氮源、矿物盐和维生素等以促进菌株的生长和纤维素降解能力的发挥。
此外，生物技术手段在畜禽动物纤维素降解菌株的筛选和培养中也起到重要作用。
利用PCR技术可以对菌株进行分子鉴定，确定其系统发育位置和纤维素降解相关基因的存在。
基因工程技术可以通过基因克隆和表达来提高菌株的降解能力。
另外，通过微生物组学和代谢组学等高通量技术，可以进一步研究菌株的全基因组、代谢途径和功能基因等，为菌株的应用和提高纤维素降解能力提供更多的理论依据。
总结起来，畜禽动物纤维素降解菌株的筛选和高效分离培养是动物饲料研究中的关键环节。
麦洼牦牛粪便纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［３２］ＢｒｏｃｋｅｔｔＢＦＴ，ＰｒｅｓｃｏｔｔＣＥ，ＧｒａｙｓｔｏｎＳＪ．ＳｏｉｌｍｏｉｓｔｕｒｅｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｆａｃｔｏｒｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｃｒｏｓｓｓｅｖｅｎｂｉｏｇｅｏｃｌｉｍａｔｉｃｚｏｎｅｓｉｎｗｅｓｔｅｒｎＣａｎａｄａ［Ｊ］．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，４４（１）：９－２０．［３３］姜小凤，郭凤霞，陈 垣，等．种植模式对当归根际细菌群落多样性及代谢通路的影响［Ｊ］．应用生态学报，２０２１，３２（１２）：４２５４－４２６２． ［３４］牛世全，赵 进，樊子婧，等．甘肃岷县当归连作种植区土壤细菌群落结构分析［Ｊ］．西北师范大学学报（自然科学版），２０２２，５８（４）：９４－１０２．［３５］ＺｈａｏＬＹ，ＧｕａｎＨＬ，ＷａｎｇＲ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｏｂａｃｃｏｓｔｅｍ－ｄｅｒｉｖｅｄｂｉｏｃｈａｒｏｎｓｏｉｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｕｎｄｅｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｏｆＢｌｅｔｉｌｌａｓｔｒｉａｔａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｌａｎｔＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０２１，２１（２）：１３１８－１３２８．姜立春，付丹阳，赵欣悦，等．麦洼牦牛粪便纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（７）：２２３－２３０．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０７．０３０麦洼牦牛粪便纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化姜立春，付丹阳，赵欣悦，蒋道玉，张雨洁，宋晚晴（绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳６２１０００） 摘要：为从麦洼牦牛粪便中筛选出具有高纤维素降解能力的菌株，通过羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）培养基分离培养，再利用滤纸条崩解和刚果红平板透明圈试验进行初筛，将获得的菌株使用ＤＮＳ法测定ＣＭＣ酶活力进行复筛。
牛粪中高温纤维素降解菌的分离
样品供试验。 1.2 培养基 1.2.1 放线菌筛选培养基：微晶纤维素 20.0g，KNO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0．5g，K2HPO4 0.5g，NaCI 0.5g， FeSO4 0.01g， 琼 脂 20g，H2O 1000mL，pH 值 7.2 ～ 7.5。 1.2.2 放线菌发酵培养基：蛋白胨 3.0g，酵母膏 0.5g，KNO3 0.2g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，微 晶纤维素 10.0g，H2O 1000mL，pH 值 7.0～7.2。 1.2.3 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养
文章编号：1006- 4907（2009）04- 15- 03
牛粪在堆置发酵制作肥料中，纤维素被降解。据 资料报道牛粪中降解纤维素的微生物有细菌、真菌 和放线菌等。分解纤维素的细菌和真菌种类多，但 产酶量不高，而降解纤维素的放线菌虽种类不多， 但一般酶活高，为弄清楚牛粪中天然纤维素分解菌 的种类及其酶活，以便为牛粪生物发酵提供理论依 据，并筛选出高酶活菌应用于生产，进行如下研究： 1 材料与方法 1.1 样品
采用放线菌筛选培养基，筛选出降解纤维素效 果明显的放线菌 3 株，其中 SQ3 菌为优势菌株，该 菌菌落较小，基内菌丝宽 0.3～1.0um，微黄色，发 达，较细，色浅，多分枝，交织成网，不形成横隔，不 断裂；气丝白色，粉末状，气生菌丝发达，宽 1.4～ 2.1um；孢子单个着生在气丝的小孢子梗上，基丝上 不长孢子，孢子直径 0.4～0.7um，表面光滑，圆形； 在酪氨酸琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和 酵母膏琼脂培养基上生长良好；能在葡萄糖天门冬 素琼脂培养基、马铃薯块培养基、蔗糖察氏琼脂培 养基和高氏一号琼脂培养基上生长，而不能在无机 盐淀粉琼脂上生长，可较好的利用葡萄糖、乳糖、蔗 糖、肌醇、果糖；不利用木糖、甘露醇、鼠李糖、半乳 糖；能分解纤维素、液化明胶、不凝固或胨化牛奶、 能水解酪素及淀粉、不能使硝酸盐还原为亚硝酸 盐，不产生硫化氢，菌株对大肠杆菌、枯草芽孢杆 菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌均无抗性，根 据这些特征及与其他高温单孢菌的对比，按《伯杰 氏细菌学鉴定手册》鉴定分类方法，初步将优势放 线菌 SQ3 归为高温单孢菌（Thermomonospora sp.）。
牛粪中纤维素分解性细菌的分离筛选试验
２ 形态学观察 ． ２ 革 兰 氏染 色 后 镜 检 ，纤 维 分解 细 菌 从 形 态 特 征 、染 色特 征和 分解 纤 维素 的功 能上 看 ，可 能属 于 纤 维 单 胞 菌属 ，有 时见 到细 菌 的革 兰 氏阳 性 的梭
菌 ，革 兰 氏 阳性 ，偏 端芽 孢 ，长 约 １ ～ ． ｍ 的短 ． ３ ｇ ５ ０
小梭 菌 ，多 单在 ，偶有 ２ ３ 菌 体相 连 ，有 芽孢 。 ～个 注 ： 菌 圈 直 径 １．～ ０ｎｌ 者 为 高度 敏 感 ： 径 １、－ ５ 抑 ５１２ ｌｌ ｒ 直 ０１ １ 每 ｍｌ 肉汤培 养 物约 含 ７ ０－ ×１９Ｆ （ ｏｏｇ ｎｌ 者 为中度 敏感：直径在 １ｍｍ 以下者为耐药 。 ×１８４ ０Ｃ Ｕ Ｃ ｌｎ ｌｌ ｒ ０ Ｆ ｒ ｎ ｉ ｏｍｉｇＵｎｔ菌落 形成 单位 ） 。 ３ 关于该细菌与反刍动物营养的关系 ． ２ ２ ３ 生 化鉴 定 纤 维 素 分 解 性 细 菌 在 牛 粪 中的存 在 与分 布 很 通 过分 离菌 生化 试验 结 果 ， 以得 出该细 菌符 普遍 ，阳性 个体 非 常多 。本 实验 从 １ 牛粪样 品 可 ０份 合纤 维单胞 菌属 中的细 胞纤 维 单胞 菌 的特征 。 纤维 中分离出 ８ 份阳性结果， 分离率 ８ ％。 ０ 牛粪 内容物 化纤维单胞菌 已被认 为是一些分解纤维 素细菌 的 中纤 维 分解 性 细 菌 的含 量 多 少 是和 畜体 营 养 膘 情 同物异名， 在文献 中都有不同的报道（ 结果见表 １。 有 直 接关 系 的 。经过 初 步 的观察 与 分析 ，牛 粪样 品 ） 表 １ 分离菌生化试验结果 中 能分 离 出 阳性 细 菌 所 代表 畜体 的营 养 膘 情 显然 是优 良等级的。 而分解菌是阴性 的所代表畜体的营 项目 阳性率 （ ％） 项目 阳性率 （ ％） 养膘情显然是瘦弱等级的。 而在 ８ 份阳性样品中纤 葡 萄糖 １０（ ０１ ） 松三糖 ０ １ ／０ ０（ ／０ ０１ ） 维 素 分 解 性 细 菌 数 目多 的 畜体 的营 养 膘 情 显然 要 乳糖 ０ （／０ ０１ ） 硫化氢 ０ （／０ ０１ ） 好 于含 菌 少 的畜体 。 这种 现象 的 原 因机制 是纤 维素 麦 芽 糖 １０ （ ｏｌ ） ０ １ ／ 靛 基 质 １０ （ ０１ ） ０ ０ １／０ 分 解 性 细 菌 多 的 反刍 动 物 瘤 胃对 秸 杆 类饲 草 的营 甘露醇 ６ （ ／０ 纤 维二 糖 １０ （ ０１ ） ０ ６１ ） ０ １／０ 养转 化 率 高 ， 从而 反 刍动 物 的瘤 胃对纤 维 素 的利 用 蔗糖 １０ （ ｏｌ ） ０ １，０ 明胶 ０ （／０ ０１ ） 效 果好 ， 这样 的反刍 动物 的营 养膘 情 一般 是优 良等 阿拉伯糖 ４ （／ ） ０ ４１ ０ 鼠李糖 １０ （０ ０ ０ １／ ） １ 级。同样道理反刍动物瘤胃中含此菌少， 胃营养 瘤 山梨醇 １０ （０１ ） 运 动力 ０ １／０ ６ （ １） ０ ６ ０ ／ 转化率就低， 那么就会造成动物营养吸收不 良， 该 ’ 动物 的 营养膘 情 为瘦 弱等 级 。据 有关 报道 ：在人 工 尿素酶 ３ （／０ ０ ３１ ） 斗乳糖 １０ （０１ ） ０ １／０ 条 件 下 ， 果 能提 高纤 维分 解 菌 的生活 条件 可大 大 如 水扬素 ７ （／０ 精氨酸脱羧酶 １０ （０１ ） ０ ７１ ） ０ １ ／０ 提 高该 细 菌群 体对 该秸 杆 类饲 草 的转化 率 ， 其粗 使 鸟氨酸脱羧酶 ４ ４１ ） ０（ ／０ ＶＰ试验 ０ （／８ ０１ ） 蛋 白 由 ５ｏ ％提 高到 ２ ．２ 粗 脂肪 由 ０６ ％提 高 ．０ ４６ ％， ．７ ２ 药敏试验 ． ４ 到 １． ％。所 以加 强这方 面 开发 ，在 提 高反刍 动 ２５ ０ 贴药 敏片 的培 养基 经 ３ ￣ ７Ｃ培养 ２ ，其 中头 ４ｈ 物 的生 产性 能研 究 中将 是 一个 突破 点 ， 具有 很好 的 孢呱 啊 、氟 哌酸 、头孢 唑啉 、丁胺 卡那 敏感 率 高 ， 临床 应 用前 景 。 而头孢 呋 新 、青霉 素等 药 物 的敏感 性较 低 （ 结果见 ３ 关于药敏试验 － ３ 表 ２。 ） 实验 结 果显 示该 菌对 头孢 呱 啊 、 哌 酸 、 氟 头孢 唑 啉 、 ３ 小 结 与讨论 丁胺 卡 那敏感 率 高 ，而对 头孢 呋 新 、青 霉 素 、等 药 ３１ 关于细菌的筛选 ． 物 的敏感 性较 低 。从这 一 结果可 以得 到 启示 ，反 刍 本 实 验 在 国 内首 次 使用 了无 机 盐 纤 维 素 琼 脂 动 物 服用 抗 生素 时 ，如 果 头孢 呱啊 、氟 哌酸 、头孢 平板培养基对牛粪 中的纤维素分解性细菌进行分 唑啉、 丁胺卡那类药物服用过多， 将会大量杀死该 离， 由于在 此培 养基 中只有 纤维 素分 解 性细 菌 能够 菌 ，从而 阻碍 该 细菌 对 纤维素 的 分解 。如 果这 种情 利用其中物质进行存活， 所以 ３ ７ ～ 后从该培养基中 况 时 间过长 ， 就会 造 成反 刍 动物 的一 些消化 系 统疾
不同来源纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶能力的比较
第32卷第4期V o l.32N o.4草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年4月A p r.2024d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2024.04.030引用格式:陈欢,史子浩,吴春会,等.不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较[J].草地学报,2024,32(4): 1252-1258C H E N H u a n,S H I Z i-h a o,WU C h u n-h u i,e t a l.S c r e e n i n g,I d e n t i f i c a t i o na n dC o m p a r i s o no fE n z y m eP r o d u c t i o nC a-p a c i t y o fC e l l u l o s e-D e g r a d i n g B a c t e r i a f r o m D i f f e r e n t S o u r c e s[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2024,32(4):1252-1258不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较陈欢1,史子浩1,吴春会1,李秋凤1,于晓梦1,徐领1,贾海阔1,刘震灵1,王明亚1,2* (1.河北农业大学动物科技学院,河北保定071000;2.农业农村部奶牛健康养殖重点实验室(部省共建),河北保定071000)摘要:为了选育纤维素高效降解菌,提高纤维素降解效率㊂本研究从肉牛瘤胃液㊁肉牛粪便,蝗虫肠道末筛选纤维素降解能力较强的株系,对其进行生物学鉴定和酶活性比较㊂结果表明,从肉牛瘤胃液中筛选出纤维素降解株系L7,L8-1和L9,分别鉴定为高地芽孢杆菌(B a c i l l u s a l t i t u d i n i s)㊁暹罗芽孢杆菌(B.s i a m e n s i s)和枯草芽孢杆菌(B.s u b t i l l u s);从蝗虫肠道末中筛选得到株系H2-1和H3-1,分别鉴定为枯草芽孢杆菌(B.s u b t i l l u s)和解蛋白芽孢杆菌(B.p r o t e o l y t i c u s);从肉牛粪便中筛选得到株系F8-2被鉴定为高地芽孢杆菌(B.a l t i t u d i n i s)㊂其中降解能力最强的株系为L7,其全酶(F P A)㊁外切葡聚糖酶(C1),内切葡聚糖酶(C M C)和β-葡萄糖苷酶(β-G a s e)活性分别为4.28,1.89,5.57,2.30U㊃m L-1㊂菌落D/d平均值与F P A,C M C,C1,β-G a s e的酶活性呈显著正相关(P<0.05)㊂本研究筛选得到株系L7具有较强的纤维素降解能力,为提高饲料转化率提供了更多可能㊂关键词:纤维素降解菌;酶活性;芽孢杆菌中图分类号:S816.3文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)04-1252-09S c r e e n i n g,I d e n t i f i c a t i o na n dC o m p a r i s o no fE n z y m eP r o d u c t i o nC a p a c i t y o fC e l l u l o s e-D e g r a d i n g B a c t e r i a f r o m D i f f e r e n t S o u r c e sC H E N H u a n1,S H I Z i-h a o1,WU C h u n-h u i1,L IQ i u-f e n g1,Y U X i a o-m e n g1,X U L i n g1,J I A H a i-k u o1,L I UZ h e n-l i n g1,WA N G M i n g-y a1,2*(1.C o l l e g e o f a n i m a l s c i e n c e a n d t e c h n o l o g y,H e b e iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,B a o d i n g,H e b e i P r o v i n c e071000,C h i n a;2.K e y L a b o r a t o r y o fH e a l t h y B r e e d i n g i nD a i r y C a t t l e(C o-C o n s t r u c t i o nb y M i n i s t r y a n dP r o v i n c e),B a o d i n g,H e b e i P r o v i n c e071000,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t o s c r e e na n d c u l t i v a t e e f f i c i e n t c e l l u l o s ed e g r a d i n g s t r a i n s a n d i m p r o v e t h e e f f i c i e n c y o f c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n,i n t h i s s t u d y,w e s c r e e n e d t h e s t r a i n sw i t hs t r o n g c e l l u l o s ed e g r a d a t i o na b i l i t y f r o m r u m e n f l u i d,f r e s he x c r e t ao fb e e f c a t t l e,a n d l o c u s th i n d g u t,p e r f o r m e db i o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n,a n dc o m-p a r e d t h e i r e n z y m e-p r o d u c i n g a c t i v i t y.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e c e l l u l o s e-d e g r a d i n g b a c t e r i a s t r a i n s L7, L8-1,a n dL9w e r e s c r e e n e d f r o mt h e r u m e n f l u i d o f S i m m e n t a l c a t t l e a n d i d e n t i f i e d a sB a c i l l u s a l t i t u d i n i s, B.s i a m e n s i s a n dB.s u b t i l l u s,r e s p e c t i v e l y.T h e s t r a i n sH2-1a n dH3-1w e r e s c r e e n e d f r o ml o c u s t h i n d g u t a n d i d e n t i f i e d a s B.s u b t i l l u s a n d B.p r o t e o l y t i c u s,r e s p e c t i v e l y,a n d t h e s t r a i nF8-2f r o mc a t t l e e x c r e t aw a s i d e n t i f i e da s B.a l t i t u d i n i s.T h es t r a i nL7s h o w e dt h es t r o n g e s td e g r a d a t i o na b i l i t y,e n z y m ea c t i v i t y o f w h i c h i nF P A,C M C,C1,a n dβ-G a s ew a s4.28,1.89,5.57,a n d2.30U㊃m L-1,r e s p e c t i v e l y.C o r r e l a t i o na-n a l y s i s s h o w e d t h a t t h eD/d v a l u e s o f c o l o n y w e r e s i g n i f i c a n t l y p o s i t i v e l y c o r r e l a t e dw i t h e n z y m e a c t i v i t y o f F P A,C M C,C1,a n dβ-G a s e(P<0.05).I n t h i s s t u d y,t h e s t r a i nL7s h o w e ds t r o n g e r c e l l u l o s ed e g r a d a t i o n a b i l i t y t h a no t h e r s t r a i n s,a n d p r o v i d e dm o r e p o s s i b i l i t i e s t o i m p r o v e t h e f e e d c o n v e r s i o n r a t e o f c r u d e f i b e r u t i l i z a t i o n.K e y w o r d s:C e l l u l o s e-d e g r a d i n g b a c t e r i a;E n z y m a t i c a c t i v i t y;B a c i l l u s收稿日期:2023-12-18;修回日期:2024-01-28基金项目:河北农业大学引进人才科研专项(Y J201826);河北省现代农业产业技术体系建设专项资金(H B C T2023160205)资助作者简介:陈欢(1999-),男,满族,河北承德人,硕士研究生,主要从事动物营养与饲料科学研究,E-m a i l:177********@163.c o m;*A u-t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:h e b e i g r a s s@163.c o m第4期陈欢等:不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较纤维素是牧草和农作物秸秆的主要成分,约占总干重的30%~50%[1],是自然界中最丰富的反刍动物饲料资源,将牧草和农作物秸秆调制成青贮饲料过程中,充分降解和利用其中的粗纤维素是畜牧业降本增效的有效措施㊂目前许多研究通过添加外源纤维素酶,来降解和充分利用纤维素,达到改善青贮饲料发酵品质的目的[2]㊂然而由于酶制剂成本高㊁性能不稳定及p H值适应范围较窄等因素,限制了其在青贮饲料中的广泛应用[3-4]㊂纤维素降解菌具有成本低,适应性广等优点,可降解植物中的结构性纤维素,并将其转化为单糖进而被乳酸菌和家畜利用,因此,筛选并获得能高效降解牧草和农作物秸秆中的粗纤维的纤维素降解菌是畜牧业降本增效的重要因素㊂纤维素降解细菌相比于真菌具有结构简单㊁繁殖周期短㊁抗逆性强㊁耐酸㊁产酶活性高等特点而成为研究热点[5]㊂虽然,近年来对纤维素降解菌的研究比较多,但大部分纤维素降解菌都不同程度地存在酶系不完全㊁活性不高㊁酶作用条件苛刻等问题,需要进一步去挖掘纤维素降解菌资源㊂且来源为土壤㊁废纸浆㊁温泉等的纤维素降解菌安全性存在问题[6-8],不便直接运用于畜牧业中的饲料加工及饲喂㊂有研究人员从腐质土㊁朽木和土样中筛选出了纤维素降解细菌,有的对秸秆有显著降解作用[9]㊂动物类来源纤维素降解菌如瘤胃微生物和蝗虫肠道末微生物等具有更安全的特性,且种类繁多㊁数量巨大,仍存在大量的纤维素降解菌资源未被开发㊂虽然对动物类来源纤维素降解菌也有一定的研究,但是,对不同来源的纤维素降解菌酶活性进行比较的研究很少[10]㊂因此,本研究从肉牛瘤胃液,肉牛粪便,蝗虫肠道末,筛选纤维素降解能力较强的株系,对其进行生物学鉴定和产酶活性进行比较,筛选产酶能力佳的株系,为高效纤维素降解株系筛选提供借鉴㊂1材料与方法1.1试验材料西门塔尔牛瘤胃液㊁粪便样品采集于保定市定兴县燕园肉牛有限公司,东亚飞蝗购买于山东省临沂市费县富裕蚂蚱养殖基地㊂称取肉牛瘤胃液1m L㊁粪便10g,蝗虫肠道末内容物分别放入装有100m L无菌水的锥形瓶中,37ħ振动20m i n,制得悬浮液㊂本研究所用培养基配制如下:牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g㊃L-1㊁蛋白胨10g㊃L-1㊁N a C l5g㊃L-1,p H值7.0㊂羧甲基纤维素钠液体培养基:C M C-N a10g㊃L-1, K2H P O41g㊃L-1,N H4N O31.0g㊃L-1,C a C l20.02 g㊃L-1,M g S O4㊃7H2O0.2g㊃L-1,F e C l3㊃6H2O 0.05g㊃L-1,p H7.0,固体培养基加琼脂15 g㊃L-1㊂赫奇逊液体培养基:磷酸二氢钾1.0g㊃L-1㊁七水硫酸镁0.3g㊃L-1㊁氯化钠0.1g㊃L-1㊁硝酸钠2.5g㊃L-1㊁氯化铁0.01g㊃L-1,氯化钙0.1 g㊃L-1㊂刚果红染色液:称取0.1g刚果红溶于100m L 蒸馏水中㊂氯化钠溶液:称取5.85g氯化钠溶于100m L 蒸馏水中㊂产酶培养基:(N H4)2S O42.0g㊃L-1,K H2P O4 3.0g㊃L-1,C o C l23.0g㊃L-1,F e S O47.5g㊃L-1, M n S O4㊃H2O2.5g㊃L-1,Z n S O4㊃7H2O2.0 g㊃L-1,M n S O4㊃7H2O0.5g㊃L-1,C a C l20.5g㊃L-1㊂葡萄糖标准溶液:将10g葡萄糖烘干至恒重,用1%C M C-N a的0.05m L盐缓冲液溶解并定容至100m L,4ħ保存㊂羧甲基纤维素钠(C M C-N a)㊁3,5-二硝基水杨酸(D N S)㊁无淀粉滤纸㊁脱脂棉㊁水杨苷等购自北京索莱宝科技有限公司㊂1.2试验方法1.2.1富集培养在超净工作台中,吸取1m L菌悬液,将其添加至500m L的牛肉膏蛋白胨的液体培养基中,于37ħ,150r㊃m i n-1的摇床(H Z Q-X100,常州金坛精达仪器制造有限公司)上进行24 h的培养㊂1.2.2纤维素降解菌的分离与纯化将培养的菌液做标准液按十倍级数稀释,各吸取稀释倍数为10-5,10-6,10-7倍的菌液50μL涂于羧甲基纤维素钠固体培养基上,按各稀释倍数进行3次重复㊂于37ħ条件下进行24h的细菌培养㊂1.2.3纤维素降解菌的筛选将纯化的株系通过接种环分离出单个菌落,放置在羧甲基纤维素固体平板上,置于37ħ的恒温培养箱(L C-G Z X-150T,上海力辰邦西仪器科技有限公司)中,进行2d的倒置培养㊂在细菌生长2d后,用1g㊃L-1刚果红染色30m i n,然后用1m o l㊃L-1N a C l溶液对其进行脱色3521草地学报第32卷30m i n[11]㊂当出现一个清晰的透明圈,测量透明圈直径(D)与菌落直径(d),计算D/d值并选择平均值比较大的株系㊂1.2.4滤纸降解试验将所获得株系置于赫齐逊液体培养基中,在37ħ,150r㊃m i n-1下培养10d;每组3个平行,根据滤纸的崩解情况判断株系降解纤维素的能力㊂1.2.5标准曲线的绘制取8支20m L刻度的试管,分别加入1m g㊃m L-1的葡萄糖标准溶液0,0.2, 0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4m L,补加蒸馏水至总体积为2m L,配制成浓度梯度的葡萄糖溶液㊂向各试管中加入2m L D N S溶液,摇匀后沸水浴5m i n,立即取出冷却,用蒸馏水定容至20m L㊂在波长540n m下,以未加入葡萄糖标准溶液的试管作为对照调零点,测定其它各管溶液的光密度(O p t i c a l d e n s i t y,O D)值并记录结果㊂以葡萄糖含量(m g)为横坐标,以对应的O D值为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线㊂1.2.6酶活性测定取筛选出的菌悬液以1%接种量接种于产酶培养基中,37ħ,150r㊃m i n-1培养4d,发酵液6000r㊃m i n-1离心10m i n后取上清液作为粗酶液㊂粗酶液与无淀粉滤纸(W h a t m a n)㊁脱脂棉㊁羧甲基纤维素钠(C M C-N a)和水杨苷四种底物反应的产物与3,5-二硝基水杨酸(D N S)溶液发生氧化还原反应,在波长540n m下比色测定还原糖量,根据线性关系测定F P A,C M C,C1和β-G a s e 的酶活性[12],酶活性单位为U㊃m L-1,定义1m L 酶液每分钟催化底物水解生成1μg葡萄糖所需要的酶量为1个纤维素酶活性单位(U)㊂1.2.7分子生物学鉴定提取菌液D N A,以通用引物27F(5'-A G A G T T T G A T C MT G G C T C A G-3')和1492R(5'-T A C G G Y T A C C T G T T A C G A C T T-3')进行P C R扩增,扩增体系为25μL,包括:上游引物(10μm o l㊃L-1)1μL,下游引物(10μm o l㊃L-1) 1μL,D N A模板(稀释20倍)1μL,d d H2O22μL㊂P C R反应程序为:95ħ预变性1m i n;95ħ30s;53ħ30s;72ħ30s;35次循环,最后72ħ延伸7m i n㊂将P C R扩增产物进行电泳检测,回收的P C R产物送至北京志超伟业生物技术有限公司进行16s r R N A 测序,序列通过N C B I(w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v)中的B L A S T进行同源性分析㊂1.2.8数据统计与分析利用E x c e l2019进行数据录入整理,用S P S SS t a t i s t i c s23.0(I B M,N Y, U S A)进行单因素方差分析,用D u n c a n多重比较检验法对数据进行多重比较(P<0.05),用G r a p h P a d P r i s m9.5(G r a p h P a dS o f t w a r e,C A,U S A)对试验数据进行图表绘制,结果用平均数ʃ标准差表示㊂2结果与分析2.1纤维素降解菌的分离与筛选通过对肉牛瘤胃液㊁粪便㊁蝗虫肠道末内容物的富集培养㊁稀释涂布,划线分离一共得到15个株系,经刚果红培养基鉴定后,有6个株系产纤维素酶,部分株系的刚果红染色结果(图1)㊁透明圈与株系直径大小表明(表1),15个株系的D/d平均值为1.42~6.14,其中L7,L8-1,L9,H3-1,H2-1,F8-2的D/d平均值分别为6.14,5.29,4.54, 2.17,2.14和4.49,对这6个D/d值较大的株系进行酶活性测定㊂图1株系L7的刚果红染色F i g.1 T h e s t r a i nL7s t a i n e dw i t hC o n g o r e dd y e4521第4期陈 欢等:不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较表1 分离出的15个纤维素降解菌株系透明圈直径、菌落直径和滤纸崩解结果T a b l e 1 T r a n s p a r e n c y c i r c l e d i a m e t e r ,c o l o n y d i a m e t e r a n d f i l t e r p a p e r d i s i n t e gr a t i o n r e s u l t s o f 15i s o l a t e d c e l l u l o s e -d e g r a d i n g ba c t e r i a l s t r a i n l i n e s 株系编号S t r a i nN o .透明圈直径(D )T r a n s pa r e n t c i r c l e d i a m e t e r /c m 菌落直径(d)C o l o n y di a m e t e r /c m D /d滤纸崩解F i l t e r s t r i p d e gr a d a t i o n 株系来源S t r a i n s o u r c eL 8-14.67ʃ0.640.88ʃ0.075.29ʃ0.34b+++瘤胃液L 73.16ʃ0.400.52ʃ0.086.14ʃ0.12a++++瘤胃液L 91.80ʃ0.200.40ʃ0.094.54ʃ0.94c+++瘤胃液L 81.28ʃ0.100.51ʃ0.062.53ʃ0.31de++瘤胃液H 110.58ʃ0.230.32ʃ0.081.80ʃ0.29e f+蝗虫肠道末H 2-10.50ʃ0.100.23ʃ0.062.17ʃ0.29e f++蝗虫肠道末H 140.77ʃ0.060.43ʃ0.081.80ʃ0.20ef+蝗虫肠道末H 150.52ʃ0.100.27ʃ0.061.94ʃ0.10e f++蝗虫肠道末H 3-10.57ʃ0.100.27ʃ0.062.14ʃ0.13e f++蝗虫肠道末F 40.97ʃ0.250.70ʃ0.311.46ʃ0.24f+肉牛粪便F 10.60ʃ0.040.41ʃ0.051.47ʃ0.12f++肉牛粪便F 20.40ʃ0.010.28ʃ0.031.42ʃ0.16f+肉牛粪便F 30.60ʃ0.020.38ʃ0.051.60ʃ019f++肉牛粪便F 8-21.63ʃ0.150.42ʃ0.194.49ʃ0.10c+++肉牛粪便注:数据为试验平均值ʃ标准差,同列上标英文字母表示差异显著性(P =0.05)㊂ + 表示滤纸边缘出现毛边; ++ 表示滤纸弯曲,不成糊状; +++ 表示滤纸不定形,近似糊状; ++++表示滤纸成糊状N o t e :D a t a r e p r e s e n t e d t h em e a n sʃS D (n =3).S u p e r s c r i p t l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t l y di f f e r e n t a t t h e l e v e l o f 0.05(P =0.05). + ,S i n g l e p l u s s y m b o l i n d i c a t e s d e f o r m a t i o no ne d g e o f t h e f i l t e r p a p e r s t r i p . ++ ,D o u b l e p l u s s y m b o l s i n d i c a t e s b e n d i n g o f f i l t e r p a p e r s t r i pe ,b u t n o t i n t h e s h a p e of p a s t e . +++ ,T h r e e p l u s s y m b o l s i n d i c a t e s a b n o r m a l a n d a l m o s t t h e s h a p e o f p a s t e . ++++ ,F o u r p l u s s ym b o l s i n d i c a t e s t h e s h a p e o f c o m pl e t e p a s t e 2.2 酶活性测定上述D /d 平均值较大及滤纸崩解效果较好的6个株系,通过4种纤维素酶活性测定的结果(图2)表明,株系L 7的F P A 酶活性显著高于株系L 9,H 3-1,F 8-2,H 2-1(P <0.05),株系L 9,L 8-1显著高于H 3-1,F 8-2,H 2-1(P <0.05)㊂株系L 7和L 8-1的C M C 酶活性显著(P <0.05)高于株系L 9,H 3-1,F 8-2,H 2-1㊂株系L 7的C 1酶活性显著高于株系L 9,L 8-1,H 3-1,F 8-2,H 2-1(P <0.05)㊂株系L 7和L 9的β-G a s e 酶活性显著高于L 9,H 3-1,F 8-2,H 2-1(P <0.05)㊂综上所述,株系L 7的四种酶活性高于其它株系的分别为4.28,1.89,5.57,2.30U ㊃m L -1为最优株系,其次为株系L 8-1㊂图2 株系的酶活性F i g .2 E n z ym a t i c a c t i v i t i e s o f s t r a i n s 5521草地学报第32卷2.3D/d平均值与纤维素降解菌酶活性相关性分析相关性分析表明(图3),纤维素降解菌D/d平均值的大小与F P A酶活性㊁C M C酶活性㊁C1酶活性㊁β-G a s e酶活性活力呈显著正相关(P<0.05),随着F P A酶活性的增加,株系的D/d值随之变大㊂图3株系D/d值与纤维素酶活性相关性分析F i g.3 C o r r e l a t i o na n a l y s i sb e t w e e nD/dv a l u e s a n de n z y m a t i c a c t i v i t i e s o f s t r a i n s2.4株系分子生物学鉴定由表2和图4所示,对筛选得到的6个优良纤维素降解株系进行16s r R N A鉴定,将P C R产物测序序列进行B L A S T序列比对(h t t p s://b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/)㊂基于16s r D N A基因系列的系统发育分析表明,L8-1株系被鉴定为暹罗芽孢杆菌(B.s i a m e n s i s),H2-1株系和L9株系为枯草芽孢杆菌(B.s u b t i l l u s),H3-1株系为解蛋白芽孢杆菌(B.p r o t e o l y t i c u s),株系L7和F8-2经鉴定属于同一个种高地芽孢杆菌(B.a l t i t u d i n i s)㊂表26个株系的16s r R N A序列同源性比对T a b l e216s r R N As e q u e n c eh o m o l o g y c o m p a r i s o no f6s t r a i n s株系编号S t r a i n c o d e中文菌名C h i n e s e n a m e拉丁学名L a t i nn a m e覆盖率C o v e r a g e/%同源性H o m o l o g y/%序列号G e n B a n ka c c e s s i o nn u m b e rL8-1暹罗芽孢杆菌B.s i a m e n s i s100100K Y643639.1H2-1枯草芽孢杆菌B.s u b t i l l u s99.52MT513998.1L999.52MT513998.1H3-1解蛋白芽孢杆菌B.p r o t e o l y t i c u s100MT573794.1L7高地芽孢杆菌B.a l t i t u d i n i s100MN826596.1F8-2100MN826596.16521第4期陈 欢等:不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较图4 株系L 9,H 2-1,L 8-1,L 7-1,F 8-2和H 3-1基于16s r D N A 序列同源性构建的系统发育树F i g .4 P h y l o g e n e t i c t r e e o f s t r a i n sL 9,H 2-1,L 8-1,L 7,F 8-2,a n dH 3-1b a s e do n16s r D N As e q u e n c eh o m o l o g y3 讨论自然界中产纤维素酶微生物种类很广,包括真菌㊁细菌和放线菌㊂一般真菌产生的纤维素酶活性比细菌高,但细菌具有发酵产酶时间短㊁产纤维素酶使用范围广等优点㊂研究报道,在瘤胃中发现苏云金芽孢杆菌(B .t h u r i n g i e n s i s )㊁巨大芽孢杆菌(B .m e ga t e -r i u m )和蜡样芽孢杆菌(B .c e r e u s)㊁短小芽孢杆菌(B .pu m i l u s )㊁枯草芽孢杆菌(B .s u b t i l i s )均可产纤维素酶,但是酶活不一[12-13]㊂高双喜等[14]从瘤胃中分离的暹罗芽孢杆菌(B .s i a m e n s i s )株系H -7,C M C 酶活性最高为0.18U ㊃m L -1,F P A 酶活性最高为0.44U ㊃m L -1,降解的滤纸条在第3d 接近糊状㊂对于暹罗芽孢杆菌的研究报道较多,主要在抗菌活性[15]㊁产纤溶酶[16]等起作用㊂本研究筛选得到暹罗芽孢杆菌株系L 8-1的酶活性均较高于株系H -7,这表明株系L 8-1降解纤维效果比H -7好㊂同时,也证实暹罗芽孢杆菌具有产纤维素酶的活性,为该菌的进一步应用提供了广泛的空间㊂孙尹双等[17]以奶牛瘤胃液为筛选源得到枯草芽孢杆菌株系B X 1-12,其产纤维素酶活高达27.33U ㊃m L -1㊂D a n -i e l [18]研究发现,在猪饲料中施用枯草芽孢杆菌可以为猪提供酶的来源,有助于营养消化和饲料的利用,从而提高生长效率㊂本研究在瘤胃液中和牛粪便中筛选得到的高地芽孢杆株系L 7和F 8-2也具有一定的产纤维素酶的能力㊂国内外关于解蛋白芽孢杆菌应用研究的报道甚少,解蛋白芽孢杆株系系C F R 3001是从鱼类加工废料中分离的产碱性蛋白酶的细菌,可抑制大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i )㊁单核细胞增生李斯特菌(L i s t e r i am o n o c y t o ge n e s b a c t e r i a L i s t e r )和蜡样芽孢杆菌(B .c e r e u s )等多种病原体的生长[19]㊂本研究在蝗虫的肠道末中筛选得到解蛋白芽孢杆菌株系H 3-1具有一定的产纤维素酶能力,为解蛋白芽孢杆菌功能的进一步研究提供了依据㊂酶活性的不同与株系的种属及纤维素酶的组成有关㊂通过对D /d 值与纤维素降解菌酶活性相关性分析,发现纤维素的酶活性是影响水解圈大小的关键因素㊂纤维素酶是多组分酶,包括葡聚糖内切酶㊁葡聚糖外切酶㊁β-葡萄糖苷酶等㊂F P A 酶活性则代表纤维素酶组分的总活力,反映了3类酶组分的协同作用[20]㊂通过对筛选不同来源株系的酶活性比较,来源于瘤胃液中纤维素降解菌酶活性优于肉牛粪便中降解菌的酶活,来源于蝗虫肠道末的株系酶活性较差,不同降解纤维素的株系酶活不同,这可能与不同株系在不同宿主动物的存活环境有关㊂瘤胃微生物由细菌,真菌及原虫等组成㊂其中,细菌(包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)在瘤胃中数量最多,每毫升瘤胃液中细菌数量超过1011个[21]㊂在草料或饲料进入瘤胃时,瘤胃的规律性蠕动使得瘤胃纤维降解7521草地学报第32卷细菌快速与新摄入的草料或饲料发生最初的物理性接触[22]㊂截至目前,已从多种反刍动物的瘤胃中筛选出纤维素降解菌[23-25]㊂而昆虫并没有发达的瘤胃,导致相同菌种的生存环境不同进而导致酶活不同㊂这三种来源的纤维素降解菌各有不同,其他来源(土壤㊁废纸浆㊁温泉等)的纤维素降解菌安全性存在问题,不便直接运用于畜牧业中的饲料加工及饲喂㊂昆虫肠道来源的纤维素降解菌相比于其他来源纤维素降解菌具有更安全的特性,但相比于瘤胃来源的纤维素降解菌,其对木质纤维素的降解能力较弱,所以瘤胃源纤维素降解菌是最好的资源库㊂4结论本研究共筛选出6个降解纤维素能力较强的株系,其中来源于瘤胃液的最强,肉牛粪便次之,蝗虫最弱,为高效纤维素降解株系筛选提供借鉴㊂其中降解能力最强的株系为L7其F P A,C M C,C1和β-G a s e的酶活性分别为4.28,1.89,5.57,2.30 U㊃m L-1㊂筛选得到高效降解纤维素株系为纤维素的处理与加工及饲料生产等提供了微生物资源㊂参考文献[1]李振华,康相涛,刘记强,等.饲用纤维素酶的研究进展及应用现状[J].河南畜牧兽医(综合版),2008(5):10-11 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n v i r o n m e n t a lS c i e n c e a n dB i o/T e c h n o l o g y,2020,19(3):621-648 [25]周泽,付卫刚,雷杨,等.羊粪中纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及评价[J].草地学报,2023,31(11):3535-3542(责任编辑刘婷婷)8521。
A 牛粪纤维素降解菌的筛选与初步鉴定_牛明芬
牛明芬，武肖媛，于海娇，等．牛粪纤维素降解菌的筛选与初步鉴定［J ］．江苏农业科学，2014，42（11）：393－395．doi ：10．15889/j．issn．1002－1302．2014．11．139牛粪纤维素降解菌的筛选与初步鉴定牛明芬，武肖媛，于海娇，梁文娟，王思博（沈阳建筑大学市政与环境学院，辽宁沈阳110168）摘要：通过“富集—初筛—复筛”流程，筛选出4株对纤维素有强降解能力的菌株，分别标记为TG 1、HN 1、HP 2、P 3。
对4株菌的纤维素酶活性进行了定量测定；通过生理生化试验，初步鉴定TG 1为放线菌，HP 2为地衣芽孢杆菌，P 3、HN 1为枯草芽孢杆菌。
关键词：纤维素降解菌；分离；纤维素酶活；鉴定中图分类号：Q939．9文献标志码：A 文章编号：1002－1302（2014）11－0393－02收稿日期：2014－03－25基金项目：辽宁省沈阳市科技攻关项目（编号：F －13－144－3－00）。
作者简介：牛明芬（1967—），女，辽宁本溪人，博士，教授，主要研究方向为固体废弃物资源化利用。
E －mail ：836580304@qq．com 。
通信作者：武肖媛，硕士研究生，主要研究方向为固体废弃物资源化利用。
E －mail ：827510061@qq．com 。
随着我国养牛行业的发展，牛存栏量也逐年增加。
根据调查显示，2009年我国奶牛存栏量达1260万头，2010年的存栏量达1420．1万头。
存栏量为200 2000头的肉奶牛基地，每天可产生的牛粪在5 50t ［1］。
未经处理的牛粪随意堆放，不仅造成了人们的视觉污染，而且对大气、土壤、水造成了很大污染。
相较于其他畜禽粪便，牛粪含纤维素、半纤维素等有机难降解物质比较多，自然降解时间长［1－2］。
针对牛粪中含纤维素较多且自然降解时间长的特点，本试验将降解纤维素能力强的菌株分离筛选出来，以期用于后续的牛粪堆肥试验缩短牛粪堆肥发酵时间。
奶牛粪便纤维素酶解糖化工艺研究的开题报告
奶牛粪便纤维素酶解糖化工艺研究的开题报告标题：奶牛粪便纤维素酶解糖化工艺研究研究背景：随着生物质能源和可再生能源的重要性不断提升，通过生物质转化生产生物能源成为一种热门的研究方向。
而生物质转化的过程中，纤维素的酶解和糖化是关键技术。
目前很多研究都集中在利用农作物秸秆等植物生物质进行纤维素酶解糖化的研究，但对于奶牛粪便这种畜禽排泄物的纤维素酶解糖化研究相对较少。
研究内容：本研究旨在探究奶牛粪便纤维素的酶解糖化工艺，包括酶解条件的优化和糖化条件的探究。
具体研究内容如下：1. 提取奶牛粪便中的纤维素并进行酶解研究，考察不同pH值、温度和酶种对纤维素酶解效果的影响。
2. 确定酶解条件后，对酶解后得到的物质进行糖化，考察不同pH 值、温度和时间对糖化效果的影响。
3. 对糖化产物进行分析，包括各种糖类的含量、生产的乙醇等。
研究意义：本研究开展奶牛粪便纤维素酶解糖化工艺研究，可以从另一个角度探究生物质能源的开发利用。
同时，通过研究和优化纤维素酶解和糖化条件，可以提高生物质转化利用的效率和经济性，有助于解决能源和环境的问题。
研究方法：1. 提取奶牛粪便中纤维素：采用酸水解法提取纤维素。
2. 酶解实验：（1）对不同菌种的纤维素酶进行筛选；（2）研究不同pH值、温度下纤维素酶解效果的影响。
3. 糖化实验：（1）采用葡萄糖为控制实验组织进行糖化；（2）考察不同pH值、温度和时间对糖化效果的影响。
4. 分析糖化产物：（1）高效液相色谱法（HPLC）分析各种糖类的含量；（2）气相色谱法（GC）分析乙醇产量。
预期成果：1. 确定奶牛粪便纤维素的酶解和糖化条件。
2. 研究得到奶牛粪便纤维素的酶解和糖化产物组成及产量。
3. 对奶牛粪便纤维素酶解糖化工艺进行优化，提高生物质转化利用的效率和经济性。
参考文献：1. Jin, Y., Han, S. Y., Zheng, S. P., et al. (2012). Biochemical characterization of a novel endoglucanase from cow dung compost metagenome with high activity and stability over a broad range of temperature and pH. Bioresource Technology, 110, 214-220.2. Shuai, L., Yang, Q., Zhu, J. Y., et al. (2014). Comparative study of SPORL and dilute-acid pretreatments of spruce for cellulosic ethanol production. Bioresource Technology, 169, 403-411.3. Lin, C. S., Luque, R., Clark, J. H., et al. (2012). Biofuels: Environmental consequences and interactions with changing land use and food production. Chemical Society Reviews, 41, 6240-6261.。
牛粪中纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件优化研究
牛粪中纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件优化研究高云航;张喜宏;王巍;王艳秋;马红霞;娄玉杰【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(41)3【摘要】本试验通过对牛粪进行富集培养、分离纯化,利用刚果红染色法和摇瓶复筛得到1株产酶活较高的纤维素分解菌N12,经形态观察、生化鉴定和16S rRNA 遗传学鉴定为芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),并对其产酶条件进行了初步优化.结果表明,菌株N12以0.5％玉米粉为碳源、1％酵母粉为氮源、初始pH3.0、42℃摇瓶培养54 h产酶活最高.【总页数】6页(P151-156)【作者】高云航;张喜宏;王巍;王艳秋;马红霞;娄玉杰【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林长春 130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春 130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春 130118;吉林省长春净月高新技术开发区永兴街道办事处,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春 130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春 130118【正文语种】中文【中图分类】S852.6【相关文献】1.大曲产酯化酶芽孢菌的分离鉴定及其发酵条件优化研究 [J], 侯小歌;张杰;孙忠科;李童;李学思;闫培勋;胡炳义2.白蚁肠道木质素及纤维素分解菌的分离鉴定及产酶条件优化 [J], 高云航;王巍;李秋菊;马红霞;娄玉杰3.牛粪中纤维素降解菌的分离鉴定及其产酶研究 [J], 汪学军;闵长莉;韩彭磊;张丽君4.鹅肠道纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件的优化 [J], 高云航;张喜宏;刘佳丽;战利;李长亮5.1株高效低温纤维素分解菌的分离鉴定及产酶条件优化 [J], 高云航;勾长龙;王雨琼;娄玉杰;赵晗旭;马红霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
奶牛粪便纤维素降解菌的筛选及产酶条件研究的开题报告
奶牛粪便纤维素降解菌的筛选及产酶条件研究的开题报告一、选题背景与意义纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，是植物体生长的重要支架。
奶牛在消化食物时会产生大量的粪便，其中含有大量的纤维素。
随着人们生活水平的提高和饲养管理的改善，奶牛数量不断增加，奶牛粪便处理也成为一个重要问题。
近年来，利用微生物降解奶牛粪便中的纤维素变成了一种较为有效的处理方法。
然而，目前有关降解奶牛粪便中纤维素的微生物菌种和产酶条件的研究较少，因此对其进行深入研究具有一定的理论和实践意义。
二、研究内容和目的2.1 研究内容（1）筛选奶牛粪便中纤维素降解菌株并进行鉴定；（2）确定奶牛粪便降解纤维素的最适产酶条件；（3）探究纤维素降解机理。
2.2 研究目的（1）筛选出高效的奶牛粪便中纤维素降解菌株；（2）明确最适宜的产酶条件，为推广和应用提供技术支撑；（3）探究纤维素降解机理，为深入了解其降解过程提供理论依据。
三、研究方法3.1 奶牛粪便纤维素降解菌株的筛选采用平板筛选法和液体培养筛选法结合的方法，将从奶牛粪便中分离到的菌株进行纤维素降解效率测试，筛选出高效的菌株，并进行形态学和生化特性鉴定。
3.2 奶牛粪便纤维素产酶条件的确定采用单因素实验和正交试验等方法，研究影响奶牛粪便纤维素产酶的因素，包括酶种类、温度、pH值、培养时间、培养基配方等，从而确定合适的产酶条件。
3.3 纤维素降解机理的探究采用酶解产物分析、质谱分析、基因克隆等方法，对纤维素降解过程中产生的酶解产物进行分析，并探究降解过程的机理。
四、论文组成和进度安排4.1 论文组成（1）绪论：研究的背景和意义、研究内容和方法、国内外研究现状、论文的依据和理论基础；（2）奶牛粪便纤维素降解菌株的筛选和鉴定；（3）奶牛粪便纤维素产酶条件的确定；（4）纤维素降解机理的探究；（5）总结与展望。
4.2 进度安排第一年：研究内容的确定、文献调研、菌株筛选和鉴定等工作；第二年：产酶条件的优化、纤维素降解机理的探究等工作；第三年：论文撰写和口头答辩。
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键
词： 奶牛粪便 ； 维 素素 降解 菌 ； 诱 变 选 育 ；筛 选
文 献标 志 码 ：Ａ
中图 分 类 号 ：Ｑ９ ３ ９ ． ９ ６
近年来 ，有学者 提 出 ，可利用 纤维 素降解 菌将奶 牛粪 便 中的纤维 素转 化为 还原糖 来发 酵生产 乙醇 ｌ ＿ 】 ］ ． 这一 方法 为合 理利用 畜禽粪 便提 出了一 条新 思路 ， 不 仅可 以减 少奶 牛粪 便 带来 的环 境 污染 问题 ，增加 养 殖
行 了奶 牛粪便 纤维 素降解 菌菌种 的选 育 ， 并经 过滤 纸条 复筛 、诱变 育 种等 过程 ，筛 选 出降 解率 相 对较 高 的 菌 株 ，以期 为奶 牛粪便 纤维 素 的乙醇化 提供切 实可 行 的依据 ．
１ 材 料 和 方 法
１ ． １ 土 样 采 集
分 别在 重庆 市北碚 区某奶 牛 场排水 口处 、 北碚 区某林 地及菜 地 ， 取地表 以下 ２ ～８ ｃ ｍ 的土 样各约 ５ ０ ０ ｇ 作为 菌种筛 选土 样．
户 收入 ，同时也是解 决未 来能 源和 资源短 缺 问题 的一 条重 要途径 ］ ．
然而， 奶 牛粪 便 中 氮 含 量 高 达 ０ ． ９ ０ ，即 使 采 用 不 同 方 式 的预 处 理 后 ，氮 含 量 仍 可 达 ０ ． １ ３ ％ ～
０ ． ８ １ ， 远 高于其他 秸秆 类 的纤维质 材料 （ 麦秸 含 ０ ． ４ ０ ，云杉木 含 ０ ． ２ ０ ％） ＿ ４ ］ ．而且 ， 奶 牛 养殖 过程 中使 用 的饲料 添加 剂和兽 药 ， 会 以代谢产 物 和原药 的形式 在粪 便 中残 留．过高 的氮 含 量及 残 留 的添加 剂 与兽 药
１ ． ２ 实 验 方 法
１ ． ２ ． １ 纤维 素降 解菌的 筛选
１ ）初筛 ： 在 无菌操 作条 件下 ， 取一 定量 １ ０ 土壤 稀释液 接种 于初筛 培 养液．并于 ２ ８℃ 、 １ ４ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ条 件下 培养 ３ ｄ ， 涂 布于 刚果红分 离 培养基 平板上 ， 筛 选 出单个 菌落 ， 斜 面保 菌．
１ ３ ５
度 及 降解程 度 ，以及 测定 的纤 维素 酶活来 判 断菌株 的酶 活性 高低 ． １ ． ２ ． ２ 奶 牛 粪便 纤 维素 降解 菌的 筛选
将 复筛 出 的菌 株 接入 含 液 体 发 酵 培养 基 中 ，于 ３ ０℃ 、１ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ条 件 下振 荡 培 养．将种 子 培 养 液 以 ５ 的接种量 接种 于含 预处 理奶 牛 粪便 的 固体发 酵 培养 基 中 ， 并在 ３ ０℃下 培养 ，每隔 ３ ｄ测 定各 处理 的纤 维 素含 量 ，根 据纤维 素 降解 率 ［ ６ 选 出降解奶 牛粪 便纤 维 素的菌 株．
第３ ８卷 第 ３期
Ｖｏ １ ．３ ８ Ｎｏ ． ３
西 南 师 范 大 学 学 报 （ 自然科 学版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｓ ｔ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
摘 要 ：针对 奶 牛 粪 便 中 的纤 维 素 ， 进 行 了高 酶 活 纤 维 素 降 解 菌 的 筛 选 ， 从 奶 牛 场 排 水 口处 土 壤 、林 地 和 菜 园 土 壤 中
共分离得到 １ ９株 纤 维 素 降解 菌 ，经 过 滤 纸 条 复 筛 和奶 牛粪 便 纤 维 素 降解 率 的测 定 ，选 出 ３ 株 降解 率 相 对 较 高 的 菌
２ ）复筛 ： 将 初筛 菌株接 入滤 纸条 培养基 中 ， 于３ Ｏ℃ 、１ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ条件下 振荡 培养 ，根据 滤纸 条 降解 速
①
收 稿 日期 ：２ ０ １ ２ —０ ３—０ ］
基 金 项 目 ：重 庆 市 科 委 自 然 科 学 基 金 计 划 资 助 项 目 （ ＣＳ Ｔ Ｃ， ２ ０ ０ ６ Ｂ Ｂ ７ ３ ３ ５ ） ，西 南 大 学 基 本 科 研 业 务 费 专 项 资 金 资 助 项 目
２ Ｏ １ ３年 ３月
Ｍａ ｒ ． ２ Ｏ１ ３
文章编号 ： １ ０ ０ ０ —５ ４ ７ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３— ０ １ ３ ４ 一 Ｏ ４
奶 牛粪 便 纤 维 素 降解 菌 的筛选 ①
马 雪姣 ， 李 静 ， 徐 静 静 ， 杨 力
１ ． 西南大学 资源环境学院 ， 重庆 ４ ０ ０ ７ １ ６ ； ２ ．重 庆 水 利 电力 职 业 技 术 学 院 ， 重庆 ４ ０ ２ １ ６ ０
（ ＸＤＪ Ｋ２ ０ ０ ９ Ｃ０ ６ ４ ） ．
作 者 简介 ：马雪 姣 （ １ ９ ８ ６ 一 ） ，女 ，河 南巩 义 人 ，硕 士研 究 生 ，主 要 从 事环 境 工 程 研 究 ． 通 信 作者 ： 李 静， 副教授 ， 博 士 ，硕 士 生 导 师．
第 ３期
马雪姣 ，等 ：奶 牛粪便 纤 维素 降解 菌的 筛选
等 物质会 严重 影 响奶 牛 粪 便 纤 维 素 降 解 菌 的 生 物 活 性 ，使 得 普 通 的 纤 维 素 降 解 菌 难 以分 解 利 用 奶 牛 粪 便 ］ ．因此 ， 要实 现奶 牛粪便 的 乙醇化 ， 高 活性 的奶 牛粪 便纤 维 素 降解 菌 的筛 选 变得 尤 为重 要 ．本研 究 进
株， 分别为 Ｆ ２ ， Ｆ ３和 Ｆ ９ ．对 其 进 行诱 变选 育 ， Ｆ ３ ． １ ． ６和 Ｆ ９ ． １ ． ８酶 活 提 高较 大 ， 其Ｃ ＭＣ酶 活 和 滤 纸 酶 活 分 别 提 高 了４ ７ ． ６ ９ ， ４ ７ ． ５ １ 和５ ３ ． ４ １ ， ５ Ｏ ． １ ７ ％．继 代 培 养 后 比 较 可 得 ，Ｆ ９ ． １ ． ８传 代 稳 定 性 较 好 ，其 Ｃ ＭＣ 酶 活 和 滤 纸 酶