(强烈推荐)环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告

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环介导等温扩增法快速检测结核杆菌复合群内主要致病菌

和牛型结核分枝杆菌，能排除卡介苗对诊断的干扰。并关键词环介导等温扩增快速检测结核分枝杆菌复合群卡介苗
ＲａｉｔｃｉｎｏａｎＰｔｏｅｓｏｙｏｃｅｉｍｂｒｕｏｉｍｐｌｘｂｏ —ｍｅａｅｓｔｅｍａｐｄＤｅｅｔｏｆｔＭｉａｈｇｎｆＭｃｂａｔｒｕＴｕｅｃｌｓｓＣｏｈｅｅｙＬｏｐｄｉｔｄＩｏｈｒｌＡｍｐｌｃｔｎＡｓａ．Ｈｏｇｉａｉｓｙｉｆｏｎ
成功检测到主要的结核致病菌：型和牛型结核分枝杆菌，包括卡介苗在内的其余相关菌株均未见非特异性交叉反应。检测人与的灵敏度可达１。贝／升，于常规ＰＲ方法。结论０拷微高Ｃ该检测方法具有敏感、异、成本和快速的特点，检测和区分人型特低可
ｏｓｒｅｎＭｔｂｒｕｏｉａ．ｏｎｓａｄｂｅｖｄｉｕｅｃｌｓｓｖｒｈｍｉｉｎＭ．ｕｅｃｌｓｓｖｒｏｉａｄｎｏｉｖｉｎｌｗａｂｅｖｄｆｒｔｅｔｅａｔｒａｉｈｔｂｒｕｏｉａ．ｂｖｓ，ｎｏｐｓｔｅｓｇａｓｏｓｒｅｏｈｏｈｒｂｃｅｉｎｔｅｉｔｓ．Ｔｈｅｅｔｏｉｔｏｈｓａｓｏｙｅｔｅｄｔｃｉｎｌｍｉｆｔｅａｓｙｗａ１ｐ／￣１ＣｏｌｉｎＴｈｉＡＭＰａｓｙｈｓｃ．ｎｃｕｓｏｓＬｓａａｍａｙａｖｎａｅｕｈｓｓｅｉｃｔｎｄａｔｇｓｓｃａｐｃｆｉｉｙ，ｓｎｓｔｖｔｅｉｉｉｙ

环介导等温扩增技术检测方法的研究进展

中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s㊀２０１８,３４(５)D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０１８．００．０６８综㊀述环介导等温扩增技术检测方法的研究进展刘亚东,冷㊀雪,时㊀坤,李建明,张姗姗,刘㊀艺,宫庆龙,孙志博,宗㊀颖,曾范利,杜㊀锐国家自然科学基金(N o ．３１３７２４３６)和吉林省科技厅科技支撑计划(N o ．２０１６０２０９００６Y Y )联合资助通讯作者:杜㊀锐,E m a i l :d u r u i ７１＠１２６．c o m 作者单位:吉林农业大学,长春㊀１３００００摘㊀要:环介导等温扩增技术是一种可用于临床诊断的快速检测方法,可用于检测病毒㊁细菌㊁寄生虫等多种病原体.经不断完善,现已在临床检测过程中发挥重要作用.可用显色试剂对反应结果实现可视化,即结果的即时显示,无需后续验证.但是,无论是荧光染料还是显色指示剂,对反应过程都会产生或多或少的影响,目前研究表明羟基萘酚蓝是最好的显色试剂.同时,人们发现电化学技术也可以应用于此,使检测反应更快,操作更加简单.生物传感器可以对多种反应产物进行同步检测,而微流控芯片技术更是方便携带,有望成为实时检测技术的理想载体.关键词:L AM P ;可视化;电化学检测法;生物传感器;微芯片中图分类号:R ３７㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０１８)０５－０４６０－０６A d v a n c e do f t h e d e t e c t i o nm e t h o do f l o o p Ｇm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m pl i f i c a t i o n L I U Y a Ｇd o n g ,L E N G X u e ,S H IK u n ,L I J i a n Ｇm i n g,Z H A N GS h a n Ｇs h a n ,L I U Y i ,G O N G Q i n g Ｇl o n g ,S U NZ h i Ｇb o ,Z O N G Y i n g,Z E N GF a n Ｇl i ,D U R u i (J i l i nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,C h a n gc h u n １３００００,C h i n a )A b s t r a c t :l o o p Ｇm ed i a te d i s o t h e r m a l a m p l if i c a t i o n i s a r a p i dd e t e c t i o nm e t h o d t h a t c a nb e u s e d f o r c l i n i c a l d i a gn o s i s a n d c a n b eu s e d t od e t e c t v i r u s e s ,b a c t e r i a ,p a r a s i t e s a n d o t h e r p a t h o g e n s ．I t h a s b e e n i m p r o v e d a n d p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e c l i n i Ｇc a l t e s t i n gp r o c e s s ．T h e c o l o r r e a c t i o n c a nb eu s e d t o a c h i e v ev i s u a l i z a t i o no f t h e r e s u l t s ,a n d t h e r e s u l t s c a n i mm e d i a t e l y di s Ｇp l a y ．H o w e v e r ,b o t h t h e f l u o r e s c e n t d y e a n d t h e c o l o r i n d i c a t o r c a n i m p a c t t h e r e a c t i o n p r o c e s s ．T h e c u r r e n t s t u d y s h o w s t h a t h y d r o x y l n a p h t h o l b l u e i s t h e b e s t c o l o r r e a g e n t ．A t t h e s a m e t i m e ,i tw a s f o u n d t h a t e l e c t r o c h e m i c a l t e c h n o l o g y c a n a l s o b e a pＧp l i e d t o t h em e t h o d ,w h i c hc a nm a k e t h ed e t e c t i o nr e a c t i o nb e f a s t e r a n dt h eo p e r a t i o n m o r e s i m p l e ．B i o s e n s o r s c a ns yn c h r o Ｇn i z e dd e t e c t a v a r i e t y o f r e a c t i o n p r o d u c t s ．A n dm i c r o f l u i d i c c h i p i s e a s y t o c a r r y a n d i s e x pe c t e d t ob e c o m e t h e i d e a l c a r r i e rf o r r e a l Ｇt i m e d e t e c t i o n t e c h n o l og y．K e yw o r d s :l o o p Ｇm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n ;v i s u a l i z a t i o n ;e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n ;b i o s e n s o r s ;m i c r o c h i p s S u p p o r t e db y t h eN a t i o n a lN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no f C h i n a (N o ．３１３７２４３６),a n d t h e S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y S u p p o r t P r o Ｇgr a mo f J i l i nP r o v i n c i a l (N o ．２０１６０２０９００６Y Y )C o r r e s p o n d i n g au t h o r :D uR u i ,E m a i l :d u r u i ７１＠１２６．c o m ㊀㊀目前已存在几种核酸扩增方法[１Ｇ４],而P C R (聚合酶链式反应)是目前使用最广泛的技术,该基因扩增方法已被应用于临床,特别是在分子检测方面,在传染病诊断中尤其如此,例如肝炎和结核等,以及一些遗传疾病.基因检测步骤包括从标本中提取核酸,进行基因扩增和检测,这些步骤需要一定的操作技术和昂贵的仪器设施,在资金投入紧张的国家和地区,使用受到限制,且P C R 的循环过程变温会消耗一定时间.环介导等温扩增(L o o pＧm e d i a t e d i s o Ｇt h e r m a l a m pl i f i c a t i o n ,L AM P )是N o t o m i 等[５]人研究的一种分子扩增技术,可以快速大量的扩增目的片段,等温扩增解决了变温的时间损耗,现被应用于临床检测中,并被不断完善,在临床检测中具有非常重要的意义.１㊀L A M P 原理L AM P 技术的核心之一在于引物的设计,设计出特异性强的引物是L AM P 的第一步也是开始的关键.L AM P 引物是针对D N A 的靶序列设计一对０６４外引物F３与B３,以及一对内引物F I P和B I P,内引物F I P是由F２和F I c组成,B I P是由B２和B１c组成[６].反应的进行依托于D N A置换酶的活性和引物的特异性.在初始过程中,４个引物都参与反应,但是在循环反应中只有内引物参与D N A序列的置换合成.内引物分为上内引物(F I P)和下内引物(B I P),每一个内引物含有２个不同的序列,与靶序列的正向序列和反向序列相对应,一个用于第一步的启动,另一个以自身为模版进行第二阶段的循环扩增,即目的片段的尾端内侧序列被命名为F２c和B２.F２c和B２尾端内侧的２个序列被称为F１c和B１,外侧的２个序列称为F３c和F３.鉴于这种结构,F I P和B I P被命名为内引物.F I P包含F１c,１个T T T T片段以及互补于F２c的序列F２.B I P包含的是与B１互补的序列B１c,T T T T片段和B２.２个外引物包括的是B３和F３c互补的序列F３.１个含有靶序列和４个引物的D N A样品加热变性后在冰上快速冷却.之后,加入B s tD N A大片段置换酶,６５ħ１h,开始L AM P反应[５].２㊀反应特点L AM P反应的几个方面与其他扩增方法不同. L AM P方法的主要特征是只需要一种酶,使其在６５ħ范围内的等温条件下扩增核酸.因此,它允许使用简单且具有低成本效益的反应设备,在临床检测中可以更好的实施.L AM P方法具有高特异性和高扩增效率.由于L AM P方法使用４种识别模板D N A上６个不同区域的引物,其特异性极高.例如,L AM P方法可以特异性扩增来自区分单个核苷酸差异的人类基因组标本中的特定基因[７].L AM P方法的分离效率非常高,等温也不需要变温过程的时间浪费.L AM P方法在３０~６０m i n 内对２５μL反应混合物合成１０~２０μg特异性D N A[８].尤其加入特异性环引物可以有助于将扩增时间缩短到原始L AM P方法的１/２或１/３[９].该方法还可用于扩增靶R N A序列.N o t o m i 等人开发了一步,单管,实时逆转录循环介导的等温扩增(R TＧL AM P)测定法,用于检测甲型肝炎病毒(H A V)基因组中非翻译区的序列[１０].在这种情况下,与D N A的扩增相同的一步扩增可以通过同时添加逆转录酶进行,因为逆转录酶也显示出链转移活性.３㊀L A M P研究进展自从２０００年[５]第一次报道了L AM P,L AM P 就成为了分子扩增领域广泛研究的重点,在不断的研究中L AM P技术越来越完善.２００２年N a g aＧm i n e等人[９]设计应用环引物,大大缩短了L AM P 反应时间;同年N a g m i n e等人[１１]使用T s p R I酶实现了D N A的单链分离扩增;２００５年E n o m o t o等人[１２]通过将L AM P与逆转录相结合,建立了R TＧL AM P技术;２００６年Y o n e y a m a等人[１０]开发了单管一步逆转录法,对肝炎病毒进行了逆转录;同年H i r a y a m a等[１３]应用L AM P方法对水牛胚胎进行了性别鉴定并克隆了性染色体的特异性序列,对于物种的繁殖作出了非常重要的贡献.此外,２００６年P o o n等人[１４]未提取D N A直接进行L AM P,成功检测到恶性疟原虫阳性反应,对之后的检测技术产生深远的影响.K a n e k o等人[１５]在２００７年通过检测L AM P对生物的耐受性,进行了未提取D N A的病毒L AM P实验,再一次表明L AM P可以不经过D N A提取而进行扩增,只是结果没有经过提取的效果好.３．１㊀可视化发展㊀２００１年M o r i等人发现了根据浊度对反应进行肉眼的直观判断[８],但是因根据肉眼分辨浊度具有强烈的主观性,L e等人[１６]发现,在阳光照射下,用肉眼确定管之间的灵敏度和变异性是困难的,且阳性样品的浊度只在短时间内稳定.意味着必须在反应之后尽快进行监测[１７],更需要浊度计进行准确客观的判断,然而使用浊度计进行检测,不够经济实用,因而,实现反应结果的可视化,成为了学者们关注的焦点.D N A具有能和染料结合的特异性分子结构d s D N A,通常,染料与d s D N A的复合物的形成会使染料发生可见的颜色变化,因此此类染料可用于L AM P产物的可视化.２００３年,I w a m o t o等人[１８]首次使用S Y B R G r e e n I用于L AM P结果鉴定,研究发现[１９]D N A结合染料的检测灵敏度都远高于浊度检测的灵敏度.目前,许多荧光染料已被用于定性检测.在存在足够的d s D N A的情况下,荧光染料S Y B RＧG r e e n I的颜色从橙色变为绿色,且在自然光下,颜色变化依然易于分辨[１９Ｇ２０].另一方面,通过添加D N A结合染料提高灵敏度与较高的运行成本有关.另外,由于需要打开反应管以增加染料,因此增加了污染风险.为了克服后者的缺点,２０１２年,H o n g等人[２１]研究出了两步法,以避免打开管: S Y B RＧG r e e nI染料悬浮在管内的锡箔上,在L AM P反应后,将管离心,使染料落入L AM P反应１６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展混合物中.使用该方法,当最小模板浓度为１拷贝/μL时,可以检测到L AM P的产物.同样,Q u a n tＧi T P i c o G r e e n[２２],G e n e F i n d e r[１７,２３Ｇ２４],和溴化乙锭[２２]也被用于L AM P结果的检测.２００６年,Y a s u y o s h i等人[２５]把聚乙烯亚胺用于L AM P的结果检测,用来增强染料标记.在使用聚乙烯亚胺增强的方法中,使用荧光标记的D N A探针结合L AM P产物,随后加入聚乙烯亚胺中和染料标记的L AM P产物,产生具有清晰的颜色的沉淀物,可以通过肉眼直接对结果判定.然而,D N A结合染料的方法存在一定的缺陷,主要为会对L AM P的扩增过程产生抑制[２５],这意味着染料试剂必须在终点加入,避免影响L AM P反应.此外,这些染料中的一些,例如溴化乙锭[７]可能是诱变剂,致癌物质或致畸物,虽然这取决于接触程度.此外,这种方法需要在扩增后打开反应管,可能会造成污染.对此,L i a n g等人[２６]在２０１３年用微晶蜡将S Y B RＧG r e e n I染料提前密封在反应管中,在L AM P反应结束后通过加热使蜡融化释放染料进行显色,这种方法即应用了荧光染料的灵敏度又解决了因开盖而可能产生的污染问题.在２０１４年J i a n g等人[２７]成功的应用这种方法对恶性疟原虫进行了检测.另一种使用间接显色指示剂的肉眼观测方法,指示剂可以加入到L AM P反应体系中,进行密封一步测定.因此,与两步的D N A结合染料方法相比,降低了产生污染的风险[２８],比如,钙绿黄素.在２００８年钙绿黄素被T o m i t a等人[７]首次应用在L AM P反应结果检测.在扩增反应前,钙黄绿素分子与锰离子结合,L AM P反应溶液为橙色,L AM P 反应过程中生成大量的焦磷酸根,使得钙绿黄素分子不再结合锰离子,而与生成的焦磷酸根离子结合,生成绿色荧光,而且,钙绿黄素分子与镁离子结合,可以增强绿色荧光信号[７].然而,在２０１０年W a s t iＧl i i n g等人[２２]发现,与没有添加指示剂的反应相比,加入钙绿黄素的似乎降低了L AM P的敏感性.实际上,钙绿黄素的存在在一定程度上抑制了L AM P 反应[２２,２９],另一个原因是钙绿黄素和双链D N A之间的相互作用导致了反应灵敏度的降低[３０Ｇ３１].因此,具有相似作用方式的另一种染料H N B 进入了人们的视线,这种染料是在镁离子存在下形成紫色,在扩增反应过程中,伴随大量的焦磷酸镁的生成导致反应中的镁离子浓度下降,从而使得含有H N B的反应溶液从紫色变为蓝色[２９].W a s t l i i n g 等人[２２]研究表示,该试剂不会对L AM P反应产生抑制,比钙绿黄素更加适合作为指示剂,因而被广泛使用[１７,２１,２９,３２Ｇ３４].３．２㊀电化学检测法㊀由于电化学方法更快,成本更低,更简单,并且比光学的方法更容易以小型化的形式应用[３５],这些特点使得电化学可以作为分析D N A扩增结果的可靠且稳定的检测方法[３６].因此,现在一部分的焦点为利用电化学传感器/芯片和生物传感器等方法对L AM P反应进行检测.３．２．１㊀E n d p o i n t㊀电化学的活性物质与d s D N A的结合会导致检测电流的变化.比如,在溶液中的H o e c h s t３３２５８氧化还原分子可使得D N A在槽中聚集,导致电流反应明显下降.A h m e d[３７]和S a f aＧv i e h[３８]等人将分子用作电活性指示剂来检测L AM P反应产物,并用探针非固定化方法测得８６f g/μL D N A(２４C F U/m L)[３８],为减少交叉感染的分析,他们开发了一个平台,允许在单个设备中进行放大检测.使用该装置和H o e c h s t３３２５８指示器,一次可测得３００拷贝量[３９].３．２．２㊀R e a l t i m e㊀L AM P反应的实时监测可以通过原位电化学反应来实现,依赖于两种机制:亚甲蓝(M B)分子与工作电极之间的氧化还原电子转移以及M B与d s D N A的嵌入[４０Ｇ４１],随着反应的进行, M B与L AM P扩增子的嵌入降低了游离M B浓度,从而降低了这种氧化还原电流[４２Ｇ４４].使用M B作为指标,H s i e h[４２]和X i e[４４]等人得到的检测限度分别为１６拷贝(４f g/μL)和０．３p M.然而,M B的D N A结合亲和力为１０４~１０５M－１[４５],其与M B L与扩增子L AM P在溶液中的低效率相互作用[４６],表明可以通过其他指标来实现较低的检测限度.钌六胺缺乏插层配体并与阴离子d s D N A骨架静电结合[４７].A h m e d等[４６]人将其作为定量监测L AM P 扩增子的指标,在３０m i n内检测限为２０拷贝/μL.使用单个生物芯片在单个聚丙烯管中进行体外扩增和实时监测,这种方法可以避免在整个过程中潜在的交叉污染风险.在理想情况下,电活性指示剂应具有化学稳定性,应优先与d s D N A扩增子结合,不应在监测过程中抑制扩增[４６].然而,几乎所有的氧化还原探针都对D N A的扩增存在抑制作用[３８].例如,H o e c h s t３３２５８对聚合酶活性有明显的抑制作用,并且限制溶液中D N A的扩增和感测.为了克服这个问题,Z h a n g等人[２４]开发了一种伏安模式,用于通过测试游离的２Ｇ脱氧鸟苷５Ｇ三磷酸(d G T P)的氧化反应来监测D N A扩增的生物化学过程,这也是L AM P反应中的反应物之一.有了这个方法,２６４中国人兽共患病学报２０１８,３４(５)抑制问题不再是焦点,因为没有辅助指标可以使用.不幸的是,需要将电极置于反应中可能会发生交叉污染.３．３㊀生物化学传感器㊀电化学生物传感器与某种生物识别模式联合,应用于检测方法中.已经报道了几种用于监测L AM P反应的电化学生物传感器/基于生物芯片的方法.S u n等人[４８]通过将序列特异性s s D N A探针固定在离子液体改良的基底电极上来制造电化学D N A生物传感器.然后,他们使用生物传感器和亚甲基蓝电化学指示剂来监测杂交的L AM P扩增子.N a k a m u r a等[４９]人开发了一种电化学D N A生物芯片,用H o e c h s t３３２５８作为杂交指示剂同时监测六种L AM P产物.N a k a m u r a等人[５０]又通过组合L AM P和基于杂交的电化学D N A生物芯片成功获得了特定基因的拷贝数,其由G e n e l y z e系统,D N A扩增１h和D N A检测０．５h 组成.通常,生物传感器/生物芯片的方法用于直接检测特异性序列的目标基因片段,以及在L AM P反应后进行定性检测使用.虽然直接检测特异性高于间接测量的特异性,但是制备D N A生物传感器/芯片是昂贵且耗时的,特别是在L AM P反应时对其进行实时检测,并不容易实现.目前,通过简单且经济有效的伏安模式监测L AM P反应已经有了一些进展,但是还没有详细的解释能说明L AM P反应物会污染电极设备.A h m e d等人[４６]观察到即使在重复测量之后,电极面和相对面上也没有形成薄膜或污渍.４㊀L A M P的未来目前还没有足够稳定㊁简单以及经济的N A T 系统供发展中国家使用.综上所述,L AM P及其周边技术还在开发中,用于在发展中国家建立最简单的用于诊断的N A T系统.这种诊断方法可能对许多疾病流行的国家有很大帮助.检测L AM P反应的理想方法应具有高度的敏感性和快速反应性,应具有低成本和非高密度性,应易于使用和环保,实现理想L AM P检测的可行性取决于微型化检测组件的发展,微流控芯片[５１]作为下一代基因检测设备一直被关注.该装置是在平台上组装的微小通道构成,在基因测试时,可以在单个芯片上进行完整的分析,包括提取,扩增和检测[５２].这些器件称为μＧ总分析系统(μＧT A S)芯片,或称为芯片上的实验室 .使用这些装置的优点包括防止基因扩增产物的污染,根据设备的设计可以进行多体系自动化反应,可以提高对微量样品的分析速度,以及进行简化及微型化现场测试.这种方法可以解决与现场基因测试相关的大量问题.H a t a o k a等人[５３]已经通过研究证明,L AM P扩增之后继续进行下一步的反应和分析,这些都可以在单个芯片上实现,也证明L AM P 反应在下一代的设备装置中依然适用.基于L AM P方法的简单通用的设备的开发和应用,对临床疾病的快速㊁准确的检测将具有重要意义.参考文献:[１]S a i k i R K,S c h a r f S,F a l o o n a F,e t a l．E n z y m a t i c a m p l i f i c a t i o n o f b e t aＧg l o b i n g e n o m i cs e q u e n c e sa n dr e s t r i c t i o ns i t ea n a l y s i sf o r d i a g n o s i so f s i c k l ec e l l a n e m i a[J]．S c i e n c e,１９８５,２３０(４７３２):１３５０．[２]C o m p t o nJ．N u c l e i ca c i ds e q u e n c eＧb a s e da m p l i f i c a t i o n[J]．N aＧt u r e,１９９１,３５０(６３１３):９１．[３]W a l k e rG T,L i t t l e M C,N a d e a uJ G,e t a l．I s o t h e r m a l i nv i t r o a m p l i f i c a t i o no fD N Ab y a r e s t r i c t i o ne n z y m e/D N A p o l y m e r a s e s y s t e m[J]．P r o cN a t lA c a dS c iUSA,１９９２,８９(１):３９２Ｇ３９６．[４]W a l k e rG T,F r a i s e rM S,S c h r a mJ L,e t a l．S t r a n d d i s p l a c e m e n t a m p l i f i c a t i o nＧa ni s o t h e r m a l,i n v i t r o D N A a m p l i f i c a t i o nt e c hＧn i q u e．[J]．N u c l e i cA c i d sR e s,１９９２,２０(７):１６９１．[５]N o t o m iT,O k a y a m a H,M a s u b u c h iH,e ta l．L o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o no fD N A[J]．N u c l e i cA c i d sR e s,２０００,２８(１２):E６３．[６]M o r i Y,N o t o m i T．L o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n (L AM P):a r a p i d,a c c u r a t e,a n d c o s tＧe f f e c t i v e d i a g n o s t i cm e t hＧo d f o r i n f e c t i o u s d i s e a s e s[J]．J I n f e c tC h e m o t h e r,２００９,１５(２):６２Ｇ６９．[７]T o m i t aN,M o r iY,K a n d aH,e t a l．L o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P)o f g e n es e q u e n c e sa n ds i m p l ev i s u a l d eＧt e c t i o no f p r o d u c t s．[J]．N a tP r o t o c o l s,２００８,３(５):８７７．[８]M o r iY,N a g a m i n eK,T o m i t aN,e t a l．D e t e c t i o n o f l o o pＧm e d iＧa t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nr e a c t i o nb y t u r b i d i t y d e r i v e d f r o m m a g n e s i u m p y r o p h o s p h a t ef o r m a t i o n[J]．B i o c h e m B i o p h R e s C o,２００１,２８９(１):１５０Ｇ１５４．[９]N a g a m i n eK,H a s eT,N o t o m iT．A c c e l e r a t e d r e a c t i o nb y l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nu s i n g l o o pp r i m e r s[J]．M o l C e l l u l a rP r o b e,２００２,１６(３):２２３．[１０]Y o n e y a m aT,K i y o h a r aT,S h i m a s a k i N,e t a l．R a p i d a n d r e a lＧt i m ed e t e c t i o n o fh e p a t i t i s A v i r u s b y r e v e r s et r a n s c r i p t i o n l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n a s s a y[J]．JV i r o lM e t hＧo d s,２００７,１４５(２):１６２Ｇ１６８．[１１]N a g a m i n eK,K u z u h a r aY,N o t o m i T．I s o l a t i o n o f s i n g l eＧs t r a nＧd e d D N A f r o m l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n p r o dＧu c t s．[J]．B i o c h e m B i o p hR e s,２００２,２９０(４):１１９５Ｇ１１９８．[１２]E n o m o t oY,Y o s h i k a w aT,I h i r a M,e t a l．R a p i dd i a g n o s i so fh e r p e ss i m p l e xv i r u s i n f e c t i o nb y al o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nm e t h o d[J]．JC l i n M i c r ob i o l,２００５,４３(２):９５１Ｇ９５５．[１３]H i r a y a m aH,K a g e y a m aS,T a k a h a s h iY,e t a l．R a p i ds e x i n g o fw a t e r b u f f a l o(B u b a l u s b u b a l i s)e m b r y o su s i n g l o o pＧm e d i aＧt e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n[J]．T h e r i o g e n o l o g y,２００６,６６３６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展(５):１２４９Ｇ１２５６．[１４]P o o nL L,W o n g B W,M aE H,e t a l．S e n s i t i v e a n d i n e x p e n s i v e m o l e c u l a r t e s tf o rf a l c i p a r u m m a l a r i a:d e t e c t i n g P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m D N Ad i r e c t l y f r o mh e a tＧt r e a t e db l o o d b y l o o pＧm e d iＧa t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．C l i n C h e m,２００６,５２(２):３０３．[１５]K a n e k oH,K a w a n aT,F u k u s h i m aE,e t a l．T o l e r a n c e o f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t o a c u l t u r em e d i u ma n d b i oＧl o g i c a l s u b s t a n c e s[J]．JB i o c h eB i o p h M e t h o d s,２００７,７０(３):４９９．[１６]L eT H,N g u y e nN T,T r u o n g N H,e t a l．D e v e l o p m e n t o fm iＧt o c h o n d r i a l l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n f o r d e t e c t i o n o f t h es m a l l l i v e rf l u k e O p i s t h o r c h i sv i v e r r i n i(O p i s t h o r c h iＧi d a e;T r e m a t o d a;P l a t y h e l m i n t h e s)[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１２,５０(４):１１７８Ｇ１１８４．[１７]A l m a s iA,M o r a d iA,D e h a b a d i S MH,e t a l．D e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o no f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o na s s a y f o r r a p i dd e t e c t i o no f f u s a r i u m o x y s p o r u mf．s p．l y c o p e r s i c i[J]．J P l a n tP a t h o l M i c r o b i o l,２０１３,４:１７７．D O I:１０．４１７２/２１５７Ｇ７４７１．１０００１７７[１８]I w a m o t oT,S o n o b eT,H a y a s h iK．L o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n f o r d i r e c t d e t e c t i o n o f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s c o m p l e x,M．a v i u m,a n d M．i n t r a c e l l u l a r e i nS p u t u m S a mＧp l e s[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２００３,４１(６):２６１６．[１９]L eT H,N g u y e nN T,T r u o n g N H,e t a l．D e v e l o p m e n t o fm i t oＧc h o n d r i a l l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nf o rd e t e c t i o n o f t h es m a l l l i v e rf l u k e O p i s t h o r c h i sv i v e r r i n i(O p i s t h o r c h iＧi d a e;T r e m a t o d a;P l a t y h e l m i n t h e s)[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１２,５０(４):１１７８Ｇ１１８４．[２０]Z h a n g Y H,Y a n g T,S h a n g HW,e t a l．I n f l u e n c eo f s u b s t i t uＧt i n g l aw i t h p r o n e l e c t r o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o fR EＧM gＧN iＧb a s e dA２B７Ｇt y p e a l l o y s p r e p a r e d b y m e l t s p i n n i n g[J]．A d vM aＧt e rR e s,２０１２,５６０Ｇ５６１:１０１１Ｇ１０１５．[２１]H o n g M,Z h aL,F uW,e t a l．A m o d i f i e d v i s u a l l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o df o rd i a g n o s i sa n dd i f f e r e n t i aＧt i o no fm a i n p a t h o g e n s f r o m M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s c o mＧp l e x[J]．W o r l d JM i c r o b i o l B i o t e c h n o l,２０１２,２８(２):５２３Ｇ５３１．[２２]W a s t l i n g S L,P i c o z z i K,K a k e m b oA S,e t a l．L AM P f o r h u m a n a f r i c a nt r y p a n o s o m i a s i s:ac o m p a r a t i v e s t u d y o f d e t e c t i o n f o rＧm a t s[J]．P l o sN e g l e c tT r o p D,２０１０,４(１１):e８６５．[２３]Z h a n g Q L,S h i C Y,H u a n g J,e t a l．R a p i dd i a g n o s i so f t u r b o t r e d d i s hb o d y i r i d o v i r u s i nt u r b o tu s i n g l o o pＧm e d i a t e di s o t h e rＧm a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o d[J]．JV i r o l o g M e t h o d s,２００９,１５８(２):１８Ｇ２３．[２４]Z h a n g X,Q uK,L iQ,e t a l．R e c o r d i n g t h e r e a c t i o n p r o c e s s o f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P)b y m o n i t o r i n g t h e v o l t a mm e t r i c r e s p o n s e o f２ᶄＧd e o x y g u a n o s i n e５ᶄＧt r i p h o sＧp h a t e[J]．E l e c t r o a n a l y s i s,２０１１,２３(１０):２４３８Ｇ２４４５．[２５]Y a s u y o s h i M,T s u y o s h iH,T s u g u n o r iN．S e q u e n c es p e c i f i c v i s u a l d e t e c t i o n o f L AM P r e a c t i o n s b y a d d i t i o n o f c a t i o n i c p o l yＧm e r s[J]．B m cB i o t e c h n o l o g y,２００６,６(１):３．[２６]L i a n g C,C h e n g S,C h u Y,e ta l．Ac l o s e dＧt u b ed e t e c t i o no f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P)p r o d u c t su s i n g a w a xＧs e a l e d f l u o r e s c e n ti n t e r c a l a t o r．[J]．J N a n o s c i N a n o t e c h n o l,２０１３,１３(６):３９９９．[２７]J i a n g Z M,X u e p i n g MA,Y i nZ J,e t a l．Ac l o s e dＧt u b e i s o t h e rＧm a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o d f o r h i g h l y s e n s i t i v e a n d v i s u a l i z e d d eＧt e c t i o no f P l a s m o d i u mF a l c i p a r u m[J]．P r o g r e s s i nM o d e r nB iＧo m e d i c i n e,２０１４．[２８]P a r i d a M,S a n n a r a n g a i a hS,D a s hP K,e ta l．L o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P):a n e w g e n e r a t i o n o f i n n o v aＧt i v e g e n e a m p l i f i c a t i o nt e c h n i q u e;p e r s p e c t i v e s i nc l i n i c a l d i a gＧn o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s[J]．R e v M e dV i r o l,２００８,１８(６):４０７Ｇ４２１．[２９]G o t oM,H o n d aE,O g u r aA,e t a l．C o l o r i m e t r i cd e t e c t i o no f l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nr e a c t i o n b y u s i n g h yＧd r o x y n a p h t h o l b l u e．[J]．B i o t e c h n i q u e s,２００９,４６(３):１６７Ｇ１７２．[３０]Y uF,D i n g Y,G a oY,e t a l．F l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n t e f f e c t f o r t h e d e t e r m i n a t i o no fD N A w i t hc a l c e i nＧc e t y l t r i m e t h y l a mＧm o n i u mb r o m i d es y s t e m[J]．A n a l y t i c aC h i m i c a A c t a,２００８,６２５(２):１９５．[３１]Z h a n g X,L iM,C u iY,e t a l．E l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r o f c a lＧc e i na n d t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a l c e i n a n dD N A[J]．E l e c t r o aＧn a l y s i s,２０１２,２４(９):１８７８Ｇ１８８６．[３２]M aX J,S h uY L,N i eK,e t a l．V i s u a l d e t e c t i o n o f p a n d e m i c i nＧf l u e n z aA H１N１V i r u s２００９b y r e v e r s eＧt r a n s c r i p t i o n l o o pＧm eＧd i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nw i t hh y d r o x y n a p h t h o l b l u ed y e[J]．JV i r o lM e t h o d s,２０１０,１６７(２):２１４Ｇ２１７．[３３]L u oL,N i eK,Y a n g M J,e t a l．V i s u a l d e t e c t i o no fh i g hＧr i s k h u m a n p a p i l l o m a v i r u s g e n o t y p e s１６,１８,４５,５２,a n d５８b y l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n w i t h h y d r o x y n a p h t h o l b l u e d y e[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２０１１,４９(１０):３５４５．[３４]S a f a v i e h M,A h m e d MU,S o k u l l uE,e t a l．As i m p l e c a s s e t t ea s p o i n tＧo fＧc a r e d i a g n o s t i c d e v i c ef o r n a k e dＧe y ec o l o r i m e t r i cb ac t e r i ade t e c t i o n．[J]．A n a l y s t,２０１３,１３９(２):４８２Ｇ４８７．[３５]F e r g u s o nB S,B u c h s b a u m S F,S w e n s e nJ S,e ta l．I n t e g r a t e d m i c r of l u i d i c e l e c t r o c h e m i c a l D N As e n s o r[J]．A n a l y t i c a l C h e m,２００９,８１(１５):６５０３Ｇ６５０８．[３６]D e fév e rT,D r u e tM,E v r a r dD,e t a l．R e a lＧt i m e e l e c t r o c h e m iＧc a l P C R w i t haD N Ai n t e r c a l a t i n g r e d o x p r o b e[J]．A n a l y t i c a lC h e m,２０１１,８３(５):１８１５．[３７]A h m e dMU,H a s a nQ,H o s s a i nMM,e t a l．M e a t s p e c i e s i d e nＧt i f i c a t i o nb a s e do nt h e l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n a n d e l e c t r o c h e m i c a lD N As e n s o r．[J]．F o o dC o n t r o l,２０１０,２１(５):５９９Ｇ６０５．[３８]S a f a v i e hM,A h m e dMU,T o l b aM,e t a l．M i c r o f l u i d i c e l e c t r oＧc h e m i c a l a s s a y f o r r a p i dd e t e c t i o na n d q u a n t i f i c a t i o no fE s c h eＧr i c h i a c o l i[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１２,３１(１):５２３Ｇ５２８．[３９]A h m e d MU,S a i t o M,H o s s a i n MM,e ta l．E l e c t r o c h e m i c a l g e n o s e n s o r f o r t h e r a p i d d e t e c t i o no fGMOu s i n g l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．A n a l y s t,２００９,１３４(５):９６６Ｇ９７２．[４０]K e r m a nK,O z k a nD,K a r aP,e t a l．V o l t a mm e t r i c d e t e r m i n aＧt i o no fD N A h y b r i d i z a t i o nu s i n g m e t h y l e n eb l u ea n ds e l fＧa sＧs e m b l e da l k a n e t h i o l m o n o l a y e ro n g o l de l e c t r o d e s[J]．A n a lC h i m A c t a,２００２,４６２(１):３９Ｇ４７．[４１]Y a n g W,O z s o zM,H i b b e r t D,e t a l．E v i d e n c e f o r t h e d i r e c t i nＧ４６４中国人兽共患病学报２０１８,３４(５)t e r a c t i o n b e t w e e n m e t h y l e n e b l u e a n d g u a n i n e b a s e s u s i n gD N AＧm o d i f i e dc a r b o n p a s t e e l e c t r o d e s[J]．E l e c t r o a n a l y s i s,２０１５,１４(１８):１２９９Ｇ１３０２．[４２]H s i e hK,P a t t e r s o nA S,F e r g u s o nB S,e t a l．R a p i d,s e n s i t i v e, a n d q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no f p a t h o g e n i cD N A a tt h e p o i n to f c a r ev i a m i c r o f l u i d i ce l e c t r o c h e m i c a l q u a n t i t a t i v eL o o pＧM e d i aＧt e d i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n(M E QＧL AM P)[J]．A n g e w a n d t eC h e m i e,２０１２,５１(２０):４８９６Ｇ９００．[４３]N a g a t a n i N,Y a m a n a k aK,S a i t oM,e t a l．S e m iＧr e a l t i m e e l e cＧt r o c h e m i c a l m o n i t o r i n g f o ri n f l u e n z a v i r u s R N A b y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o nl o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n u s i n g a U S B p o w e r e d p o r t a b l e p o t e n t i o s t a t[J]．A n a l y s t,２０１１,１３６(２４):５１４３Ｇ５１５０．[４４]X i e S,C h a i Y,Y u a nY,e t a l．D e v e l o p m e n t o f a n e l e c t r o c h e m iＧc a lm e t h o df o rO c h r a t o x i n A d e t e c t i o nb a s e do na p t a m e ra n d l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１４,５５(９):３２４Ｇ３２９．[４５]B a r a n o v s k i i S F,B o l o t i nP A,E v s t i g n e e v M P,e t a l．C o m p l e xＧa t i o no f h e t e r o c y c l i c l i g a n d sw i t hD N Ai na q u e o u s s o l u t i o n[J]．JA p p l i e dS p e c t r o s c,２００８,７５(２):２５１Ｇ２６０．[４６]A h m e d MU,N a h a rS,S a f a v i e h M,e ta l．R e a lＧt i m ee l e c t r oＧc h e m i c a l d e t e c t i o n o f p a t h o g e nD N Au s i n g e l e c t r o s t a t i c i n t e r a cＧt i o no f a r e d o x p r o b e[J]．A n a l y s t,２０１３,１３８(３):９０７Ｇ９１５．[４７]S t e e l A B,H e r n eT M,T a r l o vM J．E l e c t r o c h e m i c a l q u a n t i t a t i o n o fD N Ai mm o b i l i z e do n g o l d[J]．A n a l y t i c a lC h e m,１９９８,７０(２２):４６７０．[４８]S u n W,Q i nP,G a oH,e t a l．E l e c t r o c h e m i c a lD N Ab i o s e n s o r b a s e do nc h i t o s a n/n a n oＧV２O５/MW C N T sc o m p o s i t ef i l mm o d i f i e d c a r b o n i o n i c l i q u i d e l e c t r o d e a n d i t s a p p l i c a t i o n t o t h e L AM P p r o d u c to fY e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a,g e n es e q u e n c e[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１０,２５(６):１２６４Ｇ１２７０．[４９]N a k a m u r aN,I t oK,T a k a h a s h iM,e t a l．D e t e c t i o no f s i x s i nＧg l eＧn u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m sa s s o c i a t e d w i t hr h e u m a t o i da rＧt h r i t i s b y a l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o da n d a ne l e c t r o c h e m i c a lD N Ac h i p[J]．A n a lC h e m,２００７,７９(２４):９４８４Ｇ９４９３．[５０]N a k a m u r aN,F u k u d aT,N o n e nS．S i m p l e a n d a c c u r a t e d e t e rＧm i n a t i o no fC Y P２D６g e n e c o p y n u m b e r b y a l o o pＧm e d i a t e d i s oＧt h e r m a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o d a n d a n e l e c t r o c h e m i c a l D N Ac h i p [J]．C l i nC h i m A c t a,２０１０,４１１(７):５６８Ｇ５７３．[５１]W h i t e s i d e sGM．T h e o r i g i n s a n d t h e f u t u r e o fm i c r o f l u i d i c s[J]．N a t u r e,２００６,４４２(７１０１):３６８．[５２]K o p p MU,M e l l oA J,M a n zA．C h e m i c a l a m p l i f i c a t i o n:c o n t i nＧu o u sＧf l o wP C Ro na c h i p[J]．S c i e n c e,１９９８,２８０(５３６６):１０４６．[５３]H a t a o k aY,Z h a n g L,M o r iY,e t a l．A n a l y s i s o f s p e c i f i c g e n e b y i n t e g r a t i o no f i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o na n de l e c t r o p h o r e s i s o n p o l y(m e t h y l m e t h a c r y l a t e)m i c r o c h i p s[J]．A n a lC h e m,２００４,７６(１３):３６８９Ｇ３６９３．收稿日期:２０１７Ｇ１０Ｇ１３㊀编辑:张智芳(上接第４５９页)[５５]Y uH B,R a oP S,L e eH C,e t a l．At y p e I I I s e c r e t i o n s y s t e mi s r e q u i r e d f o r A e r o m o n a s h y d r o p h i l a A HＧ１p a t h o g e n e s i s[J]．I nＧf e c t I mm u n,２００４,７２(３):１２４８Ｇ１２５６．D O I:１０．１１２８/I A I．７２．３．１２４８Ｇ１２５６．２００４[５６]V i l c h e s S,J i m e n e zN,T o m a s J M,e t a l．A e r o m o n a s h y d r o p h iＧl a A HＧ３t y p eI I Is e c r e t i o ns y s t e m e x p r e s s i o na n dr e g u l a t o r y n e t w o r k[J]．A p p l E n v i r o nM i c r o b i o l,２００９,７５(１９):６３８２Ｇ６３９２．D O I:１０．１１２８/AE M．００２２２Ｇ０９[５７]S u a r e zG,S i e r r a J C,K i r t l e y M L,e t a l．R o l e o fH c p,a t y p e６s e c r e t i o ns y s t e me f f e c t o r,o f A e r o m o n a s h y d r o p h i l a i nm o d uＧl a t i n g a c t i v a t i o no fh o s t i mm u n ec e l l s[J]．M i c r o b i o l o g y,２０１０,１５６(１２):３６７８Ｇ３６８８．D O I:１０．１０９９/m i c．０．０４１２７７Ｇ０[５８]S h aJ,R o s e n z w e i g J A,K o z l o v aE V,e t a l．E v a l u a t i o no f t h e r o l e s p l a y e d b y H c p a n dV g r G t y p e６s e c r e t i o n s y s t e me f f e c t o r s i n A e r o m o n a s h y d r o p h i l a S S U p a t h o g e n e s i s[J]．M i c r o b i o l o g y,２０１３,１５９(６):１１２０Ｇ１１３５．D O I:１０．１０９９/m i c．０．０６３４９５Ｇ０[５９]B r a u nV．B a c t e r i a l i r o n t r a n s p o r t r e l a t e d t o v i r u l e n c e[J]．C o n tＧr i b M i c r o b i o l,２００５,１２(１２):２１０．D O I:１０．１１５９/００００８１６９７[６０]N a j i m iM,L e m o sM L,O s o r i oC R．I d e n t i f i c a t i o no f i r o n r e g uＧl a t e d g e n e s i n t h e f i s h p a t h o g e n A e r o m o n a s s a l m o n i c i d a s u b s p．s a l m o n i c i d a:g e n e t i cd i v e r s i t y a n de v i d e n c eo f c o n s e r v e d i r o n u p t a k es y s t e m s[J]．V e t M i c r o b i o l,２００９,１３３(４):３７７Ｇ３８２．D O I:１０．１０１６/j．v e t m i c．２００８．０７．００８[６１]S t i n t z iA,R a y m o n dK N．A m o n a b a c t i nＧm e d i a t e d i r o na c q u i s iＧt i o n f r o mt r a n s f e r r i na n d l a c t o f e r r i nb y A e r o m o n a sh y d r o p h iＧl a:d i r e c tm e a s u r e m e n t o f i n d i v i d u a lm i c r o s c o p i c r a t e c o n s t a n t s [J]．JB i o lI n o r g C h e m,２０００,５(１):５７Ｇ６６．D O I:１０．１００７/ P L０００１０６５５[６２]H a n H J,T a k iT,K o n d o H,e ta l．P a t h o g e n i c p o t e n t i a lo f a c o l l a g e n a s e g e n e f r o m A e r o m o n a s v e r o n i i[J]．C a n JM i c r o b i o l,２００８,５４(１):１Ｇ１０．D O I:１０．１１３９/w０７Ｇ１０９[６３]L y n c hM J,S w i f t S,K i r k eD F,e t a l．T h e r e g u l a t i o no f b i o f i l m d e v e l o p m e n t b yq u o r u ms e n s i n g i n A e r o m o n a s h y d r o p h i l a[J]．E n v i r o n M i c r o b i o l,２００２,４(１):１８Ｇ２８．D O I:１０．１０４６/j．１４６２Ｇ２９２０．２００２．００２６４．x[６４]J a n d a J M,G u t h e r t zL S,K o k k aR P,e t a l．A e r o m o n a s s p e c i e s i ns e p t i c e m i a:l a b o r a t o r y c h a r a c t e r i s t i c sa n dc l i n i c a lo b s e r v aＧt i o n s[J]．C l i nI n f e c tD i s,１９９４,１９(１):７７Ｇ８３．D O I:１０．１０９３/ c l i n i d s/１９．１．７７[６５]K r z y m i n s k aS,K a z n o w s k iA,P u k M．I n t e r a c t i o no f A e r oＧm o n a s s p p．h u m a n i s o l a t e sw i t hm u r i n em a c r o p h a g e s[J]．N e w M i c r o b i o l,２００８,３１(４):４８１Ｇ４８８．D O I:１０．１０５３/j．a j k d．２００７．０２．１１８收稿日期:２０１７Ｇ０８Ｇ１８㊀编辑:王晓欢５６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展。

利用环介导等温扩增技术检测新型隐球菌

ａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｎｇＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｗｏｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓ
ｗａｓｄｉｌｕｔｅｄｉｎｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｉｔｈｎｏｎ — ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｌｕｆｉｄ．ｔｏｂｕｉｌｄＣ
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环介导等温扩增技术在病原检测中的应用

环介导等温扩增技术在病原检测中的应用高德臣【摘要】The article introduce the basic principle and characteristic of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and the application of LAMP in detecting infectious disease. The LAMP assay has been adopted widely for the detection of animal pathogens,because of its simplicity,high sensitivity and specificity and detecting easily products etc. At present, the LAMP can be used in detecting porcine circovirus Ⅱ , goose parvovirus, PRV, HPAIV, NDV, Haemophilus parasuis, Listeria monocy-togenes , Mycoplasma hyopneumoina and Toxoplasma gondii etc.%文章介绍了环介导等温扩增技术的的基本原理、特点及其在传染性疾病中检测和诊断的应用.环介导等温扩增技术具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点.环介导等温扩增技术已经被用来快速诊断动物的传染病.目前可检测圆环病毒2型、鹅细小病毒、伪狂犬病病毒、高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、副猪嗜血杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、猪肺炎支原体及弓形虫基因等.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)002【总页数】3页(P219-221)【关键词】环介导等温扩增技术;病原检测;应用【作者】高德臣【作者单位】辽宁职业学院,辽宁铁岭 112000【正文语种】中文【中图分类】S854.4环介导等温扩增技术（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等于2000年开发了一种新的恒温体外核酸扩增技术。

等温扩增实验报告

一、实验背景随着分子生物学技术的不断发展，核酸检测已成为病原体检测的重要手段。

传统的聚合酶链反应（PCR）技术因其灵敏度高、特异性强等特点，在病原体检测中得到了广泛应用。

然而，PCR技术对设备、环境要求较高，且检测过程复杂，限制了其在现场快速检测中的应用。

近年来，等温扩增技术作为一种新型核酸检测技术，因其操作简便、快速、高效等特点，在病原体检测领域展现出广阔的应用前景。

二、实验目的1. 探讨等温扩增技术在病原体检测中的应用效果；2. 评估等温扩增技术与传统PCR技术在病原体检测中的灵敏度和特异性；3. 优化等温扩增实验条件，提高检测效率。

三、实验材料1. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、等温扩增试剂盒、核酸提取纯化试剂盒等；2. 实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统等；3. 实验样本：疑似病原体感染样本。

四、实验方法1. DNA提取：采用DNA提取试剂盒提取样本中的病原体DNA；2. PCR扩增：采用PCR试剂盒对提取的DNA进行扩增；3. 等温扩增：采用等温扩增试剂盒对提取的DNA进行等温扩增；4. 灵敏度评估：通过比较PCR和等温扩增的扩增曲线，评估两种方法的灵敏度；5. 特异性评估：通过比较PCR和等温扩增的扩增产物，评估两种方法的特异性；6. 实验条件优化：通过调整等温扩增反应体系中的各组分浓度、反应时间等，优化实验条件。

五、实验结果1. 灵敏度评估：通过比较PCR和等温扩增的扩增曲线，发现等温扩增的灵敏度显著高于PCR，扩增曲线在低浓度DNA样本中更明显；2. 特异性评估：通过比较PCR和等温扩增的扩增产物，发现等温扩增的特异性与PCR相当，未出现假阳性；3. 实验条件优化：通过调整等温扩增反应体系中的各组分浓度、反应时间等，使等温扩增的灵敏度进一步提高，特异性保持稳定。

六、讨论1. 等温扩增技术在病原体检测中的应用优势：等温扩增技术具有操作简便、快速、高效等特点，适合在基层医疗机构、现场等环境中进行病原体检测。

环介导等温扩增技术在副溶血弧菌快速检测中的应用研究的开题报告

环介导等温扩增技术在副溶血弧菌快速检测中的应用研究的开题报告一、研究背景副溶血弧菌是一种非常常见的细菌，存在于海洋中的各种生物体表面和水体中。

副溶血弧菌引起的病例已成为全球性的重要公共卫生问题。

因此，开发一种快速、准确、方便的检测方法，对于副溶血弧菌的控制和预防非常重要。

传统的副溶血弧菌检测方法包括细菌培养、血凝素试验、PCR等，但这些方法都存在一些缺点，如耗时、精度不高、需要高度训练的技能等。

因此，需要开发新的检测方法以代替传统方法。

随着生物技术和分子生物学的不断发展，等温扩增技术成为一种新兴的检测技术，该技术基础简单、易于操作、准确度高、结果稳定。

由此，本研究将使用环介导等温扩增技术开发一种副溶血弧菌快速检测方法。

二、研究目的本研究旨在开发一种基于环介导等温扩增技术的副溶血弧菌快速检测方法，具体目的包括：1. 获取副溶血弧菌的核酸序列数据，设计特异性良好的引物，并进行环介导等温扩增体系的优化；2. 基于优化的环介导等温扩增技术设计检测方法，包括样本的处理、扩增过程条件和结果分析方法，以确保检测结果的准确性和稳定性；3. 对该方法进行评价和比较，包括与传统检测方法的比较和不同样本类型的评估。

三、研究内容1. 针对副溶血弧菌目标基因靶点设计两个特异性引物，并进行体系的优化和稳定性验证。

2. 开发并优化一种基于环介导等温扩增技术的雷达图谱分析方法，以实现便捷、快速、稳定的副溶血弧菌检测。

3. 针对不同样本类型验证该方法的可行性、稳定性和特异性，并与传统检测方法作比较，评价本检测方法的优越性。

四、研究意义本研究将探索一种新型、快速和准确的副溶血弧菌检测方法，以更好地监控和预防疾病的发生和扩散，为副溶血弧菌感染的预防控制提供参考，具有重要的实际应用价值和社会意义。

此外，本研究的环介导等温扩增技术也可为其他微生物的研究和检测提供借鉴。

《2024年改良的环介导等温扩增技术用于阴沟肠杆菌核酸以及碳青霉烯酶的快速检测》范文

《改良的环介导等温扩增技术用于阴沟肠杆菌核酸以及碳青霉烯酶的快速检测》篇一改良的环介导等温扩增技术用于阴沟肠杆菌核酸及碳青霉烯酶的快速检测一、引言随着生物科技的不断发展，对于微生物疾病及其耐药性的检测与控制成为当今科研领域的重点研究方向。

其中，阴沟肠杆菌作为重要的病原体之一，其传播及抗药性的变化引发了科研人员的高度关注。

因此，建立快速、准确的检测技术是保障医疗安全和推动医药科技发展的重要课题。

本文将重点介绍改良的环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）在阴沟肠杆菌核酸及碳青霉烯酶的快速检测中的应用。

二、环介导等温扩增技术概述环介导等温扩增技术是一种基于DNA恒温扩增技术的核酸扩增方法，其原理是通过特殊的引物设计，利用Bst DNA聚合酶在恒定温度下进行DNA扩增。

这种技术具有操作简便、时间短、灵敏度高、特异性强的优点，因此在病原体检测、基因诊断等领域得到广泛应用。

三、改良的环介导等温扩增技术针对传统LAMP技术的不足，本文提出了一种改良的环介导等温扩增技术。

该技术通过优化引物设计、调整反应条件等方式，提高了检测的准确性和灵敏度，同时降低了非特异性扩增的风险。

此外，改良后的LAMP技术还结合了荧光定量PCR的技术特点，实现了实时监测扩增过程，从而更准确地判断检测结果。

四、在阴沟肠杆菌核酸及碳青霉烯酶检测中的应用（一）阴沟肠杆菌核酸检测利用改良的LAMP技术，可以快速、准确地检测阴沟肠杆菌的核酸。

通过设计特异性引物，结合LAMP技术的恒温扩增特性，可以在短时间内实现阴沟肠杆菌核酸的大量扩增。

同时，通过荧光定量PCR技术的实时监测，可以准确判断扩增结果，为临床诊断和治疗提供有力支持。

（二）碳青霉烯酶检测碳青霉烯酶是阴沟肠杆菌产生的一种重要抗药性酶，其检测对于评估病原菌的耐药性和指导临床治疗具有重要意义。

通过改良的LAMP技术，可以实现对碳青霉烯酶的快速、准确检测。

环介导等温扩增检测下呼吸道感染致病菌的研究的开题报告

环介导等温扩增检测下呼吸道感染致病菌的研究的开题报
告
题目：环介导等温扩增检测下呼吸道感染致病菌的研究
研究背景与意义：
呼吸道感染是临床上常见的疾病之一，由于其症状表现复杂多样，同时致病菌种类较多，因此诊断与治疗都非常具有挑战性。

目前常用的检测方法包括细菌培养、PCR等技术，但存在着一些问题，比如细菌培养需要较长时间、PCR技术存在扩增效率低下等问题。

因此开发一个敏感、快速、特异性强的检测方法对于呼吸道感染的诊断和治疗意义重大。

研究内容：
本研究主要针对环介导等温扩增技术进行探究，评估其在呼吸道感染致病菌的检测中的应用价值。

具体研究内容包括以下几个方面：
（1）选择合适的引物和DETECTR CRISPR技术，针对常见致病菌进行扩增和检测；
（2）优化所选引物的扩增条件（如温度、时间等参数）；
（3）评价其检测灵敏度、特异性和准确性；
（4）对临床样本进行验证实验，并与PCR技术进行对比分析。

研究方法：
采用环介导等温扩增技术，选择合适的引物和DETECTR CRISPR技术，通过对温度和时间等参数的优化，进行致病菌扩增和检测。

利用标准品和临床样本进行灵敏度、特异性和准确性的评价，并与PCR技术进行对比分析，验证其在临床应用中的价值。

预期成果：
本研究将建立起一种快速、特异性强且敏感的环介导等温扩增检测技术，可以有效地应用于呼吸道感染致病菌的检测，并与PCR技术进行对比分析，为呼吸道感染的诊断和治疗提供新的方法和思路。

环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用

环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用循环介导温扩增技术（Cycling Primer Extension, CPE）是一种高效的分子生物学技术，主要用于基因、控制序列、表达调控物质和相关蛋白质之间的相互作用分析。

它常被应用于病原性微生物检测以及病毒基因分子变异分析等方面。

一、循环介导温扩增技术的原理循环介导温扩增技术是一种改良的PCR技术，它能将DNA模板扩增成上百万亿倍左右的数量，以满足分子生物学研究的需要。

该技术的基本原理是将待检测模板上特异性引物结合，并施加高温、低温及中间温度等三种温度环境，在低温下用引物扩增模板，并在特定温度中支配引物限制片段扩增，最后在v高温环境中扩增产物释放，从而通过三种温度环境积累构建双螺旋样的DNA桥梁而达到扩增的目的。

二、循环介导温扩增技术的优势（1）快速、灵敏：循环介导温扩增技术利用低温度和高温度振荡循环，大大提高了扩增速度，并且增强了信号效率，可以充分利用模板，进而提高检测灵敏度。

（2）省时省钱：循环介导温扩增技术使用到的耗材比PCR来得少，扩增速度更快，是一种省时省钱的技术。

（3）容易操作：CPE程序简单，操作过程相对PCR要简单，与实验室常规仪器一般可以完成，且实验室中的反应条件也相对简单，不存在PCR实验中的活性危险，也不存在贴壁细菌和操作技术考验棘手的问题。

三、循环介导温扩增技术在病原微生物检测中的应用（1）病毒检测：CPE技术可以快速灵敏地检测SARS-CoV-2病毒，从而帮助监测新型冠状病毒的传播趋势。

（2）细菌检测：CPE技术可以检测各种细菌产生的毒力因子，如真菌毒素和E. Coli有毒因子。

（3）NDM-1耐药基因及AMR的表型检测：NDM-1耐药基因和AMR 抗药菌的表型检测，可以快速确定环境中微生物的耐药基因断裂和AMR抗药菌表型，为后续的抗药策略的分析提供了依据。

四、总结循环介导温扩增技术灵活、方便，既可以用于病毒检测，也可以用于细菌检测，此外，它还可以用于耐药基因及抗药性表型的检测。

环介导等温扩增技术作为基因快速诊断方法的研究与展望

环介导等温扩增技术作为基因快速诊断方法的研究与展望袁向芬;吕继洲;吴绍强;王巧黎;赵宏【摘要】环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型分子诊断技术,具有灵敏度高、反应快速等优点,且仅利用简单的恒温水浴设备即可实现对特异性靶基因的高效扩增,在分子诊断领域具有巨大潜力.近几年来LAMP技术在分子诊断领域的研究非常广泛,涉及细菌、病毒、寄生虫的检测及食品转基因成分检验等诸多方面,受到越来越多学者认可,有研究者认为其可作为PCR的替补技术应用于临床基因诊断工作中.然而由于目前该技术缺乏规范化且成熟配套的上下游技术措施,如快速简单的核酸抽提技术、完善的应用体系和方案、防止交叉污染的有效措施及小型便携的检测设备等,因此在现场即时诊断领域的推广应用较为缓慢.为发挥利用LAMP技术在快速基因诊断方面的优越性,科研人员针对LAMP技术开发应用存在的问题开展了大量研究工作.立足于临床基因快速诊断的技术需求,对影响LAMP技术应用的核酸物质的快速抽提、LAMP检测体系的优化完善、结果判定、假阳性结果的规避、结果确诊及现场诊断一体化平台设计应用等领域的发展现状、需要攻克的难点及未来的应用展望进行综述,以期为未来的研究和开发指明方向,促进LAMP技术的不断完善及临床推广应用.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)010【总页数】7页(P64-70)【关键词】环介导等温扩增技术;初筛技术;现场即时诊断【作者】袁向芬;吕继洲;吴绍强;王巧黎;赵宏【作者单位】中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京 100176;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京 100176;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京 100176;青岛市中心医院,青岛 266042;青岛市中心医院,青岛 266042【正文语种】中文2000年，日本学者Notomi发明了一种新型等温核酸扩增方法——环介导等温扩增技术（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）［1］，经近20年研究积累，该方法灵敏度高、特异性强、易于操作等优点已被广泛接受，LAMP 亦被认为是一种可有效规避PCR检测对仪器设备的依赖、行之有效的现场快速筛查技术，并开始应用于病原微生物及物种鉴定、疫病现场检测、临床诊疗等领域。

环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告

环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告一、选题的必要性1、项目所处技术领域产业政策本项目属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，项目主要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检测技术的研究与试剂盒的开发，本项目的实施可产生具有自主知识产权的科研成果。

本项目技术含量高，市场竞争力强，项目完成后能够产生较好的经济效益和社会效益，项目符合国家产业、技术政策。

2、项目所处技术领域技术发展现状目前的病原菌检测方法费时、费力、准确性低，开发快速、准确、低成本的检测技术和配套试剂是病原菌检测工作中亟待攻克的难题。

本项目针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度、高特异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂。

3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用环介导等温扩增是利用4个特殊设计的引物和具有链臵换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。

该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝。

LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。

该技术的推广对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进步有推动作用。

4、项目目前进展情况课题组开展了大量前期研究工作，已完成了本项目所需的科研平台建设任务，开展了嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，取得了阶段性研究成果，这些工作为本项目的顺利完成奠定了基础。

二、技术方案论述（一）项目技术关键点和创新点，项目完成时达到的技术水平1、技术关键（1）本项目的技术关键之一是引物设计。

与常规PCR引物不同，环介导等温扩增引物设计难度大，一组引物要求有6个位点与靶序列完全匹配才能够进行扩增。

目前我们已从国际基因组数据库中下载了部分病原菌的基因组DNA，并根据基因组特点采用等温扩增软件设计了部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。

环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行研究报告-11页word资料

环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告李思光南昌大学一、选题的必要性1、项目所处技术领域产业政策本项目属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，项目主要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检测技术的研究与试剂盒的开发，本项目的实施可产生具有自主知识产权的科研成果。

本项目技术含量高，市场竞争力强，项目完成后能够产生较好的经济效益和社会效益，项目符合国家产业、技术政策。

本项目针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度、高特异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂。

3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用环介导等温扩增是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。

该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝。

LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。

该技术的推广对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进步有推动作用。

二、技术方案论述（一）项目技术关键点和创新点，项目完成时达到的技术水平1、技术关键（1）本项目的技术关键之一是引物设计。

与常规PCR引物不同，环介导等温扩增引物设计难度大，一组引物要求有6个位点与靶序列完全匹配才能够进行扩增。

环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用

环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用环介导等温扩增技术是一种新兴的核酸扩增技术，具有操作简便、快速、高灵敏度、高特异性等优点，被广泛应用于病原微生物检测、基因检测、环境监测等领域。

本文就环介导等温扩增技术的原理、特点及其在病原微生物检测中的应用进行综述。

关键词：环介导等温扩增技术；病原微生物检测；核酸扩增；特异性；灵敏度一、引言病原微生物是引起人类疾病的主要原因之一。

传统的病原微生物检测方法包括细菌培养、免疫学检测、荧光定量PCR等，这些方法虽然具有一定的灵敏度和特异性，但存在操作繁琐、时间长、误差大等缺点。

因此，需要开发一种操作简便、快速、高灵敏度、高特异性的病原微生物检测技术。

环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种新兴的核酸扩增技术，具有上述优点，被广泛应用于病原微生物检测、基因检测、环境监测等领域。

本文就环介导等温扩增技术的原理、特点及其在病原微生物检测中的应用进行综述。

二、环介导等温扩增技术原理环介导等温扩增技术是一种在等温条件下进行的核酸扩增技术，其基本原理是利用Bst DNA聚合酶（Bacillus stearothermophilusDNA polymerase）的特殊性质，在等温条件下在DNA模板上进行连续的DNA合成反应，形成具有特异性的DNA扩增产物。

环介导等温扩增技术的反应体系包括以下三个主要部分：（1）Bst DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶是环介导等温扩增反应的关键酶，它具有在等温条件下高效地进行DNA合成的特殊性质，并且在反应过程中可以分解反应体系中的双链DNA和单链DNA，从而释放出反应所需的DNA单链模板。

（2）四个特异性的引物：环介导等温扩增技术需要使用四个特异性的引物（F3、B3、FIP和BIP），它们可以在等温条件下诱导DNA 链的循环扩增，从而形成高度特异性的DNA扩增产物。

环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用

㊃综述㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2024.07.031环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用*廖川1,梁丽娜1,黄少宇2,马梦霞3,李雪斌4综述,韦贵将1ә审校1.右江民族医学院附属医院医学检验中心/广西高校高发病临床分子诊断研究重点实验室/百色市高发病临床分子诊断与研发重点实验室,广西百色533000;2.广西壮族自治区田东县人民医院医学检验科,广西百色533000;3.右江民族医学院医学检验学院,广西百色533000;4.右江民族医学院附属医院神经内科,广西百色533000摘要:病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速㊁准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义㊂环介导等温扩增(L AM P )是一种恒温扩增方法,具有反应时间短㊁操作简便㊁灵敏度高㊁特异度高㊁检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断㊂基于这种情况,该文主要阐述了L AM P 的原理㊁特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展㊂L AM P 技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性㊁引物设计复杂等不足之处㊂该文综述了近年来L AM P 技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向㊂关键词:环介导等温扩增技术; 核酸检测; 病原微生物; 核酸扩增; 结核分枝杆菌中图法分类号:R 446.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)07-1003-06A p p l i c a t i o n o f l o o p -m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t e c h n i qu e i n p a t h o g e n i c m i c r o o r ga n i s m s c l i n i c a l d e t e c t i o n *L I A O C h u a n 1,L I A N G L i n a 1,HU A N G S h a o y u 2,MA M e n g x i a 3,L I X u e b i n 4,WE I G u i j i a n g1ә1.M e d i c a l L a b o r a t o r y C e n t e r ,A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Y o u j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y fo r N a t i o n a l i t i e s /K e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a l M o l e c u l a r D i a g n o s i s a n d R e s e a r c h f o r H i gh I n c i d e n c e D i s e a s e s i n G u a n g x i U n i v e r s i t i e s /B a i s e K e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a l M o l e c u l a r D i a gn o s i s ,R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t f o r H i g h I n c i d e n c e D i s e a s e s ,B a i s e ,G u a n g x i 533000,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f M e d i c a l L a b o r a t o r y ,T i a n d o n g C o u n t y P e o p l e 's H o s p i t a l o f G u a n g x i Z h u a n g A u t o n o m o u s R e g i o n ,B a i s e ,G u a n g x i 533000,C h i n a ;3.S c h o o l o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,Y o u j i a n g Me d i c a l U n i v e r s i t yf o r N a t i o n a l i t i e s ,B a i s e ,G u a ng x i 533000,Chi n a ;4.D e p a r t m e n t o f N e u r o l o g y ,A f fi l i a t e d H o s p i t a l o f Y o u j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y f o r N a t i o n a l i t i e s ,B a i s e ,G u a n gx i 533000,C h i n a A b s t r a c t :P a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s a r e o n e o f t h e i m p o r t a n t f a c t o r s t h r e a t e n i n g h u m a n h e a l t h .R a pi d a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n m e t h o d s a r e o f g r e a t s i g n i f i c a n c e f o r t h e d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s .L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n (L AM P )i s o n e o f t h e i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o d s ,w h i c h h a s t h e a d v a n t a ge s of s h o r t r e a c t i o n t i m e ,s i m p l e o p e r a t i o n ,h igh s e n si t i v i t y ,h i g h s p e c i f i c i t y a n d l o w c o s t ,s o i t i s w i d e l y us e d i n t h e r a p i d d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s .B a s e d o n t h i s s i t u a t i o n ,t h i s p a p e r m a i n l y e l a b o r a t e s t h e p r i n c i pl e a n d c h a r a c t e r i s t i c s o f L AM P a n d i t s a p p l i c a t i o n a n d r e s e a r c h p r o g r e s s i n t h e d e t e c t i o n o f c o mm o n p a t h o g e n i c m i -c r o o r g a n i s m s i n c l i n i c .L AM P t e c h n o l o g y h a s b e e n a p p l i e d t o t h e d e t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r ga n i s m s w i t h h i g h s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y ,b u t t h i s t ec h n o l o g y i s s t i l l p r o n e t o p r od u cef a l s e p o s i t i v e ,c o m p l e x p r i m e r d e -s ig n a n d o th e r s h o r t c o mi n g s .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e a p p l i c a t i o n a n d p r o g r e s s o f L AM P t e c h n o l o g y in p a t h o -g e n i c m i c r o b i a l i n f e c t i o n i n r e c e n t y e a r s ,a n d o u t l o o k s i t s f u t u r e d e v e l o p m e n t p r o s pe c t i n o r d e r t o p r o v i d e a r e a s o n a b l e r e s e a r c h d i r e c t i o nf o r t h e r a p i d d i ag n o s i s o f p a th o ge n i c m i c r o b i a l i nf e c t i o n i n t h e e n v i r o n m e n t w i t h l i m i t e d r e s o u r c e s .K e y w o r d s :l o o p -m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t e c h n i q u e ; n u c l e i c a c i d t e s t ; p a t h o g e n i c m i c r o o r -g a n i s m ; n u c l e i c a c i d a m p l i f i c a t i o n ; m yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s ㊃3001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n ,A pr i l 2024,V o l .21,N o .7*基金项目:国家自然科学基金项目(82260418,82060570);右江民族医学院附属医院高层次人才项目(R 202011701);广西壮族自治区百色市科学研究与技术开发计划项目(百科20232031)㊂ә通信作者,E -m a i l :w e i g u i j i a n g2021@163.c o m ㊂病原微生物是指能够引起人和动物疾病的微小生物,对人类健康具有极大的威胁㊂临床上很多常见疾病都是病原微生物感染导致的,如各种病毒性肝炎㊁结核病㊁新型冠状病毒感染等,这类疾病通常都具有一定的传染性,有的甚至可以造成世界范围的大流行㊂因此,临床迫切需要一种能够准确㊁高效㊁快速㊁简便地识别相关病原体的检测方法㊂随着分子生物学研究的不断深入,核酸扩增技术在诊断领域的应用越来越广泛㊂其中最具代表性的是聚合酶链反应(P C R),它能在短时间内对靶标完成指数级扩增,且具有较高的灵敏度和特异度[1],因此很多病原微生物检测都将其作为诊断的参考标准㊂然而,P C R需要经历变温过程,对设备和操作者要求较高,从而导致其在欠发达地区和现场实施检测上的应用受到一定的限制㊂而等温扩增技术的出现就很好地解决了这一问题,该技术在恒定温度下即可完成扩增反应,摆脱了对高精密热循环仪的依赖,有望取代P C R在诊断领域的地位㊂环介导等温扩增(L AM P)是由日本荣研株式会社N O T OM I等[2]于2000年研发,是一种较为成熟的等温扩增法,具有高效㊁快速㊁灵敏度高㊁特异性度强等优点,因此被应用于医学领域中细菌㊁病毒㊁寄生虫的检测[3-4]㊂1 L AM P的反应原理与特点1.1 L AM P的反应原理 L AM P的扩增过程可以分为两个阶段,即起始阶段和扩增循环阶段[2],扩增完成后可与多种技术相结合实现扩增产物的检测,不同的技术有不同的检测原理,如试纸条法㊁荧光法等,本文主要讲述L AM P的扩增原理㊂在扩增的过程中需要引物的参与,和其他扩增方法不同的是,L AM P 需要设计2对引物,即内部引物(F I P/B I P)和外部引物(F3/B3),通过这两对引物对靶基因的6个不同区域(F1-F1c㊁F2-F2c㊁F3-F3c㊁B1-B1c㊁B2-B2c㊁B3-B3c)特异性识别,因此L AM P具有极强的特异性㊂在起始阶段,当温度达到60~65ħ时,双链D N A处于解旋与结合的不稳态,其中上游内部引物F I P中的F2序列区段首先与模板目标区段的单链D N A中的F2c结合,在B s t D N A聚合酶的作用下自F2的3'末端延伸启动链置换D N A合成㊂外引物F3则与模板F3c结合并延伸,置换出由F I P链接的互补单链D N A,此单链的F1c与F1区段为互补结构,可通过自我碱基配对形成环状结构㊂以上述步骤中合成的5'端以茎环状结构的单联D N A为模板,下游内部引物B I P的B2序列区段与单链D N A模板的B2c 结合,在B s t D N A聚合酶的作用下启动链置换反应,自B2的3'末端开始延伸合成D N A㊂外引物B3则与模板B3c结合并延伸,置换出由B I P链接的互补单链D N A,此单链的F1与F1c区段互补,B1c与B1区段互补,形成哑铃状结构的单链D N A㊂哑铃状结构以3'末端的F1区段为起点,以自身为模板进行D N A合成㊂由此,哑铃状结构转变为茎环状结构,L AM P扩增进入循环阶段㊂循环阶段以起始阶段形成的单链D N A为模板,在内部引物与B s t D N A聚合酶的作用下,反复进行延伸和链置换反应,最终产生大量具有多个靶标反向重复序列的茎环D N A结构[2]㊂1.2 L AM P的特点 L AM P不需要进行高温变性,整个过程在60~65ħ反应60m i n即可完成㊂与其他核酸扩增法相比,L AM P具有更高的特异性和抗干扰性,因为它是通过2对引物特异性识别靶基因上的6个不同区域来启动反应㊂此外,L AM P的灵敏度也很高,能够在短时间内扩增出1ˑ107~1ˑ1010数量级的产物,比常规P C R高100倍左右[5],有报道指出L AM P最低可检测10个基因拷贝或更低的检测限[6]㊂而且L AM P对设备要求不高,一般的水浴锅即可满足需求㊂因此,L AM P具有高效㊁灵敏度高㊁特异性强㊁简便等优点㊂当然,L AM P也有其不足之处:首先,L AM P反应需要2对引物参与,因此对引物设计要求较高,如果引物设计不合理,就可能产生非特异性扩增片段影响结果的正确性㊂其次,由于L AM P 的灵敏度很高,在反应过程中易产生气溶胶污染,导致假阳性结果㊂最后,由于L AM P的扩增产物是长短不一且含有大量茎环结构的D N A双链,因此很难对其扩增产物进行定量分析㊂2 L AM P技术在病原微生物临床检测中的应用目前,临床上对于病原微生物感染的诊断方法主要有培养法㊁血清学方法及P C R㊂但这些方法都有其不足之处:培养法耗时较长;血清学方法特异度不高,易产生假阳性结果;P C R对设备和实验环境要求较高㊂而L AM P因其具有灵敏度高㊁特异性强㊁操作简便等优点,有望取代传统技术在病原微生物检测中的地位㊂2.1 L AM P技术在新型冠状病毒检测中的应用新型冠状病毒感染者主要表现为发热㊁咳嗽,严重者会休克甚至死亡㊂虽然目前已经上市了大量的疫苗,但对新型冠状病毒快速㊁准确㊁高效地诊断仍然是疫情防控的关键㊂实时反转录P C R因具有特异性强㊁灵敏度高等优点,被视为诊断新型冠状病毒感染的金标准[7],但它耗时较长,而且对设备和操作人员的要求也较高,因此在资源匮乏地区和现场实时检测新型冠状病毒的应用方面受到一定的限制㊂L AM P作为一种恒温扩增法,不仅操作简便,而且其灵敏度不低于反转录P C R[8],因此L AM P可以作为反转录P C R的替代方法以弥补其不足之处㊂目前,已经有大量基于L AM P的试剂盒被用于新型冠状病毒的检测,E i k e n 公司开发的L o o p a m p T M新型冠状病毒检测试剂盒基于N基因和R d R p基因设计,通过测量反应体系浊度确定检测结果㊂为了评估L o o p a m p T M新型冠状病毒㊃4001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7检测试剂盒的有效性,Y A N等[9]用该试剂盒检测新型冠状病毒,并使用L A-200浊度计对扩增产物进行实时检测,结果表明该反应能够在35m i n内检测到水平为10c o p y/μL的R N A㊂HU A N G等[4]针对新型冠状病毒的O R F1a b㊁S㊁N基因,将比色法与L AM P结合用于检测新型冠状病毒,该方法仅需30 m i n即可完成检测,通过肉眼判读结果,无须精密仪器,且灵敏度可达80c o p y/μL㊂此外,L AM P还可以和荧光检测[10]㊁微流控[11]等技术结合用于检测新型冠状病毒㊂这些方法的建立为新型冠状病毒快速㊁准确㊁高效地检测提供了新的思路,也为疫情防控做出了重大贡献㊂2.2 L AM P技术在结核分枝杆菌检测中的应用结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌㊂2020年世界卫生组织(WHO)报告显示,我国结核感染人数位居世界第3位[12]㊂早期诊断并给予恰当的治疗是控制结核病传播的关键,因此,临床迫切需要寻找一种快速㊁准确㊁简单的检测方法㊂L AM P能在60~65ħ的条件下对结核分枝杆菌进行快速检测,1h即可完成试验[13]㊂贾枫等[14]通过临床试验对比了抗酸染色法㊁L AM P法和改良罗氏培养法检测痰标本中结核分枝杆菌的阳性率㊁灵敏度和特异度㊂结果表明L AM P法在结核分枝杆菌的诊断中具有快速㊁灵敏等优点㊂此外,L AM P对于一些罕见的肺外结核病的诊断也具有很高的价值㊂K H A N 等[15]以m p t64和p s t S1为靶点,建立了多靶点L AM P检测骨关节结核患者结核分枝杆菌的方法,结果表明多靶点L AM P在骨关节结核总病例中的灵敏度显著高于多重P C R和G e n e X p e r t㊂S H A R MA 等[16]采用I S6110和M P B64靶点对35例临床疑似胃肠道结核患者的回盲活检标本和30例非结核对照者的回盲活检标本进行结核分枝杆菌复合体L AM P检测㊂结果表明,L AM P检测胃肠道结核分枝杆菌的灵敏度明显高于I S6110P C R和培养法㊂此外,在结核病的诊断方面,仍有大量基于L AM P的新技术不断被开发出来㊂如将L AM P技术与基于纳米颗粒的侧流装置(L F D)[17]及微流控芯片[18]等技术的联合应用㊂由此可见L AM P在结核病的诊断发面也有广阔的前景㊂2.3 L AM P技术在沙门菌检测中的应用沙门菌是全球最主要的食源性致病菌㊂若误食含有沙门菌的食物可导致食物中毒,严重者会引发肠胃炎㊁败血症等症状,若不及时就医甚至会危及生命㊂因此该菌被世界卫生组织(WHO)列为具有中等乃至严重危害的食源性病原菌[19]㊂目前临床上主要通过传统的实验室方法在标本中检测沙门菌㊂但这些传统的实验室方法操作复杂㊁耗时较长,需要3d以上才能通过多个分析步骤获得结果㊂近年来,随着核酸检测技术的不断发展与完善,许多基于核酸扩增的技术已经被广泛使用,如P C R㊁实时P C R等,这些方法均能将检测时间缩短到3d以内[20]㊂其中P C R虽然灵敏度高,但需要配备训练有素的人员和复杂的热循环仪,这使得其难以在设备不足的实验室和资源匮乏的现场环境中应用㊂而L AM P作为一种新型的核酸扩增技术,在病原微生物的检测方面有其独特的优势㊂自2005年L AM P被应用于沙门菌的检测之后,已经开发出数十种基于L AM P的沙门菌检测方法,这给临床早期诊断沙门菌感染带来了新的希望㊂近年来,随着对L AM P技术的深入研究,大量的商业试剂盒被用于沙门菌的快速检测[21]㊂此外,还有一些基于L AM P的新技术被开发出来㊂试纸条作为一种简单㊁快速的检测方法,常与L AM P技术结合用于现场快速检测,朱传新等[22]建立了环介导核酸恒温扩增结合试纸条(L AM P-L F D)检测技术用于沙门菌的快速检测,30m i n内即可完成检测,其灵敏度与P C R相当,为10c o p y/μL㊂D R A Z等[23]将L AM P与酶联免疫吸附试验(E L I S A)联合用于检测沙门菌D型血清型菌株,检测灵敏度为1ˑ103C F U/m L,比P C R-E L I S A的灵敏度高10倍㊂D R A Z等[23]将L AM P与表面增强拉曼技术联合用于检测肠炎沙门菌,其灵敏度比常规P C R高10倍,达到了66C F U/m L㊂与P C R相比,L AM P不仅快速㊁简单,而且具有高灵敏度㊁高特异度等优点,因此, L AM P技术具有替代传统方法检测沙门菌的潜力㊂2.4 L AM P技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用金黄色葡萄球菌是一种常见的机会致病菌,当机体免疫力降低时,它可以迁移到其他组织或器官造成感染,严重者甚至出现菌血症,具有较高的致死率㊂目前临床上金黄色葡萄球菌的常规检测方法是微生物培养法,这种方法虽然具有较高的灵敏度和准确性,但检测过程烦琐㊁耗时较长[24]㊂很多患者因此错过了最佳治疗期㊂因此,开发一种快速㊁可靠的检测方法来检测金黄色葡萄球菌是临床上迫切需要的㊂近年来,越来越多的分子诊断技术被用于病原微生物的分类鉴定,与培养法相比,分子诊断技术具有快速㊁准确㊁灵敏等优点,常见的分子诊断技术有P C R㊁重组酶聚合酶扩增技术(R P A)㊁L AM P等㊂其中P C R在金黄色葡萄球菌的临床标本检测中具有较高的准确率[25],然而,由于需要昂贵的设备和熟练的操作人员,P C R在资源匮乏地区的应用受到一定的限制㊂L AM P作为一种恒温扩增法,无须昂贵的设备和复杂的操作步骤㊂WU等[3]开发了一种基于L AM P 的可视化检测法,通过使用比色指示剂羟基萘酚蓝目视检测金黄色葡萄球菌,结果表明L AM P的检测限为每反应8c o p y或每反应400C F U㊂与常规P C R相比,L AM P将检测限降低至1/10㊂邹作成等[26]也设㊃5001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7计了基于n u c基因的L AM P可视化检测法,该方法的检测限可达5.6ˑ101C F U/m L,其灵敏度比常规P C R高出10000倍㊂L I M等[27]以金黄色葡萄球菌的s p a和a r c C基因为靶标,将L AM P与P C R对比,结果表明二者的特异度㊁阳性预测值和阴性预测值完全一致,L AM P的检测限为2.5n g/μL或1ˑ102 C F U/m L,而P C R的检测限为12.5n g/μL或1ˑ103 C F U/m L㊂由此可见,在检测金黄色葡萄球菌方面,与P C R相比,L AM P不仅具有同样的特异度和准确率,而且检测时间更短,灵敏度更高㊂因此L AM P是一种很有前途的快速检测金黄色葡萄球菌的方法㊂2.5 L AM P技术在乙型肝炎病毒(H B V)检测中的应用 H B V是一种环状部分双链D N A病毒,主要通过血液传播,由于H B V感染早期没有任何症状,且感染者血液内缺乏乙型肝炎表面抗原,H B V-D N A含量较低,因此很难在早期检测到H B V感染㊂E L I S A和实时定量P C R是目前临床检测H B V最常用的方法[28],然而E L I S A诊断乙型肝炎的灵敏度非常低[29],实时定量P C R作为E L I S A的替代方法,其灵敏度较高,但它对实验设备和环境要求也很高[30],在资源不足的情况下很难满足,因此,需要开发出一种快速㊁灵敏㊁特异㊁易于使用的H B V检测方法㊂C H E N等[31]通过使用L AM P检测H B V,该方法可以不用提取D N A直接检测血液中的H B V,其灵敏度为每反应10c o p y,与P C R相当㊂C HE N等[32]设计了一种L AM P与基于纳米颗粒的LF D用于临床上H B V的检测,在60m i n内即可完成结果的读取,其灵敏度为每反应7.5I U㊂MA I T Y等[33]同样将L AM P与L F D结合用于检测H B V,结果表明H B V-L AM P-L F D法检测H B V的灵敏度为92%,特异度为100%,检测限低至500p g/μL㊂为了更好地评估L AM P对H B V诊断的准确性,C H E N等[34]通过检索E m b a s e㊁C o c h r a n e L i b r a r y和P u b M e d数据库中使用L AM P检测H B V的研究,然后使用Q U A D A S-2工具提取数据并评估文献质量,分析发现L AM P检测H B V的灵敏度和特异度分别为0.91和0.97,阳性似然比㊁阴性似然比㊁诊断优势比分别为16.93㊁0.08和397.57㊂由此可见,与P C R相比,L AM P是一种简便㊁快速㊁有效的检测H B V的方法㊂因此, L AM P可以取代其他方法用于临床诊断H B V感染㊂2.6 L AM P技术在华支睾吸虫检测中的应用华支睾吸虫又称肝吸虫,是临床上常见的一种人类寄生虫,主要流行于中国㊁韩国和越南等国家[35]㊂感染早期无明显症状,随着病情的发展,患者会出现腹部不适㊁黄疸㊁发热㊁呕吐和腹泻等,甚至可能引发癌变,因此华支睾吸虫被WHO的国际癌症研究机构归类为Ⅰ类生物致癌物[36]㊂华支睾吸虫的准确诊断对于患者的治疗极为重要,目前临床上主要通过涂片镜检法和血清学方法来诊断华支睾吸虫,但镜检法阳性率较低,因此轻度感染病例可能会被遗漏;而血清学方法又无法判断是既往感染还是现在感染[37]㊂虽然已经开发出了几种基于P C R的检测方法,但它们的灵敏度和特异度波动较大[38]㊂近年来,L AM P也被用于华支睾吸虫的检测,R A HMA N等[39]将L AM P用于检测从韩国的华支睾吸虫疫区采集的人粪便样品,并使用K a t o-K a t z 方法和实时P C R作为参考标准,L AM P测定显示灵敏度为97.1%(95%C I:90.1%~99.2%),特异度为100.0%(95%C I:92.9%~100.0%)㊂此外,朱海等[40]以华支睾吸虫I T S2基因为靶标成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的L AM P方法,该方法对华支睾吸虫成虫D N A的最低检出限可达到3.33ˑ10-4n g/μL,灵敏度和特异度与P C R法一致,均为100%,相对于P C R,L AM P不仅具有很高的灵敏度和特异度,而且操作更加简便㊁反应时间更短㊂因此,L AM P完全可以替代其他方法用于临床检测华支睾吸虫㊂3总结与展望3.1 L AM P的优势 L AM P是一种新型的恒温扩增技术,在模板㊁多条引物及链置换酶的参与下,无须温度循环即可快速完成扩增过程㊂与P C R相比, L AM P无须精密的控温装置,操作简便㊁快捷,更适用于资源条件有限的基层医院使用,在病原微生物的现场检测方面有非常广阔的前景㊂3.2 L AM P的不足近年来,L AM P技术发展迅速,但仍然面临着许多困难与挑战:(1)由于L AM P 技术灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染,加上目前国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题比较严重,因此需要通过设置空白对照确定是否为假阳性,并且在实验过程中使用实时浊度仪,避免开盖导致的污染㊂(2)L AM P与其他恒温扩增法不同,它需要2对引物参与反应,因此引物设计比较复杂,有些疾病的靶基因可能不适合用L AM P方法检测㊂(3)由于L AM P技术发展时间较短,因此它的集成检测设备不够成熟㊁商品化应用有待加强㊂3.3未来展望随着L AM P技术的发展及其与多学科技术的联合创新,上述问题都将会得到解决㊂总之,L AM P技术作为一种新型核酸扩增检测技术,在现场快速检测和基层应用于诊断病原微生物感染的前景较广阔,但仍需要不断深入研究㊂参考文献[1]K E L L E R M,N A U E J,Z E N G E R L E R,e t a l.A u t o m a t e df o r e n s i c a n i m a l f a m i l y i d e n t i f i c a t i o n b y n e s t e d P C R a n dm e l t c u r v e a n a l y s i s o n a n o f f-t h e-s h e l f t h e r m o c y c l e r a u g-m e n t e d w i t h a c e n t r i f u g a l m i c r o f l u i d i c d i s k s e g m e n t[J].㊃6001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7P L o S O n e,2015,10(7):e0131845.[2]N O T OM I T,O K A Y AMA H,MA S U B U C H I H,e t a l.L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n o f D N A[J].N u-c l e i c A c id s Re s,2000,28(12):e63.[3]WU C,Z E N G Y,H E Y.R a 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环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展讲解

生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2009年增刊·技术与方法·核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段,其中PCR技术最为常用。

但在应用过程中人们发现PCR技术存在一些不足,如靶基因易被污染,可能引起非特异性扩增,多种因素可以产生抑制扩增反应,扩增反应时间较长,一般需要几小时,需要比较昂贵的PCR仪,不利于在基层实验室推广应用等。

2000年,日本学者Notomi等[1]建立了一种新的核酸扩增方法———环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP技术,该技术克服了PCR技术的一些缺点。

目前已在人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的检测中取得重要进展,在疫病诊断领域显示出广阔的应用前景。

1LAMP技术原理LAMP技术依赖于能够识别靶序列上6个独立区域的两对特异性引物(内引物:FIP和BIP;外引物:F3和B3和一种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶,在等温条件下可高效、特异的扩增靶序列。

LAMP反应过程是先由外部引物扩增出内部引物扩增所需要的模板,即起始反应物模板的合成;紧接着由内部引物引导合成靶基因DNA 片段,由于内部引物扩增的DNA片段含有与该引物5’端DNA 片段的反向互补序列,因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构,另外一条内部引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应,在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构,形成哑铃状结构,如此往复循环最后形成花椰菜形状的茎———环结构的DNA,数量级可达109~1010拷贝,电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成,呈梯状条带。

LAMP反应体系和PCR反应体系相似,即由模板、引物、聚合酶、dNTP和缓冲液组成。

但LAMP使用四个引物,聚合酶为Bst DNA聚合酶。

LAMP扩环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展郑洋妹1陈信忠2(1福建农林大学动物科学学院,福州350002;2厦门出入境检验检疫局,厦门361026摘要:综述了环介导等温扩增技术检测病毒、细菌和寄生虫等动物病原方面的研究和应用最新进展。