纤维素降解菌的分离与鉴定..

试验原理
• 纤维素酶的来源 自然界中存在大量可以产生纤维素酶的微生物 ，真菌、细菌、放线菌等。 咀纤维素为食的反刍动物，牛，驴等，其胃肠 内就存在大量的产纤维素酶的微生物。 一些昆虫，如白蚁的肠道也可咀产生纤维素酶。 来源不同的纤维素酶其特点也不尽相同，由此 构成了各具特色的纤维素降解酶系。
试验原理
初筛
以下各步骤均在无菌条件下进行。 （1）称取土壤样品10 g，倒入含有90 mL水和玻璃珠的三角 瓶中振荡5 min，使土样充分打散。（注意：等水冷却了 再倒入土样。） （2）取 5 mL悬液加入盛有 50 mL富集培养基 (纤维素琼脂培 养基 )的三角瓶,在 28 ℃和 150 r/min下, 振荡培养 3~ 5 d后 移取 5mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继 续培养。
• 真菌所产的纤维素酶特点： 胞外酶、往往酶活较高、易于收集检测，对于天然纤维索 的降解也有较好效果。以丝状真苗中的木霉属作为产酶真 菌被研究最为透彻。 • 细菌所产的纤维素酶特点： 纤维素酶量较少，大多为胞内酶，对于天然纤维素的降解 能力也较弱。细菌中如芽孢杆菌可以产生碱性纤维素酶。 • 放线菌所产的纤维素酶特点： 往往具有耐碱的特性，部分菌株产生的纤维素酶活力也较 高，结构简单。
• 培养基原理 ◆纤维素培养基 作为初筛时的富集培养基，得到各种类型的纤维素降解 菌。 ◆纤维素刚果红培养基 刚果红培养基能使产纤维素酶的菌株在平板上形成水解 圈。 纤维素是由葡萄糖残基以 β-1, 4糖苷键连接而成的线状大 分子物质, 纤维素水解酶能水解此糖苷键, 使其变为纤维二 糖和葡萄糖,水解后的糖类同刚果红染料形成红色沉淀,颜 色浓郁,厚重,所以此水解圈在菌落生长过程中清晰可见,不 易发生错误识别。
培养基的配置和分装
纤维素琼脂培养基： • (NH4)2SO4 2 g , • MgSO4· 7g， • H2O 1g, • NaCl 1g, • CaCO3 2g, • 水 500mL ,
• 121 ℃ 灭菌20 min，倒平板后,盖上与平板大小一致的无菌滤纸
（注意：滤纸要用稀醋酸浸泡一夜 ，用碘液检查是否有淀粉 ，若已去除完全 ， 则用 2％苏打水冲洗至中性，干热灭菌 后备用 ）。
环境中纤维素降解菌的筛选和初步鉴定
生物技术班
实验目的 实验原理 实验器材 实验步骤 实验结果与分析
实验目的 • 从环境中筛选出能降解纤维素的菌株 • 初步鉴定出菌株所属的类型
试验原理
• 纤维素酶酶系组成及降解机理 纤维素酶酶系包括内切葡聚糖酶(Cx酶）、外切 葡聚糖酶(Cl酶)，[来自真菌简称CBH，来自细菌简 称Cex)]和B．葡聚糖苷酶l，也称纤维二糖酶，简 称BG)。滤纸酶(FPase)活力代表了三种酶协同作用 后的总酶活力。 纤维素是有许多葡萄糖分子通过β-1，4一糖苷 键连接起来的大分子物质，对其的水解需要上述 三种酶的共同作用。酶的种类完整性、各种酶之 间的比例关系等都会影响到纤维素酶的整体活力 。
（3）分别挑选出透明圈大的菌落,即为分解能力较强的菌
纤维素降解菌的纯化
(1)在无菌条件下，挑取单菌 落的孢子“之”字划线于 试管的斜面上，在上方ຫໍສະໝຸດ Baidu 上一条滤纸。 (2)将试管置于28～30oC的培 养箱中培养一周。
形态观察与鉴定
直接观察：在培养基中，整体观察菌落特征及其颜色，确 定其所属类型。
分离
（1）无菌条件下，取富集后的培养液将土壤悬液稀释成101~10-7系列浓度。
（2）分别用移液器精确地吸取各稀释菌液0.2 ~0.3 mL，对号 先后涂布于编好号刚果红培养基平板,（涂布时涂布棒要从 浓度小的梯度开始，将加入平板培养基上的土壤稀释液在 整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌）。置于 30 ℃ 培养箱中，倒置培养一周。
实验结果与分析
• 在纤维素分解菌的筛选过程中, 本试验采用了2种 分离纤维素分解菌的培养基。因土壤中纤维素降 解菌的含量较少，所以最初采用纤维素琼脂培养 基作为富集培养基，此培养基适合绝大多数纤维 菌的生长和繁殖。之后，才用纤维素刚果红培养 基，可以快捷便利的筛选出降解能力强的菌株， 同时实验现象明显，不易出错。
印片观察：取一小块带培养基的菌落正放于载玻片上，然 后用另一载玻片加热后按压，注意不要滑动玻片。取上面 的印片，有印迹的一面朝上，在 40x 物镜下观察。如需染 色，先将有印迹的载玻片通过火焰2～3次固定，再用美蓝 染色观察（染色 1 min ，水洗，干燥后观察），对细菌可 进行革兰氏染色, 在显微镜下观察其菌株形态, 并初步鉴定 其种类。
物品准备
• 盛有9 mL水的试管，6支（试管用胶塞塞住） • 在容积为250 mL的三角瓶内加入玻璃珠，以盖住 瓶底为宜（作用：打散土壤结块），再加入90 mL 蒸馏水，1瓶 • 试管斜面 8支 • 平板9个 • 1 mL枪头盒，1盒 • 涂布器8支 • 滤纸9个
培养基的配置和分装
• • • • • • • • • 纤维素刚果红培养基： K2HPO4 0.5g, CMC- N a 1. 88 g , M gSO4· 7H2O 0 . 25 g , 明胶 2g, 刚果红 0. 2 g , 琼脂 14 g , 土壤浸出液 100mL（灭菌后加） , H2O 900mL, pH值为 6~ 7。
试验原理
试验材料
• 培养基：纤维素培养基、纤维素 刚果红培养基 • 样品：含腐叶的土壤。 • 仪器及其他用品：酒精灯、载玻片、盖玻片、显 微镜、滴管、试管、培养皿、锥形瓶、枪头、涂 布器、滤纸。
1.培养基的配制及分装
2. 物品准备 3. 灭菌
实验步骤
4. 铺试管斜面，倒平板 5.初筛 6. 分离 7. 纤维素降解菌的纯化 8. 形态观察及初步鉴定