HRP辣根过氧化物酶稳定剂
辣根过氧化物酶(hrp)标记抗体的简易方法
辣根过氧化物酶(hrp)标记抗体的简易方法
过氧化物酶(hrp)标记抗体是用来表征可以探针凝集反应的特异性抗体，在临床实验研究中的应用得到广泛的认可。
它的应用范围十分广泛，比如体液免疫学分析、组织学病理学分析以及疾病诊断、计量检验研究等等。
简单说，hrp标记抗体是把过氧化物酶hrp与抗体联合在一起，通过特异性抗体与被检物质（抗原）之间的可凝集反应得以应用，通过hrp的过氧化反应，这种反应被放大从而易于检测（可见部分检测反应使用对抗联系）。
hrp标记抗体的简易方法主要包括直接标记（direct labeling）和间接标记（indirect labeling）两种方法。
直接标记就是直接在抗体上表征过氧化物酶，而间接标记则是用一种不活性的人工抗原（Artificial antigen）表征过氧化物酶，再将其与抗体结合之后实现标记。
不同的是，直接标记方式要求抗体具有足够的处理过氧化物酶hrp 的敏感性和穩定性，另外在反应过程中要确保hrp能均匀分布在抗体表面，而间接标记有利于hrp的均匀分布，能够有效改善抗体的表位，延长其在反应中的有效性。
虽然hrp标记抗体分析系统在实验室研究中受到广泛应用，但是其具体的标记方法却不断地发生变化。
为了确保标记过程的准确性，要首先确定优选的hrp、hrp连接剂和标记抗体，并根据原料质量和实验程序做出必要的改变以保证标记抗体的有效性和稳定性。
其次，在进行标记前要检查原料和实验设备是否合适，确保反应条件的正确性，并在延迟反应过程中加入缓冲剂和阻垢剂以延长抗体、hrp以及hrp连接剂的稳定性。
最后，建议实验人员按照规定的步骤进行实验，以保证结果的可靠性，并且确保标记抗体在模板或探针过程中不会造成污染。
HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所
获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重
大损失，是目前最常用的方法。
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的
酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，
(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿
色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前
者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺
酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
2. 标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅
酶标记抗体
酶标记抗体
产品概述：
酶标记抗体,是一类广泛用于生物学和医学科学的许多领域，具有高特异性、高敏感性和安全的免疫化学试剂。
目前较为常用的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体就是其中的一种，它是经过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP）标记在抗体IgG分子上而制成的HRP－抗体结合物。
我公司向用户提供的各类辣根过氧化物酶标记产品均为本公司自主研发的产品，HRP 购于美国SIGMA公司的产品，根据本公司建立的目前较先进的过碘酸钠氧化法标记技术而成。
每种成品已加入一定浓度的BSA作为稳定剂。
产品的工作浓度根据方法不同而别，用前最好-20℃冻存，避免反复冻融。
应用范围：
应用于抗原决定族的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定性及定位分析测定等。
工作中应注意的问题：
1、包被抗体或抗原不适，易产生阳性值较小，或产生变异，即跳管现象。
2、用抗血清不纯化，或纯化程度太低的抗体包被，则阳性值较小，或没有阳性梯度。
3、封闭不好或标记物过浓可产生对照较高。
主要性能：
每只0.1ml液体，内含IgG约1mg/ml，1% BSA，0.01%庆大霉素。
-20℃保存，稳定期一年。
4℃保存约3～6个月，4℃可30天左右。
稀释液为：0.01mol/L pH7.4PBST。
工作效价：
ELISA法：1：5000～10000
免疫印迹法：1：500～5000。
辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法
HRP 的NaIO4标记法一．原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。
在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。
醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。
Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。
HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。
Note:1.产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。
2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。
可通过控制NaIO4的量或控制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。
当糖基的氧化度为20～25%时，有较高的结合效率。
3.为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。
光照可加快过碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。
4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。
有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。
二．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。
抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。
而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。
当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。
统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。
三．酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。
酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）1.称取HRP x mg。
当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮解。
称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶解HRP的器具中。
在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。
辣根过氧化物酶（HRP）标记蛋白的方法
辣根过氧化物酶（HRP）标记蛋⽩的⽅法HRP 的NaIO4标记法⼀．原理：HRP为⼀种糖蛋⽩（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。
在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。
醛基在碱性条件下可与被标记物的⾃由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH —），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。
Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。
HRP的NaIO4标记法所⽤氧化剂为NaIO4，还原剂采⽤NaBH4。
Note:1.产物A不稳定，故⽤NaBH4还原为产物B。
2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产⽣⾜够量的醛基，如氧化过度，醛基可被进⼀步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。
可通过控制NaIO4的量或控制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。
当糖基的氧化度为20～25%时，有较⾼的结合效率。
3.为了防⽌HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。
光照可加快过碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。
4.反应的最后⼀步⽤NaBH4来还原的反应⽐较剧烈，对酶活性的影响⽐较⼤。
有时可考虑在酶与糖基之间添加⼀个⼿臂，如联苯胺反应。
⼆．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。
抗原与HRP的⽐值通常为摩尔⽐1：1。
⽽抗体与HRP的⽐值通常为质量⽐1.6：1。
当然，这只是⼀个基点，可根据需要上下调整⽐率。
统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。
三．酶的氧化（全过程避光，操作中⼒防污染。
酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）1.称取HRP x mg。
当HRP从-20℃取出后，⼀定要平衡到室温，否则HRP冻⼲品易潮解。
称量时不要⽤称量纸，不要⽤⼯具取HRP，应将HRP直接⼩⼼地倒⼊要⽤来溶解HRP的器具中。
在倒HRP时，不要在风⼝（如电风扇风，⾃然风，呼吸）操作，因为HRP冻⼲品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。
HRP稳定剂
Tel:+86 571 2882 8608 Toll Free: 400 6721 600(China Only)Fax:+86 571 2882 8618 Website: 辣根过氧化物酶（HRP）偶联物稳定剂产品规格：Technical Service: service@ MultiSciences Biotech Co,. Ltd To place an order: order@ 1ST0011 辣根过氧化物酶（HRP）偶联物稳定剂 2mlST0012 辣根过氧化物酶（HRP）偶联物稳定剂 10mlST0013 辣根过氧化物酶（HRP）偶联物稳定剂 100ml简介：辣根过氧化物酶（HRP）是普遍用于免疫检测的一种酶。
本稳定剂能够显著延长HRP偶联物的有效期、并增加信号的强度。
加入该稳定剂，有利于延长HRP偶联物的稳定性，即使在HRP偶联物较低浓度下，也能够有效保护其活性成份，无需每次稀释的繁琐操作，且结果更加稳定可靠。
推荐用法：本稳定剂可用于各种需要HRP偶联物的实验中，如ELISA, Western Blotting, Immunohistochemistry等。
该稳定剂是一种即用的溶液，可作为HRP偶联物的储存液或稀释液，将HRP偶联物用该溶液稀释即可。
产品安全和操作：该产品根据HCS（Hazard Communication Standard）标准认定，无毒。
不要直接与皮肤和眼睛接触。
如不慎接触，请用大量清水冲洗。
贮存和稳定性：贮存于2~8度。
该稳定剂已用0.22um滤膜过滤，溶于无菌的双蒸水，不含动物成分和蛋白。
其防腐剂成分无毒、无汞。
避免冷冻保存。
示例：实时稳定性研究本过氧化物酶稳定剂对于HRP偶联物的长期稳定性本辣根过氧化物酶偶联物稳定剂可用于免疫分析，如普通的sandwich ELISA系统中，可长时间保存稀释后的HRP标记抗体，保留其活性。
上图显示了在室温或4度条件下，有稳定剂保护的HRP偶联物（1:10000稀释）在9个月后的活性依然能保留90%以上。
抗体的标记——辣根过氧化物酶(HRP)32
抗体的标记修饰抗体可以通过不同的化学试剂交联到酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶）、荧光染料（FITC、PE、APC等）、生物素（Biotin）、胶体金等。
一、抗体/蛋白的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体标记HRP最为经典的方法为NaIO4氧化法，先将HRP糖基氧化成醛基，醛基与抗体的-NH2反应生成希夫氏碱反应，抗体分子与HRP分子形成稳定结构。
标记的时候一般按照抗体分子与HRP分子摩尔比1:4的比例进行标记，此时,两者的质量约为1:1。
1. 抗体/蛋白的HRP标记（NaIO4氧化法）标记以2mg抗体为例。
1.1 抗体/蛋白的处理待标记抗体/蛋白在50mM碳酸盐缓冲液(0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6) 中透析，其间换液2次，抗体/蛋白浓度调整为2mg/ml；或者将高浓度的抗体用0.5M碳酸盐缓冲液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3 ,pH9.6)稀释到2mg/ml，如果原抗体/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂，必须透析除去。
1.2 HRP酶的氧化1.2.1 称取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100 μL ddH2O 中。
1.2.2 称取NaIO4 21mg，溶于1 mL的ddH2O中，吸取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min，此时溶液为绿色。
（注意：此后的操作均在避光条件下进行。
）1.2.3 吸取２µL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min，此时溶液为褐色。
1.3 抗体的标记1.3.1 将氧化好的HRP溶液直接加入到已处理好的抗体/蛋白溶液中，室温反应２h。
1.3.2 称取0.4mg的NaBH4，溶解于20µL的ddH2O中，全部加入上步反应液中，4℃静置2h，每30min摇动一次。
1.3.3 PBS(pH7.2)透析过夜，标记液中加入体积比30%～50%的甘油，混匀后置于-20℃保存。
用于辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定保护剂,其制备方法及试剂
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011042325.8(22)申请日 2020.09.28(71)申请人 北京森康维特生物技术研究所地址 101499 北京市怀柔区杨宋镇凤翔一园23号(72)发明人 武子函 黄思斯 季志华 张雨 刘伯华 杨鹏 (74)专利代理机构 北京丰浩知识产权代理事务所(普通合伙) 11781代理人 李学康(51)Int.Cl.G01N 33/535(2006.01)G01N 33/58(2006.01)G01N 33/543(2006.01)(54)发明名称用于辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定保护剂，其制备方法及试剂盒(57)摘要本发明涉及体外检测领域，具体讲，涉及一种用于辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定保护剂，其制备方法及试剂盒。
该稀释稳定保护剂中含有缓冲液、防腐剂、3,3',5,5'‑四甲基联苯胺、二甲基亚砜和芳基硼酸。
本发明的稳定保护剂用于保存工作浓度的辣根过氧化物酶标记抗体，使工作浓度的辣根过氧化物酶标记抗体可置2～8℃环境下存放，并可长期保持辣根过氧化物酶标记抗体的催化活性以及抗原结合特异性。
权利要求书1页 说明书11页 附图1页CN 112285342 A 2021.01.29C N 112285342A1.一种用于辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定保护剂，该稀释稳定保护剂中含有缓冲液和防腐剂，其特征在于，所述稀释稳定保护剂中还含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺、二甲基亚砜和芳基硼酸。
2.根据权利要求1所述的稀释稳定保护剂，其特征在于，每1000mL所述稀释稳定保护剂中含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺2～10μM、二甲基亚砜0.2～2mL；优选的，每1000mL所述稀释稳定保护剂中含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺6μM，二甲基亚砜1.2mL。
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使用注意事项： 1. 外观：白色至淡黄色结晶。 2. 本产品与大多数常用缓冲液系统（如磷酸盐、Tris、醋酸盐、Borate、HEPES 等缓冲液）相容。 3. 本产品可与 1-2 mg/ml BSA 配合共同使用。
按照终浓度为0.1%-0.5%(w/v)配制稀释液使用即可。
使用限制： 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新： 贝博会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的 版本更新。使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说 明书，可能是不同的版本。 需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全： 使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如 果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。
● 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
技术支持： 产品技术问题可发邮件至 bestbio@ 咨询。 如果您有任何关于产品性能或者新应用和技术的建议，欢迎您随时联系我们。
产品简介： 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)是应用最广泛的一种标记物，但其在低浓
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● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。
质量控制： 贝博对每批产品进行严格测试以确保产品质量一致。
知识产权： 贝博 TM BBproExtraTM 系列试剂盒及其使用方法包含专有技术。
注意事项： ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管 底，避免开盖时试剂损失。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
度下不稳定，极易失活。 贝博 HRP 酶稳定剂对 HRP 酶标试剂有强大的保护作用，使稀释的 HRP 酶标试剂在极
低浓度下室温保存稳定 12 个月以上。该试剂与低浓度 BSA（1-2 mg/ml）协同作用，保护 作用更强。
加入贝博 HRP 稳定剂的酶在 47℃存放 3 天后，酶的相对活力为 90%。在室温长期存放 3 个月以后，酶的相对活力为 59%。
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产品说明书
辣根过氧化物酶稳定剂
货号：BB-3101
试剂盒储存条件： 室温保存。
试剂盒组成：
产品组成 试剂 A：HRP 酶稳定剂
使用说明书
有效期： 一年。
BB-3522-1 20g 1
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பைடு நூலகம்
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