生物技术大实验考试复习题

生物技术大实验

一、核酸凝胶电泳的基本原理是什么？

（1）核酸分子糖—磷酸骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核酸分子在一定电场强度的电场中，他们会向正极移动。

（2）电泳中使用无反应活性的稳定支持介质，电泳迁移率与与分子摩擦系数成反比。物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。

因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下分离出不同分子量大小或相同分子量而构型有差异的核酸分子。

二、CTAB法提取植物总DNA中CTAB的中文名称及其作用原理是什么？

CTAB的全称是十六烷基三甲基溴化铵

基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。

三、SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？

SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，SDS能断裂分子内和分子间氢键，使蛋白变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的分子量和纯度。在4%浓缩胶和12%分离胶上，以标准分子量蛋白（Protein Marker,High 29-205 kDa）为对照，电泳分离。经考马斯亮蓝-R250染色和脱色液脱色后，比较样品与标准分子量蛋白的迁移率，确定蛋白质的分子量及酶制剂纯度。

四、RNA提取过程中的注意事项有哪些？

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

注意事项

1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。

预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。常见问题分析：

得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底

B. RNA沉淀未完全溶解

A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高

B．样品匀浆时加的试剂量太少

C. 匀浆样品时未在室温放置5分钟

D. 吸取水相时混入了有机相

E .RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B. 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C. 细胞在用胰酶处理时过度

D. 溶液或离心管未经RNase去除处理

E. 电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少

B. 样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液

蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

4. 在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。

5. RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。

五、DEPC的中文名称汲取作用原理

焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

六、感受态细胞的定义及其制备流程。

经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）

培养基。

（2）从超低温冰柜中取出DH5 菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红

的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB 培养基的试管中，37℃摇床培养

过夜。

（3）取0.5ml 上述菌液转接到含有50mL LB 培养基的三角烧瓶中，37℃下

250r/min 摇床培养2—3h，测定OD590为0.375（<0.4 0.6，细胞数<108/mL，

此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。

（4）将菌液分装到1.5mL 预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，

然后于4℃，5000rpm 离心10min。

（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2 溶液，

立即在快速混匀器上混匀，插入冰中放置30min。

（6）4℃，5000rpm 离心10min，弃上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2

溶液重悬，

插入冰中放置30min。

（7）4℃，5000rpm 离心10min，弃上清液后，用200| L 冰冷的0.1 mol/L CaCl2

溶液重，超净工作台中按每管100 L 分装到1.5mL 离心管中。可以直接用作

转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。

七、Taq酶蛋白提取过程中基于哪些原理？

在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性

八、PCR技术的原理是什么？有那些作用？

PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

九、PCR反应的组分有哪些？主要起到什么作用？

十、碱式裂解法提取质粒DNA的实验流程是什么？溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的组成及作用原理？

实验步骤

1.氨苄青霉素过滤灭菌：首先灭菌滤头、滤膜、注射器、超纯水、1.5ml EP管；再按比例溶解氨苄青霉素；过滤灭菌。

2.挑选一个单菌落，接种到5 ml离心管含适当抗生素（氨苄青霉素100 mg/L）的3ml LB培养液中，37℃振荡培养12-16小时。

3.取1.2 ml菌液于1.5ml EP管中，12,000rpm离心1分钟，收集菌体，重复一次。

4.加入预冷的溶液I 100μl，涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰浴5分钟 (重悬细胞)。

5.加入200μl溶液Ⅱ(现配)，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保持冰浴 (碱变性染色体DNA、蛋白质)。

6.在5分钟内，加入溶液III 150μl，轻柔颠倒5-10次，冰浴10分钟（利用pH差异，复性质粒DNA）

7.12,000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA，及不溶的变性蛋白，取上清。

8.上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置10-15分钟。

9.在12,000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。

10.去上清，加入1ml 75%乙醇，洗涤沉淀。

11.12,000rpm 离心10分钟。

12.去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。

13.加入30-50μl ddH2O溶解质粒DNA，-20℃保存。

十一、设计在大肠杆菌中表达Taq聚合酶的实验流程。

实验目的

了解通过诱导重组DNA表达目的基因的技术

实验原理

克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；

（2）可控转录的启动子；

（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点RBS)；

（4）一个多限制酶切位点接头；

（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。

试剂

1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

实验步骤

1.取一个已转化的阳性单克隆，转接含氨苄青霉素的LB平板培养基

2.37℃培养，活化转化细胞。取一生长状况良好的单克隆，转接于1.5mlEP管含氨苄青霉素的 1ml LB 液体培养基，37℃、150r/min振荡培养12h。

3.再取1 ml培养液，转接到125ml含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基，37℃、150r/min振荡培养3h左右，至OD600=0.7时，加入表达诱导剂异丙基硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG），分别至终浓度1.5mmol/L，继续在37℃、150r/min条件下振荡培养，诱导Taq聚合酶基因的表达12h。

十二、RAPD技术的全称是什么？实验原理及应用有哪些？

随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）

是建立在PCR技术之上的一种分子标记方法，它是以一系列不同随机排列的寡聚核酸单链为引物，对于所研究的基因组DNA进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰氨凝胶或者琼脂糖凝胶电泳分析，经EB染色来检测扩增产物的多态性。对于任一特定的RAPD引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点，这些位点在基因组某些区域内的分布符合PCR反应的条件，即随机引物在模板的两条链上有互补的位置，且引物的3’端相距在一定的长度范围之内，就可以扩增出来DNA片段，如果基因组在这些区域发生DNA的片段的插入或者缺失，或者碱基突变就能够导致这些特定结合位点分布发生变化，而使PCR产物增加或者减少，发生分子量的变化，通过对于PCR 产物的检测分析即可以测出基因组在这些区域的多态性。