辣根过氧化物酶制作过程
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过氧化物酶体与溶酶体不同,过氧化物酶体不是来自内质网和高尔基体,因此它不属于内膜
系统的膜结合细胞器。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中,但在肝细胞和肾细
胞中数量特别多。过氧化物酶体含有丰富的酶类,主要是氧化酶,过氧化氢酶和过氧化物酶。氧化酶可作用于不同的底物,其共同特征是氧化底物的同时,将氧还原成过氧化氢。过氧化
物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢(H2O2,Hydrogen Peroxide)水解。氧化酶与过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中,从而对细胞起保护作用。
HRP的制备
⒈水提取:
称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP),用菜刀切成小碎块,在
搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干,收集滤液,碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次,
合并两次滤液,量总体积和度,0。
⒉硫酸铵分级分离:
在不断搅拌下,每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度),大约在1~2
小时内加完,置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出,下面浑浊液以3000转/分离心15分钟,弃沉淀,合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末(0.8饱和度)
随加随搅拌,当硫酸铵全部溶解后,置冷室过夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰冻离
心机中以13000转/分离心20分钟,弃去上清液,收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸
馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止),分装于透析袋内,放在流动自来水中进行透析
1~2天,直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成
用蒸馏水透析,中间更换2~3次,用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。
将透析液合并,在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟;去沉淀,量上清液的体积。
⒊丙酮分级分离:
将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中,在不断搅拌下,用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃
的丙酮,放置片刻,在冰冻离心机中以4,000/分离心15分钟,弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)-15℃丙酮,(操作同上),静置后,在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中,透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。
⒋精制:
将上步酶液适当稀释,滴加1M硫酸锌溶液,使酶液中锌离子浓度为10-3M,5000转/分离心10分钟,得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤,离心,洗液与清液合并,分装于透析袋内,对水透析除盐,用微孔滤膜过滤,进行真空冷冻干燥(约得20毫克),产品呈米黄色纤维状松软物,HRP产品的Rz值可达3.0左右,置真空干燥器中低温保存。