辣根过氧化物酶标记
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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
酶制剂及其底物
◆ 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均 可作为标记用。但作为标记抗体用的
◆ 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2) 比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能
◆ 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶 为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶
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（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理
a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）
HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结 合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差 异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅 基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以 OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯 度。
法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含
糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗 体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺) 还原生成稳定的酶标记抗体。
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在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最 终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而 减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行 纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便， 但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果， 但费用较贵。
◆
HRP
◆
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
◆
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物
为
◆ 不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸) 早
◆ 期曾用于ELISA，T(邻 联
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（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置4 ℃, 2h。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。 （7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗 二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲 盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
◆ (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、 溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
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• 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯 酶容
• 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白 和棕
◆ 者可高4倍以上。
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• 另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3乙基苯并噻吡咯啉-6磺
• 酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均 好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
◆ 甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大， 而且
◆ 由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是： OPD
◆ (邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝 绿
◆ 色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比 前
• 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等
• 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于 水和
• 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和 275nm，一
• 般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的 酶RZ值应
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四
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操作步骤
（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。
（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO４溶液，混匀， 4℃静置30 分钟。
（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。（4）加入含 5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析， 4℃过夜。
实验原理
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（1）免疫标记技术
免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性 的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标 记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的 性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性 核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称 为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化 学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
• 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表 示酶活
• 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
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◆ HRP的催化反应需要底物过氧化氢资料(仅H供2参考O,不2当)和之处供，请氢联系体改正(。DH2)。供氢体多为无色的还原型
◆ 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢 体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
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b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化
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酶制剂及其底物
◆ 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均 可作为标记用。但作为标记抗体用的
◆ 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2) 比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能
◆ 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶 为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶
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（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理
a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）
HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结 合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差 异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅 基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以 OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯 度。
法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含
糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗 体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺) 还原生成稳定的酶标记抗体。
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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最 终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而 减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行 纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便， 但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果， 但费用较贵。
◆
HRP
◆
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
◆
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物
为
◆ 不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸) 早
◆ 期曾用于ELISA，T(邻 联
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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置4 ℃, 2h。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。 （7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗 二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲 盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
◆ (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、 溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯 酶容
• 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白 和棕
◆ 者可高4倍以上。
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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• 另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3乙基苯并噻吡咯啉-6磺
• 酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均 好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
◆ 甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大， 而且
◆ 由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是： OPD
◆ (邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝 绿
◆ 色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比 前
• 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等
• 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于 水和
• 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和 275nm，一
• 般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的 酶RZ值应
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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
操作步骤
（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。
（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO４溶液，混匀， 4℃静置30 分钟。
（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。（4）加入含 5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析， 4℃过夜。
实验原理
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（1）免疫标记技术
免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性 的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标 记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的 性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性 核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称 为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化 学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
• 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表 示酶活
• 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
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◆ HRP的催化反应需要底物过氧化氢资料(仅H供2参考O,不2当)和之处供，请氢联系体改正(。DH2)。供氢体多为无色的还原型
◆ 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢 体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化