细胞计数

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最全的各种细胞计数方法总结，赶紧收藏

随着医学检验技术的不断发展，曾经每个检验人必须掌握的各类细胞手工计数方法都被各种仪器所替代了，现在医院检验科年轻点的同志可能都不知道红细胞、白细胞等手工计数的方法了。可能年轻人不服气了说，现在都有仪器来做哪还需要掌握这个？No，No，No，小编告诉大家，其实掌握这些其实非常实用的，先进的仪器固然能为我们及时快速的提供检验结果，但是当仪器对细胞计数分类出现异常时，手工显微镜检查就显的尤为重要。大家可以通过每年检验职称考试都会出现这种类型的题目就会发现。现在小编给大家总结下各类细胞的手工计数原理及方法，供大家参考。

一、红细胞计数

1.原理：用等渗稀释液将血液稀释一定倍数，充入血细胞计数池，计数一定体积内的红细胞，经换算求出每升血液中红细胞数量。

2.操作：

1）取中号试管1支,加红细胞稱释液2.0ml

2）用清洁干燥微量吸管取末梢血10μl,擦去管外余血后加至红细胞稀释液底部,再轻吸上层清洗吸管2-3次立即混匀。

3）混匀后,用干净微量吸管将红细胞悬液充人计数池,不得有空泡或外溢,充池后静置2-3min后计数

4）高倍镜下依次计数中央大方格内四角和正中共5个中方格内的红细胞。对压线细胞按“数上不数下、数左不数右”的原则进行计数。

3.计算：

红细胞数/L=5个中方格内红细胞数×5×10×200×106

=5个中方格内红细胞数×1010

=5个中方格内红细胞数÷100×1012

公式中：

×5 5个中方格换算成1个大方格；

×10 1个大方格容积为0.1μl，换算成1.0μl；

细胞计数板的使用方法

细胞计数板是一种用于计算液体中细胞数量的实验仪器，广泛应用于生物学、医学、生化学等领域。

1. 准备工作：首先，确保细胞计数板和显微镜等设备是干净的。使用无纺布或纸巾轻轻擦拭细胞计数板和显微镜镜片表面，确保没有灰尘或污垢。

2. 取样：将需要计数的细胞悬液充分摇匀，并使用一根吸管或移液器将约10 μl的悬液吸起。

3. 加样：将吸取的悬液滴在细胞计数板的一个计数室（通常是一个小的方形区域）中。确保滴入的悬液不会溢出计数室，以避免误差。

4. 显微镜观察：使用显微镜将计数室的细胞放大到适当倍数。通常，使用40倍或100倍镜放大细胞会更容易进行计数。调节显微镜的对焦和光照使细胞清晰可见。

5. 细胞计数：用显微镜通过目视或帮助计数的软件来计数计数室内的细胞。一般来说，通过从左上角开始顺时针或逆时针移动显微镜视野，并计算每个小方格内的细胞数量。

6. 计数室细胞数量的计算：根据计数室的大小和计数室中细胞的总数，以及所

使用的倍数，计算出每个计数室内的平均细胞数量。通常，计数室内每个小方格的面积和厚度在细胞计数板上都有标记。

7. 样本体积与细胞密度的计算：利用计数室内的平均细胞数量，结合计数室的体积，可以计算出样本中的细胞密度。根据需要，这可以使用以下公式计算：细胞密度（cells/ml）= 细胞数÷（计数室体积×加样体积）

8. 数据记录与分析：将结果记录下来，并根据需要进行数据的分析和进一步处理。

需要注意的是，在使用细胞计数板时要小心操作，避免细胞污染和误差的发生。同时，细胞计数板的使用方法可能会因具体型号或厂家的要求而有所不同，建议参考厂家提供的使用说明书。

细胞计数方法有哪些

细胞计数对于细胞生物学的研究至关重要。它可以用于许多不同的应用，例如研究细胞生长、分裂、死亡以及受到不同条件或处理的影响。在本篇回答中，我将介绍一些常见的细胞计数方法，以及它们的优缺点和适用范围。

1. 显微镜计数法：

显微镜计数法是最基本、最直观的细胞计数方法之一。通过显微镜观察细胞的数量和形态，然后进行统计分析。这种方法适用于讲究精确度的研究，特别是对于较大和集群生长的细胞，如哺乳动物细胞。优点是分析过程直观，能够同时观察细胞的形态和数量。缺点是操作耗时耗力，且可能存在人为误差。

2. 直接计数法：

直接计数法是一种快速、简单的方法，适用于细胞密度较低的情况。它基于将细胞悬浮液均匀分布在已知面积的计数板上，并计算每个小方格内的细胞数量，然后乘以补偿系数得到总细胞数。这种方法适用于细胞密度在10^2至10^4个

/ml之间的情况。优点是操作简单，且不需要特殊设备，缺点是结果的准确性受到细胞的聚集性和悬浮液的均匀性的影响。

3. 懒汉计数法：

懒汉计数法基于细胞在给定时间间隔内通过视图的个数来估计细胞的数量。对于细胞移动速度较快的情况，这种方法特别适用。它通过视图的帧数和平均细胞速度来计算细胞的数量。这种方法适用于类似高速运动的单细胞生物或进化学研究。

优点是操作简单，结果快速。缺点是对细胞移动速度的变化比较敏感，需要校正因素以提高准确性。

4. 溶解度计数法：

溶解度计数法是一种通过测定细胞的光学密度来估计细胞数量的方法。它基于细胞与显微镜下的颜色反射率之间的关系，通过读取吸光度来计算细胞数量。这种方法适用于大批量细胞的快速计数，尤其是在医学和工业应用中。优点是操作简单，结果快速，缺点是结果的准确性受到光条件和细胞的固定性的影响。

细胞计数原理

细胞计数是生物学和医学领域中常用的实验技术之一，用于确定给定样本中细胞的数量。细胞计数原理基于显微镜下观察细胞形态、结构和数量的方法。以下是细胞计数的原理及其步骤。

1. 样本制备：首先，从待测样本中取得一定数量的细胞。样本可以是细胞培养物、血液样本、组织样本等。确保样本取得的方式不会破坏细胞的完整性。

2. 稀释样本：根据细胞的浓度，将样本适当稀释。这样有助于将细胞分散开来，使其更容易被计数和观察。

3. 准备计数室：可以使用计数室或者用带有方格的显微镜载片。计数室有预定的区域，用来放置需要计数的细胞。

4. 抹片制作：在计数室或者显微镜载片上制作细胞抹片。将少量稀释的细胞放在载玻片上，然后用另一块载玻片将其涂抹开来，形成一个薄层的细胞悬液。

5. 显微镜观察：在显微镜下使用适当的放大倍率观察制作好的细胞抹片。细胞通常可见为圆形或不规则形状。

6. 细胞计数：通过目视细胞数量和位置进行计数。通常是在计数室或方格中选择一个特定的区域计数，然后根据所选择的区域的大小和形状进行计算。

7. 计算细胞浓度：使用计数的结果可以计算出细胞的浓度。假

设样本已经稀释了，可以将计数的细胞数乘以稀释倍数来计算初始样本中的细胞数量。

细胞计数是许多实验和研究中必不可少的步骤。通过了解细胞计数的原理和步骤，可以对细胞样本的数量和浓度进行准确的评估。

细胞培养之细胞计数

实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：

一.准备工作：

取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用.

二.细胞悬液制备：

用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS 等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

三.细胞计数：

1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.

2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。

5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104

说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3

四.细胞计数要点：

1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；

细胞计数步骤

细胞计数是一种常见的实验技术，用于确定特定样品中的细胞数目。以下是细胞计数的一般步骤：

1. 准备样品：准备需要计数的细胞悬液样品。样品可以是来自培养皿中的细胞，体液样品或者其他含有细胞的溶液。

2. 稀释样本：如果细胞密度太高，需要将样本稀释到适当的浓度，以便在计数室域中能够分开个体细胞。

3. 准备计数室：使用计数室，如海因克计数室或Neubauer计数室，这些计数室提供了一个已知的深度和特定面积的格子，用来计数细胞。在计数室的计数区域之外也需要一个混合室。

4. 加载计数室：将稀释好的细胞悬液在计数室中进行装填。这通常通过使用玻璃毛细管或现代的自动装填器进行。

5. 观察和计数：使用显微镜在计数室中观察细胞。细胞通常在显微镜下呈现为固定模式，例如在方形或菱形格子中。根据细胞类型和图案，可以通过显微镜逐个计数细胞，或者使用图像分析软件进行自动计数。

6. 记录结果：将观察到的细胞数目记录下来。细胞计数可以根据计数室中的格子大小和深度，然后通过一个简单的公式来计算出最终的细胞密度。

最好进行多次计数和重复实验以提高准确性，并在获得结果后进行进一步的数据分析。

细胞计数方法及公式

## 1 细胞计数的意义

细胞计数是实验室基础性的常用测定技术，它是研究细胞的必要

条件，对于做生物学实验，其中细胞数量的计算尤其重要，它不仅仅

反映了细胞增殖质量和成熟度，也代表了细胞获取，采样处理，细胞

培养等实验前处理的质量，可以从更宽泛的意义上反映实验条件的选

择及成功率。细胞运动特性及组织学特性等都可以从细胞数量较量出。

## 2 细胞计数的方法

主要有两种常用的方法：计数法和测定法。计数法是指将细胞喷

射在平板上，用高倍显微镜观察，但它的缺点是需要人工计数，受大

量宏观因素影响，计数不准确；测定法即计算悬液中的染色细胞的浓度，常用的方法有原子吸收法、荧光法、血红蛋白吸附法等。

## 3 细胞计数的公式

根据测定法，细胞计数的公式如：

细胞计数(个/ml)=比色度读数×比色度参照值÷比重。

其中，比色度参照值和比重是根据实验中的定量要求进行设定，

计算得出细胞计数。

细胞计数不仅作为相关实验中重要依据，也可以作为得出某种药

物效果的重要参考要素。其准确的计算细胞数量，实乃各种生物实验

的基本而重要的操作，只有细胞计数准确，才能进一步得出可信的实验结果和分析。

血细胞计数操作方法

1. 准备工作：准备好血细胞计数仪器、计数盘、稀释液、采血针、试管、棉球、4％甲醛溶液等。

2. 取血：用采血针在病人的手臂上取血，通常需要取5—10ml左右。

3. 稀释：将取得的血液加入稀释液中，混合均匀，使得液体中的血细胞数量降低到计数盘能够准确测量的范围内。

4. 填充计数盘：将稀释液和血液混合物填充到计数盘中，注意保持样品均匀填充。填充后在计数盘表面积约为0.9^2的区域内形成一个单层细胞密度。

5. 计数：将计数盘放入血细胞计数仪器中，启动计数程序。计数完成后，记录结果。

6. 后续处理：先用棉球沾满4%甲醛溶液擦拭计数盘上的细胞密度区域，然后用稀释液清洗计数盘，保证精度和重复性。最后清洗所有使用过的器具，包括采血针和试管等。

7. 结果分析：根据计数结果，可得知血液细胞的某些参数如红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白浓度、平均红细胞体积等，这些参数能够帮助医生诊断患者的

病情并制定相应的治疗方案。

细胞计数方法细胞计数板法

细胞计数方法------细胞计数板法

实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：

1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。

2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：

细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104个/ml

(注：当细胞很多时，可在四个格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值m，m×16即每个格的平均值。所以，细胞密度=m×16×104个/ml)

说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000ul=1000mm3

（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以

上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。）

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细胞计数板的使用

一、血球计数板-基本构造

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

血细胞计数的原理

血细胞计数是一种测量血液中各种细胞数量的方法，包括红细胞、白细胞和血小板。下面是血细胞计数的原理：

1.使用显微镜：首先，将采集到的血液样本涂在载玻片上，然后使用显微镜来观察和计数各种细胞。这种方法需要经过专业培训和经验，以确保准确计数。

2.血细胞计数仪器：现代技术已经发展出了自动化的血细胞计数仪器，可以更快、更准确地进行血细胞计数。这些仪器使用射线、光学或电信号来计算细胞的数量和类型。

3.稀释方法：由于血液中细胞的数量很大，为了方便计数，通常需要对血液样本进行稀释。稀释会使细胞的数量减少到可计数的范围内，从而避免过于密集或重叠的细胞，以确保准确计数。

4.计数室：计数室是一个用于确定计数范围的特殊装置。这个装置通常包括目镜以及计数区域计数器，以便进行计数计算。

总的来说，血细胞计数是通过观察和计数样本中的血细胞来获取数量和类型的。不同的计数方法可能会略有不同，但其核心原理是使用显微镜、计数室和稀释方法来对血细胞进行准确计数。

血球计数板细胞计数法

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

一、步骤

1、制备细胞悬液：对于悬液培养的细胞，可直接进行下面的步骤2（计数与计算过程）。如果计数对象为贴壁生长的细胞，首先需将培养物按如下步骤制备成细胞悬液。

1）、终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。

2）、给培养瓶内加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，于37℃消化3～5min 。期间不断在镜下观察。当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。

3）、加入一定量的培养液（如果这些培养细胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。

2、计数与计算过程

1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

4）、按下式计数细胞悬液的密度：细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/ml 。

二、注意事项：

1）、务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。

2）、显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分。

三、显微镜下血球计数板如下图：

细胞计数_精品文档

附录一、细胞计数

目的：利用血球计数器，测量培养中的活细胞数目。

原理：Trypan Blue是一种常被使用于细胞染色的染剂。Trypan Blue无法穿透活细胞的细胞膜，但是当细胞受伤或死亡，细胞膜破损时，

Trypan Blue则可以通透细胞膜进入细胞内，使细胞染成蓝黑色。利

用此一特点，配合血球计数器的使用，则可以在显微镜底下，分辨

出细胞样本中的活细胞与死细胞，以方便细胞计数。

材料：

1.欲计数的细胞悬浮液

2.染剂Trypan Blue (0.4%)

3.pipetman & tips

4.血球计数器(hemocytometer)

5.单键计数器(counter)

6.盖玻片(coverglass, 22mm×22mm)

7.拭镜纸(soft lint-free gauze)

8.封口膜(parafilm)

方法：

一、前置工作

1.剪一小片石蜡（parafilm），约1.5cm×5cm。

2.用水清洗盖玻片以及血球计数器的counting chamber表面，并分

别以拭镜纸擦拭；再喷70%的酒精于盖玻片和counting chamber

表面之上，等两者完全干燥后，将盖玻片置于血球计数器之上，

使覆盖住两个counting chambers。

*注意！不可以用卫生纸擦拭chamber表面，否则会刮坏chamber。

3.以pipetman吸取两滴各5μL细胞悬浮液，与两滴各5μL 0.4 %

trypan blue，并分别滴于parafilm上面(见Fig.1)。

4.以pipetman(旋至10μL)将步骤3的一滴细胞悬浮液与一滴trypan

细胞计数方法

第一篇：细胞计数方法（上）

细胞计数是生物学和医学研究中普遍的实验操作，其结果对于评估生物组织和液体中细胞数量和浓度都有重要意义。细胞计数能够提供各种生物技术实验的前提条件，可以用于确定细胞毒性、生长因子、激素、病毒、细菌和真菌的浓度等。此外细胞计数还可用于研究细胞的生长、分裂、遗传、代谢等方面。本文主要介绍常见的细胞计数方法。

1.显微镜计数法

显微镜计数法是最常见的细胞计数方法之一。其原理是通过显微镜观察，数出图像范围内的细胞个数，并计算细胞数量。这种计数法的优点是样品不需要离心，不会对细胞形状和大小造成影响。但是，此方法需要高度训练的技术人员和显微镜设备，而且误差较大，因为很难准确估算显微镜视野所占比例。

2.计数室法

计数室法是一种标准的方法，准确性极高，被广泛用于细胞计数。计数室是一个特殊的玻璃室，其在厚度和形状上都符合标准规格。计数室法通过将已罐化或离心后的细胞液镀在计数室封口下方玻璃上，然后用显微镜数出每个方格中的细胞数量，再通过公式计算出细胞密度。计数室法的优点是操作简便，准确性高，可以进行显微镜图像的分析计算，能够应用于所有生物体系。不足之处是计数室的制备和显微镜设备的可用性限制了实际操作的难度。

3.流式细胞仪法

流式细胞仪法是最先进的细胞计数方法之一，其原理是利用细胞在电场和荧光染料作用下的特征进行紫外吸收和荧光激发，通过光学和电子仪器进行快速准确的定量和定性分析。流式细胞仪法的优点是能够快速高效地完成细胞计数，提供了高度自动化和标准化的数据，可以分析复杂的细胞界面和活细胞动力学情况。不足之处是其设备价格昂贵，需要专业售后支持和技术支持，以及高度训练的操作人员。

标准操作规程(SOP)——细胞计数

一、目的

细胞计数法是细胞学实验中进行细胞计数的基本方法，通过细胞计数，能够保证实验的准确性、稳定性和可重复性。二、范围

适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行细胞计数的操作。

三、定义

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（红细胞计数板）进行。即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

四、程序

（一）生物安全要求

实验室生物安全级别：BSL-2

（二）材料

1．生长成片的MDCK 细胞

2．血细胞计数板

3．1mL 、10mL 无菌移液管

4．台盼蓝（0.4% PBS 溶液）

建议：经常检查试剂使用的有效期

（三）实验步骤

1．消化细胞（方法见MDCK 细胞培养标准操作规程）。

2．用血细胞计数板来计算细胞悬液中的细胞数，需要充分分散细胞。

3．在18μL 台盼蓝（0.4% PBS 溶液）中加入2μL 细胞悬液，混匀，成10

倍标准操作规程（SOP

稀释。死细胞被染成蓝色。

4．将以上细胞悬液加入到血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下计数。

5．计算计数室四个角上三线包围的正方形中的活细胞，压线的细胞计数遵循计数原则，数上不数下，数左不数右。

如果观察到成片或者成团的细胞，应重新悬浮细胞液，重新计数。

用以下公式计算每毫升悬液中活细胞的数量。

C=4个角正方形内的活细胞总数/4×104×10

C：每毫升活细胞数；

五、参考文件

《流行性感冒诊断标准》

细胞计数原则

一、无血细胞计数原则

在进行细胞计数时，应遵循无血细胞计数原则，即计数区域中不应含有血细胞。血细胞的存在会对细胞计数的准确性产生干扰，因此在进行计数时应特别注意避免将血细胞计入计数结果中。

二、无血小板计数原则

血小板在形态上与某些白细胞相似，因此在计数时可能会产生混淆。为了避免将血小板误计为白细胞，应遵循无血小板计数原则。在计数时应特别注意区分血小板和白细胞，并根据细胞形态、大小等特征进行准确的鉴别和计数。

三、无白细胞计数原则

白细胞是血液中的重要成分之一，但在某些情况下，例如感染或炎症等病理状态下，白细胞数量会异常升高。在进行细胞计数时，应遵循无白细胞计数原则，避免将异常升高的白细胞计入计数结果中。为了准确计数，应在显微镜下仔细观察细胞的形态和数量，并进行合理的鉴别和排除。

四、无红细胞计数原则

红细胞与白细胞在形态上有一定的差异，但在某些情况下，例如贫血或红细胞异常增生等病理状态下，红细胞数量会异常升高。在进行细胞计数时，应遵循无红细胞计数原则，避免将异常升高的红细胞计入计数结果中。为了准确计数，应在显微镜下仔细观察细胞的形态和数量，并进行合理的鉴别和排除。

综上所述，细胞计数原则主要包括无血细胞计数原则、无血小板计数原则、无白细胞计数原则和无红细胞计数原则。遵循这些原则可以确保细胞计数的准确性和可靠性，为临床诊断和治疗提供可靠的依据。

细胞计数的方法

引言

细胞计数是现代细胞生物学研究中非常重要的实验操作之一，它可以用于评估和监测细胞的生存状态、增殖能力、药物毒性等。本文将深入探讨细胞计数的方法，包括常用的计数方法、自动计数设备以及计数误差的影响因素等。

常用的计数方法

1. 显微镜计数法

显微镜计数法是最传统、常用的细胞计数方法之一。它通过显微镜观察细胞在计数室或显微镜载玻片上的分布，然后用数显微计数室或方眼计数法进行计数。这种方法操作简单，成本低廉，但需要有一定的细胞计数经验，而且计数结果受到操作人员主观因素的影响，存在一定的误差。

2. 流式细胞仪计数法

流式细胞仪计数法利用流式细胞仪的高通量、高精度的特点，可以快速而准确地进行大量细胞的计数。它通过将细胞悬浮液注入流式细胞仪中，细胞在单个通道中依次通过，并被激光束扫描，采集参数如细胞大小、形状、荧光等信息。流式细胞仪计数法具有高精度、高通量的特点，适用于快速计数和分析细胞，但设备价格昂贵，需要专业的操作培训。

3. 自动计数设备

随着科技的进步，出现了一些自动化的细胞计数设备，如自动细胞计数仪和细胞图像分析系统。这些自动计数设备通常结合了显微镜观察和图像分析技术，可以通过图像处理和识别算法自动计数细胞。自动计数设备具有高精度、高通量、高自动化程度的特点，减少了操作人员的主观误差，但价格较高，不适用于所有实验室。

计数误差的影响因素

细胞计数结果的准确性受到多种因素的影响。以下是影响计数结果的几个主要因素：

1. 细胞密度

细胞密度是指计数室或载玻片上单位面积或体积内细胞的数量。细胞密度过高会导致细胞重叠，难以准确计数；细胞密度过低则会降低计数的精确性。因此，在进行细胞计数时，需要根据实际的细胞密度进行合理的稀释，以保证计数结果的准确性。

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每代细胞的生长过程：

①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。持续 10分钟一4小时

②贴壁期：细胞附着于底物上，细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。

③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。

④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度抑制

细胞是否处于对数生长期并不是以数量来定的，一般接种数量多，潜伏期相对会缩短一些，反之，潜伏期会稍长。并且不同细胞潜伏期是不一样的，故建议最好在实验以前做一下生

长曲线

细胞生长状况的观察

1.细胞计数

（1）［概述］

细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态。测定培

养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。常用的细胞计数有血球计数板计数

法和电子细胞计数仪计数法。

（2）［用品］

a）血球计数板，巴氏吸管。

b）0. 25%胰蛋白酶溶液，无血清培养液。

c）显微镜。

（3）［步骤］

a）准备计数板：用无水酒精或95%酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻

拭干。

b) 制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细

胞悬液。本法要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心(1000rpm，

5 min)，重悬浮于少量培养液中。

c) 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微

量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况

需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也不要过少或带气泡。

d) 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。

e) 计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。

细胞数／毫升原液=（4大格细胞数之和／4）× 104

另外随着电子计数仪的出现，使大规模细胞计数工作自动化成为现实。目前，已有多

种型号的自动计数仪，其基本工作原理是，用PBS液（磷酸盐缓冲液）或生理盐水适

当稀释细胞悬液，移入样品杯中，将样品杯放置在计数仪微孔管下，计数仪吸取0. 5 ml样品进行计数。被吸取的细胞穿过微孔时改变了流经微孔的电流，产生一系列脉冲信号，计数仪借以进行分类、计数。不同型号的计数仪其操作程序不尽相同，使用时

应详细参照仪器说明书进行。

（4）［注意事项］

a）消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数

结果。

b）取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。

c）镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于20个／10 mm2，或多于500个／10

mm2时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数。

（5）［细胞密度换算］

在细胞培养实验设计中，常根据设计需求制备一定量、一定浓度的细胞悬液，这就涉

及细胞密度换算问题。稀释错误将导致实验出现偏差。

细胞密度换算实际上仍根据溶液稀释公式，即溶液稀释前后溶质含量保持不变。

C1•V1＝C 2•V2式中C1 、V1代表溶液稀释前的浓度和体积；C2、V2代表溶液稀释后的浓度和体积。例如：欲配制10 m1，106细胞/ml的细胞悬液，现有l07/m1的细胞

悬液若干毫升，应如何稀释?

已知：C1＝107/ml，C2＝106/m1，V2==10ml

“求V1？根据上式得：

V1＝（C 2•V2）／C1

＝106×10／107

＝1 m1

即取107/m1的细胞悬液1 ml，补加9 ml培养液，即成l0ml， 106/ml的细胞悬液。2．细胞生长曲线

（1）［概述］

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

（2）［用品］

与细胞传代和细胞计数法相同

（3）［步骤］

a）取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。经计数后，精确地将细胞分别接种于21~30个大小一致的培养瓶内（常用10ml培养瓶，亦可用24孔培养板），每瓶细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。细胞接种数不能过多也不能太少，太少细胞滞留期太长；数量太多，细胞将很快进入平台期，要求在短期内进行传代，曲线不能确切反映细胞生长情况。一般接种数量以7~10天能长满而不发生生长抑制为度。同种细胞的生长曲线先后测定要采用同一接种密度，这样才能做纵向比较；不同的细胞也要接种细胞数相同，才能进行比较。

b）酌情每天或每隔一天取出3瓶细胞进行计数，计算均值。一般每隔24 h取一瓶，连续观察1~2周或到细胞总数有明显减少为止（一般需10天左右）。培养3~5天后需要给未计数的细胞换液。

c）以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数坐标纸上。连接成曲线后即成该细胞的生长曲线（图7-1）。

细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20%~30%的误差，需结合其他指标进行分析。

现在很多实验室利用96孔培养板采用MTT法来进行生长曲线测定，较为简便。（4）［结果分析］

标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的滞留期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。

在生长曲线上细胞数量增加一倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。细胞倍增的时间区即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此区进行。细胞群体倍增时间的计算方法有两种：○1作图法：在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。○2公式法：按细胞倍增时间计算细胞群体倍增时间：以t 代表时间，N0及Nt代表接种后及培养t小时后的细胞数。按细胞倍增时间计算公式计算倍增时间，如果倍增时间延长表明药物使细胞增殖能力减弱。细胞倍增时间（T0）按下式计算：

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