辣根过氧化物酶制作过程
辣根过氧化物酶示踪电泳法
辣根过氧化物酶示踪电泳法是一种常用的分离和检测生物大分子的方法,在分子生物学、生物化学和医学等领域被广泛应用。
本文将从简单介绍辣根过氧化物酶示踪电泳法的原理和应用,逐渐深入探讨其在研究和诊断中的重要性和潜力。
一、基本原理和技术实施辣根过氧化物酶(HRP)是一种常见的内源性酶,具有较高的催化活性和稳定性。
它能与生物大分子(如DNA、RNA、蛋白质等)发生特异性结合,并通过催化染色反应产生可观测的颜色或荧光信号。
辣根过氧化物酶示踪电泳法利用这种酶的特性,结合电泳技术,实现对生物大分子的分离和检测。
在实验中,首先将样品经过适当的处理和纯化,使其具备较好的电泳性质。
将样品加在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上,施加电场后,生物大分子根据其大小、电荷等特性在凝胶中进行迁移。
随后,在凝胶上均匀涂敷含有辣根过氧化物酶底物的试剂液,使其与迁移的生物大分子相互作用。
通过合适的显色或荧光检测方法,观察样品中的目标分子的分离和定量分析。
二、应用领域和意义辣根过氧化物酶示踪电泳法在研究和诊断中具有广泛的应用。
以下列举几个典型的应用领域和意义:1.基因组学研究:辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于分离和检测基因组DNA中的特定序列。
通过其高灵敏度和特异性,可以快速鉴定目标基因、分析基因的结构和功能,并深入研究基因组的变异和表达情况。
2.蛋白质组学研究:辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于分离和检测蛋白质混合物中的目标蛋白质。
结合其他分离和鉴定技术,可以揭示蛋白质的功能、相互作用和调控机制,为疾病诊断和药物研发提供重要的信息。
3.临床诊断:辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于检测体液中的特定分子标志物,如肿瘤标志物、病毒RNA等。
通过对这些标志物的分离和定量,可以实现早期诊断和疾病监测,为临床治疗提供准确和可靠的依据。
4.食品安全检测:辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于检测食品中的有害物质或添加剂残留。
毒素、重金属、防腐剂等对人体健康具有潜在危害的物质可以通过该方法快速鉴定和定量,保障食品安全和公众健康。
hrp酶标记抗体原理
hrp酶标记抗体原理HRP酶标记抗体原理引言:酶标记抗体技术是一种常用的实验方法,用于检测和定量分析特定蛋白质或分子在生物样品中的存在量。
其中,HRP酶标记抗体是一种常用的酶标记抗体,其原理是将辣根过氧化物酶(HRP)与抗体结合,通过HRP催化底物反应,形成可见色素或发光信号,从而实现对目标分子的检测和定量。
一、HRP酶标记抗体的制备为了制备HRP酶标记抗体,首先需要纯化目标抗体。
通常采用免疫动物(如小鼠、兔子等)免疫目标抗原,然后从免疫动物的血清中提取目标抗体。
接下来,将提取的抗体与HRP酶进行化学共价结合,形成HRP酶标记抗体。
这种结合通常利用活化的巯基化合物(如二硫苯酚)与抗体上的游离巯基反应,将HRP酶与抗体的巯基共价连接。
二、HRP酶标记抗体的工作原理HRP酶标记抗体的工作原理是基于HRP酶的催化作用。
HRP是一种含铁的酶,具有较高的催化活性。
当HRP酶标记抗体与目标分子结合后,可以通过HRP酶的催化作用,将底物转化为可见色素或发光信号。
具体实验过程如下:1. 抗原与HRP酶标记抗体结合:将待检测的抗原与HRP酶标记抗体一起孵育,使它们发生特异性结合,形成抗原-HRP酶标记抗体复合物。
2. 清洗步骤:通过洗涤步骤去除未结合的抗原和HRP酶标记抗体,以减少背景信号。
3. 底物添加:向样品中加入相应的底物。
底物的选择取决于所使用的HRP酶标记抗体和检测目标。
4. HRP催化反应:HRP酶通过催化底物反应,产生可见色素或发光信号。
底物的催化反应产生的信号与待检测的目标分子的存在量成正比。
5. 信号检测:使用适当的检测设备,如酶标仪或荧光仪,对产生的可见色素或发光信号进行定量测量。
三、HRP酶标记抗体的应用HRP酶标记抗体广泛应用于免疫组织化学、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫印迹(Western blot)等实验中。
通过HRP酶标记抗体的催化作用,可以实现对特定蛋白质的定量分析和定位分析。
hrp辣根过氧化物酶显色原理
hrp辣根过氧化物酶显色原理
HRP(horseradish peroxidase,HRP)辣根过氧化物酶显色原理是基于HRP过氧化物
酶在受体膜中能将过氧化物类物质(如H2O2)分解为氧气(O2)和水(H2O),从而产生
可视化检测效果的原理。
本原理应用于多种生物分子定量或存在性的检测,是一种被广泛
使用的荧光免疫技术。
1、HRP的作用原理
HRP是一种过氧化物酶,它能将双氧水(H2O2)分解为氧气(O2)和水(H2O)。
当HRP和一种特定过氧化物结合在一起时,它被激活,可以将过氧化物分解为活性氧物质。
因此,HRP及其分解的活性氧物质可以抑制旁路反应,并有助于受体与真核和原核表达的
基因的联系,从而保持这些蛋白质的功能。
2、HRP显色技术的基本流程
HRP显色技术的基本原理包括以下几个主要步骤:样品处理,抗体的引物制备,受体
的预染示踪物和表面修饰;样品的诊断,互补双核糖核酸(cDNA)或cRNA富集,基因沉
淀和标记,实时荧光定量PCR(qPCR)检测、基因测序以及蛋白质组学等。
最后,HRP和
适当的荧光探针组合可以加以利用,从而探寻和分析抗原或受体的存在和可调控表达。
HRP显色技术具有检测特定原核和真核表达基因的能力、快速高效的离体检测和减少
误测试的能力。
同时,它可以快速检测多个基因表达水平的变化,并且可以定量同时探测
多个模式。
此外,HRP显色技术还可以检测复杂细胞培养液、细胞内和细胞外环境的变化。
辣根过氧化物酶
辣根过氧化物酶用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人[1]用来研究肾近端小管的早期吸收情况,将HRP注入鼠静脉内,离隔一定时间进行观察。
70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人[2],他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢(前角运动细胞)的HRP阳性标记颗粒。
1972年Lavai和Lavai et al[3]首次将HRP用于中枢神经系统。
他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。
1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。
将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索:里见肇及山本悌司等人进行的试验:是将HRP 注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒[1,5]。
Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。
至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。
只有Lowrence[7]将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒;此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。
Elfvin还将HRP注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。
国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联系, 而用HRP法从事周围神经系联系者则鲜见。
因此我们用HRP法追溯胃交感内脏传入第一级神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒和足三里穴区一级感觉神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒。
建立了HRP追踪围围神经联系的方法, 开展了对胃交感内脏神经元的节段性问题的探讨。
一种辣根过氧化物酶固定化方法[发明专利]
专利名称:一种辣根过氧化物酶固定化方法专利类型:发明专利
发明人:傅建越,陈萌,周思雨,季东鑫,金志敏申请号:CN202110646398.6
申请日:20210610
公开号:CN113215140B
公开日:
20220621
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明的目的在于建立一种新型的辣根过氧化物酶固定化方法,该辣根过氧化物酶的固定化方法,具有制备方法简单、固定化效率高、条件温和等优点,且显著提高了辣根过氧化物酶的稳定性。
本发明提供的新型的辣根过氧化物酶固定化方法是将改性的膨胀珍珠岩与甲基丙烯酰化的辣根过氧化物酶在紫外光辐射下形成光固化水凝胶。
本发明利用膨胀珍珠岩本身多孔疏松的特点,制成的水凝胶是一种多孔结构,两者相结合的方式使得底物能够自由在孔洞中反应,实现酶的多次利用,降低成本;而其他的水凝胶固定化酶技术不具备膨胀珍珠岩疏松多孔这个优势的。
申请人:浙江工业大学
地址:310014 浙江省杭州市拱墅区潮王路18号
国籍:CN
代理机构:杭州天正专利事务所有限公司
代理人:黄美娟
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western blot hrp酶不同酶促底物的原理
western blot hrp酶不同酶促底物的原理
Western blot是一种重要的免疫印迹实验技术,其中使用酶促底物对目标蛋白的信号进行放大和检测。
HRP(辣根过氧化物酶)是Western blot中常用的酶促底物之一。
不同酶促底物的原理如下:
HRP酶促底物原理:
1. 过氧化物酶(HRP)反应:HRP底物通常是一种无色化合物,例如TMB(三甲基苯胺基甲酸甲酯)或DAB(二氨基联苯胺)。
2. 底物氧化反应:在HRP存在下,TMB或DAB与过氧化氢(H2O2)反应产生氧自由基。
3. 显色反应:氧自由基进一步与TMB或DAB发生反应,产生有色化合物。
这个有色产物有机会与目标蛋白产生特定的水解反应,从而形成彩色的条带。
总结起来,Western blot中使用HRP酶促底物的原理是:HRP 底物与过氧化氢反应生成氧自由基,然后与TMB或DAB发生进一步反应,形成彩色的有色产物,从而检测目标蛋白的信号。
HRP基础知识
辣根过氧化物酶科技名词定义中文名称:辣根过氧化物酶英文名称:horseradish peroxidase;HRP定义:编号:EC 1.11.1.7。
一种糖蛋白,由于在辣根中该酶的含量很高,故名。
它以铁卟啉为辅基,在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。
通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。
所属学科:生物化学及分子生物学(一级学科) ;酶(二级学科)本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布目录[隐藏]简介制备简介制备[编辑本段]简介过氧化物酶,酶学分类号为EC 1.11.1.7。
该酶催化Donor+ H2O2--→Oxidize d donor+2 H2O。
过氧化物酶,通常来源于辣根(因此称辣根过氧化物酶),是临床检验试剂中的常用酶。
该产品不但广泛用于多个生化检测项目,也广泛运用于免疫类(ELISA)试剂盒。
过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分,对试剂盒的质量有重要影响。
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。
HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。
HRP由多个同功酶组成,分子量为4 0,000,等电点为PH3~9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。
酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。
H RP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以O D403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小,非酶蛋白就越多。
[编辑本段]制备实验原理过氧化物酶催化以下反应:2 H2O2 ─→ O2+2H2O这一类酶以铁卟啉为辅基,所以属血红素蛋白质类(hemeProt eins)。
过氧化物酶在生物界分布极广,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。
辣根过氧化物酶结构式
辣根过氧化物酶结构式【知识文章】辣根过氧化物酶结构式:探索辣根对身体的益处引言:在我们的日常饮食中,经常会遇到一种被称为辣根的调料。
辣根以其辛辣的味道和独特的香气为人所喜爱,不仅能为食物增添风味,还具有一定的保健功效。
辣根中的一种特定成分——辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是辣根所特有的一种酶类物质。
本文将深入探讨HRP的结构式、其在食物中的存在形式、以及辣根对身体的益处。
一、辣根过氧化物酶结构式及特点1. 什么是辣根过氧化物酶?辣根过氧化物酶是一种由植物辣根中提取得到的酶类物质。
它是一种特殊的催化剂,能够促进氧化反应的进行。
2. HRP的结构式HRP的结构式为C18H12N2O4S2,它由多个氨基酸残基组成,形成一个复杂的螺旋结构,其中包含有铁原子。
3. HRP在辣根中的存在形式HRP在辣根中以囊泡的形式存在,这种囊泡能够保护HRP不受外界环境的影响,并在适当的条件下释放HRP。
二、HRP在食物中的益处1. 抗氧化作用HRP具有很强的抗氧化能力,可以中和体内的自由基,减轻氧化应激对身体的危害,降低患病风险。
2. 抗菌作用HRP对一些细菌具有很强的杀灭作用,可以有效预防食物中的细菌感染,保障食品安全。
3. 免疫调节作用HRP能够调节免疫系统的功能,增强人体对外界病原体的抵抗能力,提高免疫力。
三、个人观点与理解HRP作为辣根中的一种特殊成分,具有多种益处。
我个人认为辣根作为一种调味品,不仅能提升菜肴的美味,还能为我们的健康增添一份保障。
HRP的抗氧化、抗菌和免疫调节作用能够综合增强人体的防御能力,为我们预防疾病起到积极的作用。
总结回顾:通过对辣根过氧化物酶结构式、存在形式及其对身体的益处的探讨,我们了解到了HRP的重要性和作用。
HRP的存在可以提供强大的抗氧化和抗菌作用,同时也能够调节免疫系统的功能,保障我们的身体健康。
在我们的日常饮食中适量摄入辣根,可以提供充足的HRP,增强身体的免疫力,预防疾病的发生。
辣根过氧化物酶
❖ 6. 将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS透析,4℃过夜
。
❖ 7. 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃ 1h。
❖ 8. 3000rpm离心30min,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最
后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 ❖ 9. 将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析,
❖ 4、加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液(调节pH至9.0~9.6), 4℃,电磁搅拌下结合24h。
❖ 5、加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水),4℃放 置2h,以封闭残留的醛基,终止反应。
❖ 6、装入透析袋,以0.01mol/L、pH7.2 PBS,4℃透析过夜,或通 过Sephadex G-200凝胶柱层析,用PBS洗脱,收集第1峰洗脱液 。
去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉 淀,上清液即为酶结合物。
第十五页,编辑于星期三:十九点 五分。
(二)戊二醛交联法
❖ 原理:戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂,通过它的两 个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合,形成HRP-戊二醛Ab蛋白结合物。
❖ 戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合,同时加入戊二醛进行交联反 应。
❖ 戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用,形成酶-戊二醛结合物 ,结过透析或层析除去未结合的戊二醛,然后再与抗体结合。
第十六页,编辑于星期三:十九点 五分。
HRP标记多抗
❖ 1、取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB 将25%戊二醛稀释为1.25%),室温(20℃左右)反应结合18h。
辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法
HRP 的NaIO4标记法一.原理:HRP为一种糖蛋白(glycoprotein),其所带的糖基上的糖环能被氧化开环,在2,3—位的—C—C—断开。
在适当的氧化条件下,2,3—位羟基能被氧化为醛基。
醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基(—NH2)形成Shiff碱(—N=CH—),Shiff碱不稳定,可由逆反应解离。
Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—,在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。
HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4,还原剂采用NaBH4。
Note:1.产物A不稳定,故用NaBH4还原为产物B。
2.HRP的氧化要适度,氧化不够不能产生足够量的醛基,如氧化过度,醛基可被进一步氧化为羧基,同样也得不到够量的醛基。
可通过控制NaIO4的量或控制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。
当糖基的氧化度为20~25%时,有较高的结合效率。
3.为了防止HRP的过度氧化,在整个标酶的过程中应尽量避光。
光照可加快过碘酸钠对HRP糖基的氧化,如在标记过程中不避光,则不可控因素太多。
4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈,对酶活性的影响比较大。
有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂,如联苯胺反应。
二.酶量的确定:被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。
抗原与HRP的比值通常为摩尔比1:1。
而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6:1。
当然,这只是一个基点,可根据需要上下调整比率。
统计本次标记所需酶的总量,设为x mg。
三.酶的氧化(全过程避光,操作中力防污染。
酶的终浓度为10mg/mL,总体积为x/10mL)1.称取HRP x mg。
当HRP从-20℃取出后,一定要平衡到室温,否则HRP冻干品易潮解。
称量时不要用称量纸,不要用工具取HRP,应将HRP直接小心地倒入要用来溶解HRP的器具中。
在倒HRP时,不要在风口(如电风扇风,自然风,呼吸)操作,因为HRP冻干品质轻易飞扬;尽量不要说话,以防污染。
HRP基础知识
辣根过氧化物酶科技名词定义中文名称:辣根过氧化物酶英文名称:horseradish peroxidase;HRP定义:编号:EC 1.11.1.7。
一种糖蛋白,由于在辣根中该酶的含量很高,故名。
它以铁卟啉为辅基,在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。
通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。
所属学科:生物化学与分子生物学(一级学科) ;酶(二级学科)本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布目录[隐藏]简介制备简介制备[编辑本段]简介过氧化物酶,酶学分类号为EC 1.11.1.7。
该酶催化Donor+ H2O2--→Oxidized donor+2 H2O。
过氧化物酶,通常来源于辣根(因此称辣根过氧化物酶),是临床检验试剂中的常用酶。
该产品不但广泛用于多个生化检测项目,也广泛运用于免疫类(ELISA)试剂盒。
过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分,对试剂盒的质量有重要影响。
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。
HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。
HRP由多个同功酶组成,分子量为40,000,等电点为PH3~9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。
酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。
H RP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小,非酶蛋白就越多。
[编辑本段]制备实验原理过氧化物酶催化以下反应:2 H2O2 ─→ O2+2H2O这一类酶以铁卟啉为辅基,所以属血红素蛋白质类(hemeProteins)。
过氧化物酶在生物界分布极广,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。
辣根过氧化物酶hrp结构式
辣根过氧化物酶hrp结构式
辣根过氧化物酶(HRP)是一种广泛应用于生物化学和分子生物学研究的酶。
它的基本概念是指从辣根中提取出来的一种酶,具有过氧化物酶的活性。
辣根过氧化物酶(HRP)的结构特点是由两个亚基组成的,分别是α和β亚基,它们通过非共价作用力结合在一起,形成一个稳定的酶结构。
辣根过氧化物酶(HRP)在生物体内起到重要作用,其主要功能是催化过氧化物的分解。
在生物体内,过氧化物是一种常见的活性氧,具有高度的化学活性,可以引起细胞损伤。
辣根过氧化物酶(HRP)通过催化过氧化物的分解,可以降低活性氧的浓度,从而保护细胞免受损伤。
在我国,辣根过氧化物酶(HRP)的研究取得了显著的进展。
科学家们通过对辣根过氧化物酶(HRP)的基因进行克隆和表达,成功实现了辣根过氧化物酶(HRP)的大规模制备。
这为我国生物化学和分子生物学研究领域提供了重要的实验工具。
此外,辣根过氧化物酶(HRP)在我国的医疗领域也具有广泛的应用。
作为一种高效、安全的生物催化剂,辣根过氧化物酶(HRP)被用于治疗各种疾病,如肿瘤、神经系统疾病等。
此外,辣根过氧化物酶(HRP)还被广泛应用于我国的环境保护领域,用于催化有机污染物的降解。
总之,辣根过氧化物酶(HRP)是一种具有重要生物学功能的酶,其在生物化学、分子生物学、医学和环境保护等领域具有广泛的应用前景。
辣根过氧化物酶
四、辣根过氧化物酶的作用机理
辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步: 第一步,形成有活性的酶一底物复合物Ⅰ: HRP + H2O2 → 复合物Ⅰ 第二步,复合物Ⅰ转变成有活性的复合物Ⅱ: 复合物Ⅰ+AH →复合物Ⅱ+A(AH:表示还原型 氢供体) 第三步,复合物Ⅱ被还原,释放出酶: K1 复合物Ⅱ+AH HRP+A+2H2O
子结构组成、理化性质、免疫功能和调控特性等 方面有所不同的一组酶。 2、同工酶不仅存在于同一个体的不同组织中,也存 在于同一组织、同一细胞的不同亚细胞结构中, 甚至存在于不同发育期的组织中。
三、辣根过氧化物酶同工酶C
其中以中性辣根过氧化物酶同工酶C的含量颇为丰富, 也是应用最广泛的一种 。
HRP C单肽链是由308个氨基酸构成的,肽链上 存有二硫键(4个由两分子Cys组成的),还含有 一个盐桥(是Arg123和Asp99构成)。
辣根过氧化物酶催 化机理及应用
目录
辣根过氧化物酶的来源
辣根过氧化物酶(HRP)简介 其机制
辣根过氧化物酶的应用
一、辣根过氧化酶的来源
辣根是十字花科多 年生草本植物,它 的根有辛辣味,可 用作调味品或烹饪 食用,根同时还含 有一种含量丰富的 过氧化物酶——辣 根过氧化物酶。
HRP C二级结构
HRP C 含有两个 不同的金属中心:血 红素和两个钙原子。 血红素中铁原子的一 个轴向结合点与肽链 上His170侧链的N原 子结合, 使血红素垂 直连接在His170上。
HRP C三级结构
酶的结构总体上 看来大部分是α -螺 旋,但其中也包含一 些小的β -折叠。
网状为血红素; 球型为钙 原子; 螺旋型为α 螺旋; 尖头所指为β 折叠。
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过氧化物酶体与溶酶体不同,过氧化物酶体不是来自内质网和高尔基体,因此它不属于内膜
系统的膜结合细胞器。
过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中,但在肝细胞和肾细
胞中数量特别多。
过氧化物酶体含有丰富的酶类,主要是氧化酶,过氧化氢酶和过氧化物酶。
氧化酶可作用于不同的底物,其共同特征是氧化底物的同时,将氧还原成过氧化氢。
过氧化
物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢(H2O2,Hydrogen Peroxide)水解。
氧化酶与过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中,从而对细胞起保护作用。
HRP的制备
⒈水提取:
称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP),用菜刀切成小碎块,在
搅肉机中搅碎1~2次。
碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。
次日用甩干机(或离心机)甩干,收集滤液,碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次,
合并两次滤液,量总体积和度,0。
⒉硫酸铵分级分离:
在不断搅拌下,每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度),大约在1~2
小时内加完,置冷室中放置过夜。
次日将上清液小心地用虹吸管移出,下面浑浊液以3000转/分离心15分钟,弃沉淀,合并上清液。
再按每升上清液加258克硫酸铵粉末(0.8饱和度)
随加随搅拌,当硫酸铵全部溶解后,置冷室过夜。
次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰冻离
心机中以13000转/分离心20分钟,弃去上清液,收集沉淀。
将沉淀悬浮于100~150毫升蒸
馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止),分装于透析袋内,放在流动自来水中进行透析
1~2天,直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。
然后改换成
用蒸馏水透析,中间更换2~3次,用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。
将透析液合并,在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟;去沉淀,量上清液的体积。
⒊丙酮分级分离:
将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中,在不断搅拌下,用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃
的丙酮,放置片刻,在冰冻离心机中以4,000/分离心15分钟,弃去沉淀。
上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)-15℃丙酮,(操作同上),静置后,在冰冻离心机中离心收集沉淀。
将沉淀溶于少量蒸馏水中,透析除丙酮。
可得Rz值近于1的酶溶液。
⒋精制:
将上步酶液适当稀释,滴加1M硫酸锌溶液,使酶液中锌离子浓度为10-3M,5000转/分离心10分钟,得上清液。
再将沉淀用少量蒸馏水洗涤,离心,洗液与清液合并,分装于透析袋内,对水透析除盐,用微孔滤膜过滤,进行真空冷冻干燥(约得20毫克),产品呈米黄色纤维状松软物,HRP产品的Rz值可达3.0左右,置真空干燥器中低温保存。