2001-木聚糖酶基因克隆表达与分泌及定点诱变研究进展
木聚糖酶基因的体外定向进化
木聚糖酶基因的体外定向进化杜文;王谦;王佳堃;刘建新【摘要】木聚糖酶在天然材料中基因表达水平低、活性差、生产成本高,严重限制了它的推广应用.宏基因组学通过免培养技术,研究生境中全部微小生物遗传物质的总和,在开发微生物酶资源上具有强劲的优势.体外定向进化技术模拟达尔文的自然进化论,利用基因的突变和重组,从体外改造酶基因,产生基因多样性,并结合定向的筛选最终获得预期性状的进化酶.宏基因组技术与体外定向进化技术结合必将加速木聚糖酶的开发和产业化应用,推动半纤维类生物能源的利用.为此,本文就木聚糖酶基因的来源、宏基因组学在木聚糖酶基因开发中的应用、体外定向进化进行了系统的综述.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2013(025)010【总页数】10页(P2202-2211)【关键词】木聚糖酶基因;宏基因组学;体外定向进化【作者】杜文;王谦;王佳堃;刘建新【作者单位】浙江大学奶业科学研究所,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310058;浙江大学奶业科学研究所,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310058;浙江大学奶业科学研究所,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310058;浙江大学奶业科学研究所,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310058【正文语种】中文【中图分类】S852.2木聚糖是D-木糖通过β-1，4-木糖苷键连接而成的一种多聚五碳糖，是植物细胞壁中常见的半纤维素多糖，占植物碳水化合物总量的1/3，含量仅次于纤维素，是自然界中第2丰富的可利用资源［1］。
在饲料工业中，由于单胃动物缺少降解半纤维素的酶，因此木聚糖对单胃动物几乎没有营养作用，而且没有消化的纤维物质会增加食物的黏性，干扰消化酶的作用及营养的吸收［2］;反刍动物由于瘤胃微生物的存在，对木聚糖具有一定的降解能力［3］，但是，实际生产中仍需要补充外源酶制剂，进一步提高其对粗饲料的消化率［4-5］。
木聚糖酶是能专一水解木聚糖为主体的低聚木糖和D-木糖的一类糖苷水解酶的总称［6］，主要包括:β -D-1，4- 内切木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanxylanohydrolase，E.C.3.2.1.8)、β -木糖苷酶(β-xylosidase，E.C.3.2.1.37)和β -1，4- 外切木聚糖酶(E.C.3.2.1.7)。
木聚糖酶基因克隆及表达系统建立
木聚糖酶基因克隆及表达系统建立一、木聚糖酶基因克隆概述木聚糖酶是一类能够分解木聚糖的酶类，木聚糖是植物细胞壁中含量丰富的多糖之一，由木糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成。
木聚糖酶在食品工业、饲料工业、造纸工业以及生物能源领域具有广泛的应用。
基因克隆技术是现代生物技术中的一项重要技术，它允许科学家在体外复制和修饰特定的基因，进而在宿主细胞中表达目标蛋白。
木聚糖酶基因克隆的目的在于获得高效表达的木聚糖酶，以满足工业生产的需求。
1.1 木聚糖酶基因克隆的重要性木聚糖酶基因克隆对于提高木聚糖酶的生产效率、降低生产成本以及开发新型木聚糖酶具有重要意义。
通过基因克隆，可以对木聚糖酶基因进行优化，提高其在宿主细胞中的表达水平，从而获得更高效、更稳定的酶制剂。
1.2 木聚糖酶基因克隆的技术路线木聚糖酶基因克隆通常包括以下几个步骤：基因的获取、基因的扩增、基因的克隆、基因的表达以及表达产物的纯化和鉴定。
首先，需要从自然界中筛选出具有高效木聚糖酶活性的微生物，然后通过PCR技术扩增其木聚糖酶基因。
接着，将扩增的基因克隆到合适的表达载体中，转化到宿主细胞，使其在宿主细胞中表达。
最后，通过一系列纯化步骤获得高纯度的木聚糖酶，并对其进行活性鉴定。
二、木聚糖酶基因克隆的关键技术木聚糖酶基因克隆过程中涉及到多种关键技术，包括基因克隆载体的选择、宿主细胞的选择、基因表达的调控以及表达产物的纯化和鉴定等。
2.1 基因克隆载体的选择基因克隆载体是用于携带外源基因进入宿主细胞并在其中表达的DNA分子。
载体的选择对基因的表达效率和稳定性至关重要。
理想的载体应具备以下特点：能够高效地在宿主细胞中复制、具有多个限制酶切割位点以便于基因的插入、含有选择标记基因以便于筛选转化子、以及能够高效地表达外源基因。
2.2 宿主细胞的选择宿主细胞是基因克隆的另一个关键因素。
不同的宿主细胞具有不同的基因表达能力和稳定性。
常见的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
木聚糖酶基因的克隆与表达
宋立立，顿宝庆，张亚楠，等．木聚糖酶基因的克隆与表达［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１０）：４３－４６．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１０．０１１木聚糖酶基因的克隆与表达宋立立１，顿宝庆２，张亚楠１，田景汉１（１．沧州师范学院生命科学学院，河北沧州０６１０００；２．中国农业科学研究院作物科学研究所／国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程／生物质能源研究中心，北京１０００８１） 摘要：用ＰＣＲ技术从桔青霉基因组ＤＮＡ反转录扩增得到木聚糖酶编码基因ｘｙｌ，并构建基因表达载体ｐＰＡＬ７－ｘｙｌ重组质粒，转化受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１进行原核表达分析。
ＩＰＴＧ诱导６ｈ酶活性达到最高，为２．０７ＩＵ／ｍＬ；表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，在２２ｋｕ处呈现蛋白条带，与理论的蛋白大小相一致，３７℃条件下诱导６ｈ蛋白表达量最高；同时进行构建基因表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ－ｘｙｌ重组质粒，转化受体菌毕赤酵母ＧＳ１１５作真核表达分析，经甲醇诱导９６ｈ后酶活性达到最高，为２３．８４ＩＵ／ｍＬ。
关键词：木聚糖酶；基因克隆；基因表达；酶活性 中图分类号：Ｓ１８８＋．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１０－００４３－０４收稿日期：２０１６－１２－１４基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：２０１５０３１３５－１６）；河北省科技计划（编号：１６２７３３０６）。
作者简介：宋立立（１９８３—），女，河北沧州人，硕士，讲师，主要从事微生物技术研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｂｃｚｓｌｌ＠１６３．ｃｏｍ。
木聚糖是植物半纤维素的主要成份，是除纤维素之外自然界中最为丰富的多糖，也是自然界中最为丰富的可再生资源之一［１］。
半纤维素在秸秆中仅次于纤维素，是可再生资源，但是大部分被作为废弃物浪费。
我国秸秆资源丰富，将秸秆中的半纤维素转化为可利用资源是一个尚待解决的问题。
木聚糖酶是木聚糖降解中最关键的酶，可以使木聚糖分子中β－１，４糖苷键断裂，水解产物为木二糖和木寡糖。
木聚糖酶的基因克隆及表达
木聚糖酶的基因克隆及表达木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。
木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。
木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。
木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。
在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。
因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。
本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。
1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。
研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。
国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。
20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。
目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。
木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。
嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变
嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变摘要:为了进一步提高嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus DSM10635)本已较耐热的木聚糖酶1YNA的热稳定性｡利用重叠延伸PCR技术从嗜热真菌基因组DNA中扩增获得了木聚糖酶1YNA的基因xyl,将其插入到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中,构建了重组表达质粒pET-22b(+)-xyl｡该质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)后获得了能成功表达的工程菌｡工程菌表达木聚糖酶1YNA的最适温度为65℃,最适pH值为6.0｡其在75℃,pH值为6.5的条件下失活处理30 min 后还残存有30%的酶活,与嗜热真菌生产的木聚糖酶特性相近｡在对该木聚糖酶的N端氨基酸序列进行定点突变后发现,T4A､T4G､T4R均对该木聚糖酶的热稳定性无显著影响,其中T4G突变体的耐热性有变弱的趋势｡关键词:嗜热真菌;重叠延伸PCR;定点突变;木聚糖酶木聚糖酶(Xylanase,EC 3.2.1.8)是可将木聚糖降解成低聚木糖和少量木糖的一类酶的总称｡狭义上的木聚糖酶限指内切β-1,4-木聚糖酶,是木聚糖降解过程中最关键的一个酶[1-3]｡木聚糖酶在现代工业中的重要性越来越明显｡目前该酶主要应用于制浆造纸､饲料和食品等行业｡木聚糖酶用于制浆造纸行业的预处理可提高纸浆的白度和减少化学漂白剂的使用;用于饲料行业能增加饲料的利用率和减少动物胃肠道疾病的发生;用于食品行业主要是对小麦面粉的改良和在酿酒方面的应用等｡木聚糖酶是利用非淀粉质原料生产酒精过程中的一个关键酶｡随着生物质能源事业发展,木聚糖酶必将得到更广泛的应用｡自1983年Bernier等首次从Bacillus subtilis中分离得到木聚糖酶基因以来,许多来自细菌､放线菌､霉菌､酵母菌和藻类等不同生物的木聚糖酶基因被克隆表达和分析｡嗜热真菌Thermomyces lanuginosus产生的木聚糖酶由于其高耐热性越来越受到关注[4]｡嗜热真菌T. lanuginosus DSM10635是从捷克的土壤中分离得到的一株耐热型菌株,它产生的木聚糖酶是一种耐高温酶,在较高温度(50~80℃)条件下稳定｡Xiong等[5]对该嗜热真菌DSM10635所分泌的木聚糖酶进行了详细的研究｡该木聚糖酶属于糖基水解酶第11家族,其最适pH值为6.0,最适温度为70℃,并且在pH值为 5.5~9.0下都具有很高的酶活性｡质谱结果还表明嗜热真菌DSM10635产生的木聚糖酶的分子量为21 295.17 Da,与DSM5826产生的木聚糖酶(1yna)的分子量极为相近｡耐高温酶的应用前景广阔｡在使用酶制剂的工业大生产中,高温过程常常不可避免或对工艺有帮助,例如高温能加快生化反应速度,提高液体物料的流动性能,防止有害微生物在过程中的生长繁殖等,目前大规模使用的酶制剂主要是通过工程菌发酵获得的｡基于PCR技术的不断发展和完善,运用基因工程和蛋白质工程的方法对木聚糖酶基因进行操作已经非常普遍[6-12]｡定点突变改变木聚糖酶分子的氨基酸残基能导致酶特性的改变[13-17]｡目前的研究多聚焦于第11家族的中温木聚糖酶,并且通过定点突变等方法获得了许多较耐热的突变体[18-20]｡总体来说,这些中温木聚糖酶的突变体热稳定性并未达到满意的程度,大多数突变体的热稳定性仅仅与未修改的耐热木聚糖酶的热稳定性接近｡直接利用本身已较耐热的木聚糖酶为模板进行基因修改将极有可能获得更耐热的突变体｡本研究对嗜热真菌T. lanuginosus DSM10635的木聚糖酶1YNA进行了原核表达｡由于此木聚糖酶基因中只含有一个内含子,实验中没有采用获得木聚糖酶基因的RNA后逆转录得到cDNA的方法来获得木聚糖酶的编码基因,而是利用特异性引物进行重叠延伸PCR获得的木聚糖酶1YNA编码基因,然后将其与原核表达载体连接后转入宿主菌能诱导表达木聚糖酶｡文献查询没有关于木聚糖酶1YNA 的基因表达的报道,本文是首次对该耐热木聚糖酶进行表达和基因定点修改,为今后实验工作的进一步开展打下了基础和指明了方向｡1材料与方法1.1实验材料嗜热真菌Thermomyces lanuginosus DSM10635购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)｡克隆载体pGEMT-easy购自Invitrogen公司｡表达载体pET-22b(+)购自Novagen公司｡大肠杆菌BL21(DE3)､DH5α来自中国农业科学院饲料研究所实验室｡实验所用的限制性内切酶NcoⅠ､XhoⅠ,T4 DNA连接酶,Pyrobest DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶,DNA回收试剂盒,质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司｡木聚糖购自Sigma公司,其他化学试剂均为国产分析纯｡1.2实验方法1.2.1木聚糖酶基因xyl的克隆参考GenBank中嗜热真菌T. lanuginosus DSM5826(登录号U35436)的木聚糖酶基因序列及相关的G11家族的木聚糖酶基因序列来进行序列比对分析,从而设计特异性的简并引物f1,f2和r(表1)对总DNA 进行PCR扩增,这些引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成｡引物f1是根据木聚糖酶基因的起始位点前面一段序列设计的,而引物f2是根据木聚糖酶基因中间一段相对保守序列设计的｡将纯化后的PCR产物与pGEMT-easy连接后转化DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆子送去北京擎科生物技术有限公司测序｡1.2.2木聚糖酶1YNA的原核表达对f1-r,f2-r两种引物对的PCR产物的测序结果进行序列比对｡结果表明,此木聚糖酶基因只含有一个约100bp的内含子｡设计含有酶切位点的特异性引物对f1-r引物对的PCR产物进行重叠延伸PCR,PCR扩增条件为:94℃､5 min;94℃､30 s,67℃､30s,72℃､40 s,循环30次;72℃､10 min;4℃保存｡经过两轮PCR后得到含有酶切位点NcoⅠ和XhoⅠ的PCR产物xyl片段,此片段和经两种内切酶切割后的pET-22b(+)空质粒载体在T4 DNA连接酶的作用下连接为重组质粒pET-22b(+)-xyl,电击转化感受态细胞BL21(DE3),涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素(简称Amp)的LB固体平板后,挑选阳性克隆子培养,以进行木聚糖酶酶活的初步测定,显示有酶活的克隆子送去南京金斯瑞生物科技有限公司测序｡1.2.3木聚糖酶突变体T4A､T4G､T4R的原核表达通过对原核表达的木聚糖酶的氨基酸序列进行分析,可以对其N端的某个氨基酸进行定点突变获得高稳定性的木聚糖酶突变体,设计引物将其第4位的苏氨酸突变为丙氨酸(引物dF1)､甘氨酸(引物dF2)或精氨酸(引物dF3),改变其N-端的疏水性来提高其热稳定性,利用定点突变引物和反向引物对提取的质粒pET-22b(+)-xyl进行扩增｡PCR的条件是:94℃､5 min;94℃､30 s,67℃､30 s,72℃､1 min,循环30次;72℃､10 min;4℃保存｡将纯化后的PCR定点突变产物和经限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ消化后的pET-22b(+)空质粒载体在T4 DNA连接酶的作用下构建pET-22b(+)-xyl突变重组质粒｡42℃热激转化感受态细胞BL21(DE3),涂布于含100 μg/mL Amp的固体平板后过夜培养,挑选阳性克隆子进行50 mL摇瓶培养并进行诱导,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法初步测定其是否具有酶活,有木聚糖酶表达的克隆子送去南京金斯瑞生物科技有限公司测序｡1.2.4木聚糖酶1YNA及其突变体T4A､T4G､T4R的酶液制备将在LB(含100 μg/mL的Amp)固体平板上活化生长的单克隆子接入含有LB培养基(Amp的浓度为100 μg/mL)的1.5 mL离心管,摇床培养4 h后按1%(m/m)的比例接入到100 mL LB培养基中,37℃,200 r/min摇床过夜,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG溶液诱导培养48 h｡培养液4℃,8 000 r/min离心10 min后取上清加入硫酸铵至其达到80%的饱和度,5 000 r/min离心0.5 h后沉淀用50 mmol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH值为6.5)溶解,8 000 r/min离心10 min后取上清4℃保存备用｡1.2.5木聚糖酶酶特性的鉴定实验采用DNS法测定木聚糖酶的酶活｡一个酶活力单位的定义为:在60℃和pH值为6.5的条件下,每分钟水解木聚糖底物产生1 μmol木糖所需酶量为1个国际酶活力单位｡酶活的测定以D-木糖作为标准｡在木聚糖酶酶活测定的实验中,pH值为4~7用的是柠檬酸-磷酸缓冲液(50 mmol/L);pH 值为7~9用的是Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L)｡木聚糖酶特性的鉴定主要包括最适温度､最适pH值和热稳定性的测定｡每个结果均为3个平行样的平均值｡①最适反应温度的测定｡0.2 mL稀释好的酶液与1.8 mL 0.5%(m/V,g/mL,下同)木聚糖底物在不同的温度下反应10 min,然后加入3 mL DNS 煮沸5 min｡最适温度的测定分别在两个pH值下进行｡②最适反应pH值的测定｡在相同的温度下,0.2 mL稀释好的酶液与不同pH值的1.8 mL的木聚糖底物缓冲液反应10 min,然后加入3 mL DNS溶液煮沸5 min｡③热稳定性的测定｡用同一pH 值的缓冲液稀释好的酶液在不同的温度(50~100℃)下失活处理30 min,然后取失活后的0.2 mL酶液与1.8 mL的0.5%木聚糖底物(pH值为6.5)在60℃下反应10 min,再加入3 mL DNS混匀后煮沸5 min｡热稳定性的测定在3个pH值下进行｡所有样品在540 nm下测定其吸光度值｡2实验结果2.1重叠延伸PCR的结果选择合适的PCR体系对提取的总DNA进行扩增,f1-r和f2-r两种引物对进行PCR后获得比较好的结果,分析两个产物的测序结果发现f1-r这对引物PCR扩增后的产物长度比f2-r的产物长,即f2-r的DNA序列包含在f1-r的DNA序列中,与实验预期的结果基本符合｡在Pyrobest DNA聚合酶作用下,采用不同特异性引物组合(mF,mR,zF,zR)对f1-r引物PCR的产物进行重叠延伸PCR(图1),结果显示PCR产物的DNA长度分别约为200 bp和400 bp(图2泳道2､3)｡将两种纯化后的PCR产物加入到含有Pyrobest DNA聚合酶和引物(mF,mR)的体系中进行PCR扩增｡获得600 bp左右的DNA片段,这就是目的片段xyl(图2泳道4)｡2.2重组表达质粒的构建及验证将经过测序验证的木聚糖酶基因xyl以正确的开放阅读框连接到原核表达载体pET-22b(+)上,获得重组表达质粒pET-22b(+)-xyl(图3),转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),挑选阳性克隆子培养,用试剂盒提取其质粒DNA,经限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后得到与pET-22b(+)(空质粒双酶切后的片段)以及目的基因xyl大小相符的DNA片段(图4),说明木聚糖酶基因xyl已正确插入到原核表达载体pET-22b(+)上｡2.3木聚糖酶1YNA及其酶突变体T4A､T4G､T4R的酶特异性鉴定2.3.1木聚糖酶1YNA的酶特异性鉴定木聚糖酶1YNA最适温度的测定在pH 值为5.0和6.5下进行,两个pH值条件下都是在65℃反应10 min时相对酶活达到最大值,因此确定原核表达木聚糖酶1YNA的最适温度为65℃(图5)｡木聚糖酶1YNA的最适pH值为6.0｡在50､70℃的反应条件下,木聚糖酶在pH值为6.0时都具有相对比较大的酶活(图6)｡木聚糖酶1YNA的失活曲线显示其在pH值为6.5和8.0下稳定性比pH值为5.0要高些(图7),在pH值为5.0的环境下,木聚糖酶60℃处理30 min后只残留约70%的相对酶活,而经过相同的失活处理后,pH值为6.5和8.0条件下的相对残留酶活基本没有下降;在65℃处理30 min后,不同pH值下的差别更明显,在pH值为6.5和8.0条件下的相对残留酶活还有80%以上,而在pH 值为5.0的环境下1YNA只剩下约40%的相对残留酶活;木聚糖酶1YNA在pH 值为5.0,100℃下处理30 min后基本丧失所有酶活,而相同条件处理后在pH值为6.5和8.0环境下还残留有少部分酶活｡2.3.2木聚糖酶突变体T4A,T4G,T4R的热稳定性鉴定实验成功完成了将木聚糖酶1YNA的第4位苏氨酸基因定点突变为丙氨酸(T4A)､甘氨酸(T4G)或精氨酸(T4R),并对突变结果进行了表达｡表达产物均有木聚糖酶活力｡对木聚糖酶突变体T4A,T4G,T4R进行了热稳定性的测定(图8~10)｡在pH值为5.0的环境下,60℃热处理30 min后,木聚糖酶突变体T4A､T4G､T4R的相对残留酶活分别为76.61%,51.94%和62.48%｡而在pH值为6.5和8.0环境下3种突变酶的相对残留酶活基本没有变化;3种突变酶在pH值为5.0的环境下,65℃热处理30 min后就基本丧失所有酶活,但在pH值为6.5和8.0环境下3种酶表现出不一样的热稳定性,T4A的相对残留酶活分别是72.21%和66.29%,T4G的相对残留酶活最低,分别是60.28%和55.74%,T4R的相对残留酶活分别是65.27%和60.61%｡总的来说,3种突变酶在pH值为6.5和8.0下的热稳定性都高于pH值为5.0下的热稳定性｡3讨论本研究以产耐热木聚糖酶的嗜热真菌T. lanuginosus DSM10635为实验材料,克隆了其木聚糖酶基因xyl并进行了原核表达｡该木聚糖酶基因的编码序列含有588个碱基,共编码196个氨基酸｡从实验所得的结果我们可以看出,利用重叠延伸PCR的方法获得木聚糖酶1YNA的蛋白质编码序列是完全可行的,并且取得比较好的效果,这样做比用传统方法更容易获得编码序列｡传统方法获得具有内含子的基因编码区主要是通过提取mRNA再经过逆转录酶反应得到cDNA,这种方法有一定的弊端,首先提取mRNA的提取过程比较繁琐,最主要原因是提取液中目的mRNA的含量较少而且容易被广泛存在的RNA酶降解｡重叠延伸PCR以前多用于两个基因的连接(如融合蛋白)和蛋白质中间区域某个氨基酸的突变,此外还可以用于多个外显子的拼接｡陆长梅等[13]设计重叠延伸引物,从T. reesei QM9414基因组DNA中通过PCR方法获得4个外显子,然后再通过重叠延伸PCR 方法将4个外显子按顺序一个个拼接,通过8次PCR反应就成功获得了与GenBank上外显子序列完全一样的成熟xynⅢ的cDNA序列｡对于只含有少数内含子的基因,使用重叠延伸PCR的方法获得其蛋白质编码序列更具有优越性｡由于缺少蛋白质糖基化修饰过程,原核表达的木聚糖酶在氨基酸序列没有变化的情况下其热稳定性一般要比嗜热真菌产生的木聚糖酶热稳定性低｡本文的实验结果也证实了这个现象｡通过比较大肠杆菌重组表达的木聚糖酶1YNA与嗜热真菌DSM10635所分泌的原酶[3]发现,木聚糖酶1YNA的最适温度比原酶约低5℃,最适pH值差别不大,其他酶特性比较相似｡通过定点突变技术,本文对原核表达的木聚糖酶1YNA进行了单个氨基酸修改｡第11家族木聚糖酶的N端是基因突变位点较为集中的区域｡由于该区域结构较为松散,从蛋白质数据库文件PDB立体结构分析图能够观察到第4位的苏氨酸的羟基扰乱了N端肽链结构的完整性｡我们尝试改变第4位的苏氨酸为其他不同氨基酸,探讨木聚糖酶1YNA的热稳定性和N端结构的关联性｡木聚糖酶突变体(T4A,T4G,T4R)与1YNA比较,热稳定性已经发生了变化但相对变化不大,其中T4G导致酶的耐热性有变弱的趋势｡1YNA在pH值为5.0下60℃处理30 min后还剩余约70%的相对残留酶活,而T4A在相同条件下处理后相对残留酶活剩余约80%,T4R的相对残留酶活次之,为60%左右,T4G的相对残留酶活最低,只达到50%｡3种木聚糖酶突变体在pH值为6.5和8.0下的热稳定性也低于1YNA在pH 值为6.5和8.0下的热稳定性｡对本身已较耐热酶蛋白质的结构进行修改以期进一步提高其热稳定性是一个挑战｡本研究首次对耐热木聚糖酶1YNA进行了表达和基因修改,为今后进一步研究该耐热木聚糖酶打下了基础和指明了方向｡参考文献:[1] 毛连山,勇强,宋向阳,等.内切木聚糖酶的选择性纯化及酶解制备低聚木糖的研究[J]. 林产化学与工业, 2006, 26(1):124-126.[2] RANI D S,NAND K. Production of thermostable cellulase-free xylanase by Clostridium absonum CFR-702[J].Process Biochemistry,2000,36(4):355-362.[3] USTINOV B B,GUSAKOV A V,ANTONOV A I. Comparison of properties and mode of action of six secreted xylanases from Chrysosporium lucknowense[J]. EnzymeandMicrobial Technology,2008,43(1):56-65.[4] SINGH S,MADLALA A M,PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus:Properties of strains andtheir hemicellulases[J]. FEMS Microbiology Reviews,2003,27(1):3-16.[5] XIONG H R,NYYSS?魻L?魧A,TURUNEN O,et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM10635[J]. Enzyme and Microbial Technology,2004,35(1):93-99.[6] 李东峰,周晨妍,白剑宇,等. 木聚糖酶融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达[J]. 食品与发酵工业,2007,33(11):39-43.[7] WANG Y R,ZHANG H L,HE Y Z. Characterization, gene cloning,and expression of a novel xylanase XYNB from Streptomyces olivaceoviridis A1[J]. Aquaculture, 2007, 267(1-4):328-334.[8] ROBERGE M,SHARECK F,MOROSOL R,et al. 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Engineering the thermostability of Trichoderma reesei endo-1,4-beta-xylanase II by combination ofdisulphidebridges[J]. Extremophile,2004,8(5):393-400.[19] 周晨妍,李东峰,邬敏辰,等. 木聚糖酶XynⅡ的D37N突变､表达及酶学性质变化[J]. 生物加工过程,2008,6(3):62-67.[20] 杨浩萌,柏映国,李江,等. 木聚糖酶XYNB的N46D突变､表达及酶学性质变化[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2006,22(3):204-211.。
木聚糖酶研究进展
山东 食 品发 酵 菘
２ ０ １ ４ ． ４ （ 总第 １ ７ ５ 期）
同 为 ３～ １ ０ 。大 多 数 酶 的 反 应 最 适 ｐ Ｈ 范 围 为
培 养 条件 为 玉米 与小 麦 麸皮 质 量 比为 １ ：１ ， 初
４～ ７ ，最 适 温度 为 ４ ０～ ６ Ｏ ℃ 。基 于 氨基 酸序 列 和疏 水 分析 ，木 聚糖酶 在 糖苷 水解 酶 中被分 成 家 族 １ ０（ 旧称 Ｆ家 族 ）和 家 族 １ １（ 旧称 Ｇ家 族 ） 两 个 家 族 。家 族 １ ０包 含 酸性 木 聚 糖 酶 和 部 分 纤 维 素 酶 。家族 １ １通 常 是 碱 性 木 聚 糖 酶 （ 除 了 一 些 真 菌来 源 的木 聚糖 显 酸 性 外 ）［ ４ － ５ ］ ｏ家 族 ｌ ０的
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｘｙ ｌ ａ ｎ ａ ｓ ｅ ｉ ｓ ｔ ｈ ｅ ｗｉ ｄ ｅ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａｋ ｉ ｎ ｄ ｏ ｆ ｉ ｎ ｄ ｕ ｓ ｔ ｒ ｉ ａ ｌ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｓ ． Ｉ ｔ ｐ ｌ ａ ｙ ａｍ ｏ ｒ ｅ ａ ｎ ｄｍｏ ｒ ｅ ｉ ｍｐ ｏ ￣ａ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｅ
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ： Ｘｙ ｌ ａ ｎ ａ 主链 或 侧 链 上 带 有 多 种 不 同 的取 代 基 。 乙 酰
木 聚糖 （ ｘ ｙ ｌ ａ ｎ）是 一 种 多 聚 五 碳 糖 ，是
基 、葡萄糖残基和阿拉伯糖残基是主链上最常见
的取代 基【 ２ Ｊ 。 木 聚糖 的完 全水 解 需要 木 聚糖 水 解 酶系 中各 种 酶相互 之 间协 同完 成 ，包 括 Ｂ． １ ， ４ ． 内切木 聚糖
酶、 一 木糖苷酶、 ａ— Ｌ 一 阿拉伯糖苷酶、 ｏ． Ｄ ． 葡
抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用[发明专利]
![抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/7bdd90c50066f5335a8121ea.png)
专利名称：抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用专利类型：发明专利
发明人：刘新育,朱东东,陈红歌,王秋菊,胡虹
申请号：CN201810214903.8
申请日：20180315
公开号：CN108424923A
公开日：
20180821
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。
该木聚糖酶的DNA序列选自：a）含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA序列，或b）编码SEQ ID NO.1所示蛋白序列的DNA序列，或c）在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或d）由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或e）a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链；设计对应的引物序列，构建了含该序列的表达载体和重组宿主菌；从宿主菌中分离得到抗抑制性木聚糖酶。
本发明的抗抑制性木聚糖酶稳定性好，对XIP‑I具有强烈抗性，在抗XIP‑I型抑制蛋白和面粉加工领域有着广泛的应用前景。
申请人：河南农业大学
地址：450002 河南省郑州市金水区农业路63号
国籍：CN
代理机构：河南科技通律师事务所
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木聚糖酶、基因及其应用[发明专利]
![木聚糖酶、基因及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/2adaac1c770bf78a642954e3.png)
专利名称：木聚糖酶、基因及其应用
专利类型：发明专利
发明人：买文宁,郜继红,魏勇军,丁文洪,张利兵,冯小军,王娜,孟鑫晨,代吉华,唐启,印刘兵,梁家伟
申请号：CN202010237053.0
申请日：20200330
公开号：CN111269903A
公开日：
20200612
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物技术领域，涉及一种宏基因组来源的木聚糖酶，特别是指木聚糖酶、基因及其应用。
本发明从造纸废水宏基因组文库中克隆到了一个木聚糖酶基因，经鉴定其编码的蛋白可良好地以内切的方式水解糖苷键，其可在大肠杆菌宿主中高效表达。
本发明的木聚糖酶在高温、高pH 条件下稳定性好、活性高，因此，可应用于造纸工业中。
申请人：郑州大学,焦作瑞丰纸业有限公司,河南君和环保科技有限公司
地址：450001 河南省郑州市高新区科学大道100号
国籍：CN
代理机构：郑州优盾知识产权代理有限公司
代理人：冉珊敏
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木聚糖酶产生菌的筛选鉴定及木聚糖酶基因(Xyn B)的克隆
木聚糖酶产生菌的筛选鉴定及木聚糖酶基因(Xyn B)的克隆莫毅;梁方方;赖志强;卢玉发;廖玉英;何仁春;黄丽霞;杨琳【摘要】采用富集培养、透明圈平板筛选的方法,从长期堆放青贮饲料的土壤中分离到7株木聚糖酶产生菌.选取透明圈最大的木聚糖酶产生菌X7作为基础菌,对其进行16S rRNA部分序列PCR扩增测定,经BLAST同源性分析确定X7为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain GD3b(Genebank编码:HM055602.1).然后设计特异引物,以X7基因组为模板,对其进行XynB基因序列PCR扩增,扩增产物经BLAST 同源性分析表明已成功克隆了X7菌株的Xyn B基因,为日后构建木聚糖酶基因酵母表达载体,培育能够分泌表达具有高活性的木聚糖酶酵母工程菌奠定了基础.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2011(000)023【总页数】3页(P20-22)【关键词】木聚糖酶;菌株筛选;16s rRNA;基因克隆【作者】莫毅;梁方方;赖志强;卢玉发;廖玉英;何仁春;黄丽霞;杨琳【作者单位】广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院【正文语种】中文【中图分类】S816.7木聚糖是一种由β-1，4-木糖苷键连接形成并带有多种取代基的多聚糖，主要存在于植物细胞壁中，在自然界中是除纤维素之外第二丰富的可再生物质资源（Prade，1995）。
木聚糖酶的应用及其研究进展
木聚糖酶的应用及其研究进展叶世超;薛婷;何文锦;叶冰莹;魏芳;陈由强【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2013(032)007【摘要】木聚糖酶是一种重要的工业酶制剂,现已从多种生物体中分离到大量的不同类型和功能的木聚糖酶.其已经在造纸、饲料、食品和酿酒行业被广泛应用.该文就木聚糖酶的来源、分类、结构、应用等方面的研究现状和进展进行了综述,并对其应用前景进行了展望.【总页数】3页(P8-10)【作者】叶世超;薛婷;何文锦;叶冰莹;魏芳;陈由强【作者单位】福建师范大学生命科学学院,福建福州350108;福建发育与神经生物学重点实验室,福建福州350108;农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室,福建福州350108;福建师范大学生命科学学院,福建福州350108;福建发育与神经生物学重点实验室,福建福州350108;农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室,福建福州350108;福建师范大学生命科学学院,福建福州350108;福建发育与神经生物学重点实验室,福建福州350108;农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室,福建福州350108;福建师范大学生命科学学院,福建福州350108;福建发育与神经生物学重点实验室,福建福州350108;农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室,福建福州350108;福建师范大学生命科学学院,福建福州350108;福建发育与神经生物学重点实验室,福建福州350108;农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室,福建福州350108;福建师范大学生命科学学院,福建福州350108;福建发育与神经生物学重点实验室,福建福州350108;农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室,福建福州350108【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.木聚糖酶及其畜牧业应用研究进展 [J], 徐良梅;陈盈霖;吕荣创;王超;任海轮;李佳凝2.木聚糖酶在食品工业中的应用研究进展 [J], 高雅君;丁长河3.微生物木聚糖酶的研究进展及其在食品领域的应用 [J], 温博婷;孙丽超;王凤忠;辛凤姣4.木聚糖酶的研究进展及其在食品领域的应用 [J], 滕超; 鹿发展; 范光森; 李秀婷5.木聚糖酶在畜禽饲料中应用效果及其机理的研究进展 [J], 尚庆辉;朴香淑;王玉璘因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
木聚糖酶基因克隆表达与木聚糖酶活力的测定
木聚糖酶基因克隆表达与木聚糖酶活力的测定2000级生物技术专业，翁杰、张弢木聚糖酶(endo-1,4-beta-xylanase E.C.3.2.1.8)是一类以内切方式专一性水解木聚糖分子中β-1,4-糖苷键的酶，其水解产物主要是木二糖和木寡糖。
很多细菌和真菌都可以产生木聚糖酶，有些木聚糖酶已被分离纯化并对其进行了性质研究，木聚糖酶基因也已被克隆和表达。
自七十年代末，八十年代初开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。
一般都是以传统的方法：提取染色体法制备感受态细胞或电转化法转化受体细胞大肠杆菌，从转化子中筛选出阳性克隆。
以下是木聚糖酶和木聚糖酶基因xynA的序列endo-1,4-beta-xylanaseLength:213aa,molecular weight:23345Da,CRC64 check sum:20CBA35238CC0564 MFKFKKNFL V GLSAALMSIS LFSA TASAAS TDYWQNWTDG GGIVNA VNGS GGNYSVNWSN TGNFVVGKGW TTGSPFRTIN YNAGVW APNG NGYL TL YGWT RSPLIEYYVV DSWGTYRPTG TYKGTVKSDG GTYDIYTTTR YNAPSIDGDR TTFTQYWSVR QSKRPTGSNA TITFSNHVNA WKSHGMNLGS NW AYQVMA TE GYQSSGSSNV TVW 213Bacillus subtilis endo-1,4-beta-xylanase gene,complete cds 702bp DNABASE COUNT 207a 123c 182g 190tORIGIN1 tacctcaaag tcggaaaaaa tattatagga ggtaacatat gtttaagttt aaaaagaatt61 tcttagttgg attatcggca gctttaatga gtattagctt gttttcggca accgcctctg121 cagctagcac agactactgg caaaattgga ctgatggggg cggtatagta aacgctgtca181 atgggtctgg cgggaattac agtgttaatt ggtctaatac cggaaatttc gttgttggta241 aaggttggac tacaggttcg ccatttagga cgataaacta taatgccgga gtttgggcgc301 cgaatggcaa tgggtatttg actttgtatg gctggacgag atcgcccctc atagaatatt361 atgtggtgga ttcatggggt acttataggc ctaccggaac gtataaaggt actgtaaaga421 gtgatggggg tacatatgac atatatacaa ctacacgtta taacgcacct tccattgatg481 gcgatcgcac tacttttacg cagtactgta gtgttcgcca gacgaagaga ccaactggaa541 gcaacgctac aatcactttc agcaatcag tggacgcatg gaagagccat ggaatgaatc601 tgggcagtaa ttgggcttac caagtcatgg cgacagaagg atatcaaagt agtggaagtt661 ctaacgtaac agtgtggtaa cagatcatcc ttaatcaggg gt实验步骤一，培养Bacillus subtilis培养基NUA二，细菌基因组DNA的提取材料：TE缓冲液，10%SDS，20mg/ml蛋白酶K，5mol/L NaCl,CTAB/NaCl溶液，24:1氯仿/异戊醇，25:24:1酚/氯仿/异戊醇，异戊醇，70%乙醇步骤：1，培养5ml细菌培养物至饱和，取1.5ml培养物离心2min2，沉淀物加567μl的TE缓冲液重悬。
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《生物工程进展》2001,V ol.21,N o.2木聚糖酶基因克隆、表达与分泌及定点诱变研究进展3刘相梅 祁 蒙 曲音波(山东大学微生物技术国家重点实验室,济南 250100)摘要 木聚糖酶专一性水解木聚糖分子中β21142糖苷键,在制浆造纸、食品、纺织、饲料、能源工业中具有广阔的应用前景。
随着各种新技术的发展与应用,木聚糖酶基因的研究取得了很大进展,不仅克隆了许多不同来源的木聚糖酶基因,研究了木聚糖酶基因在同源和异源寄主中的表达和分泌,而且还使用定点诱变技术探讨了木聚糖酶的结构与功能的关系并对酶的性质进行改造以满足工业生产的需要。
关键词 木聚糖酶基因 表达与分泌 定点诱变 3国家自然科学基金资助项目(N o.39970392) 木聚糖酶[E 1C 13121118]是一类以内切方式水解木聚糖分子中β21142糖苷键的酶,其水解产物主要是木二糖和木寡糖。
该酶具有广泛的应用前景。
利用木聚糖酶对含有半纤维素的纸浆进行预处理,可以减少漂白工艺中的有害化学品的用量,从而减轻环境污染;而且可提高纸浆的漂白度,降低纸张的脆性,使纸张不易返黄;还可以作为饲料添加剂去除戊聚糖类的抗营养因子,提高饲料的利用率,改善其营养价值;用于面包加工可提高面包的松软度,增大面包体积。
很多细菌和真菌均可产生木聚糖酶,有些木聚糖酶已被分离纯化并对其进行了性质研究,木聚糖酶基因也已被克隆和表达,各种来源和性质不同的木聚糖酶基因还在不断地被克隆出来,并从分子水平探索了木聚糖酶分子的结构和功能,为构建高效表达菌株,研究木聚糖酶的合成调控及木聚糖的降解机制等奠定了基础。
1 木聚糖酶基因的克隆自七十年代末,八十年代初开展木聚糖酶基因的研究工作以来,已有上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。
一般都是采用传统的方法:提取染色体DNA ,用不同的限制性内切酶进行完全或部分酶切,与质粒载体构建重组质粒,再以CaCl 2法制备感受态细胞或电转化法转化受体细胞大肠杆菌,从转化子中筛选出阳性克隆。
检出阳性克隆子的方法主要有以下几种:一种是以对有色底物的分解为基础的,将转化子点种在含有深蓝色RBB 2木聚糖(Remazol Brilliant Bule 2Xy 2lan )的选择平板上,含有木聚糖酶基因的阳性克隆子可分解该蓝色底物从而在菌落周围形成透明圈[1];另一种方法基于刚果红能与有β21142糖苷键连接的纤维性底物紧密结合染成红色,糖苷键水解后这种红色又可以被氯化钠溶液脱去的原理,将转化子点种或涂布在含有木聚糖的选择平板上生长过夜,用011%刚果红染色30分钟,用1m ol ΠL 氯化钠溶液脱色20分钟左右,阳性克隆子的菌落周围形成透明圈(背景是红色),若再用1m ol ΠL 的盐酸处理,则背景染成深蓝色,透明圈更明显并可保持较长时间[2]。
也有基于这两种方法把转化子培养在普通培养基上生长过夜,再倒上层选择培养基检出阳性克隆子[1]。
Bernier [3]等是用氯仿处理选择平板上生长过夜的菌落1小时,干燥表面30分钟,再倒含有溶菌酶的上层培养基培养16-24小时,阳性克隆子释放的酶分解木聚糖,直接观察平板上浑浊的培养基背景下菌落周围出现的透明圈。
克隆的具有代表性的部分木聚糖酶基因总结于表1。
2 木聚糖酶基因的表达与分泌克隆的木聚糖酶基因一般使用自身所携带的启动子在受体菌中表达,但是酶的表达水平比在原始菌株中下降了许多。
原来能分泌到细胞外的酶也只有少数在新的受体中能继续维持分泌性能,与信号肽的有无没有关系,其机制尚不清楚,有人推测与木聚糖酶本身的性质有关[4],但是没有确切的证据。
例如芽孢杆菌产生的木聚糖酶都是分泌型的,但其木聚糖酶基因在受体菌中的表达却是千差万别82表1 已克隆和表达的木聚糖酶基因菌株载体宿主菌Aeromonas caviae ME-1λDASHII phage E.coli P2392 Aspergillus nidulansλCharon4A,pUC18E.coliBacillus circulans pUC19E.coli H B101Bacillus pumilus IPO pBR322E.coli C600Bacillus subtilis pBR325E.coli W A802Bacillus sp.Strain N137p I J2925E.coli DH5αBacillus stearothmophilus T-6pBS+Π-or pBluescript K S+ⅡE.coli X L-1Blue Bacillus sp.Strain NCIM59pUC8E.coli JM105pLP1202Bacillus subtilisBacillus sp.Strain C-125pBR322E.coli H B101 Bacteroides ruminicola D31d pUC18,pBR322E.coli JM83,H B101 Butyrivibrio fibrisolvens49pUC19,pBR322E.coli JM83,H B101 Caldocellum saccharolyticum M13m p bacteriophage E.coli TG1,Q359 Clostridium stercorarium F-9pBR322,pUC118,pUC119E.coli JM109 Clostridium sp.Strain F1pBR322,pUC8,pUC9E.coli JM103,DH5αClostridium thermocellum pUC19E.coli H B101 Cryptococcus albidus pUC13E.coli DH1 Dictyoglomus thermophilum pJLA602E.coli JM101Rt46B.1Fibrobacter succinogenes S85pBR322E.coli H B101 Neocallimastix patriciarum pBT ac2E.coli X L-1BlueλgtWESλB,pUC18,pUC19E.coli H B101 Penicillium chrysogenumλE M BL3E.coliP seudomonas fluorescens Bacteriophageλ4711,pUC18E.coli JM83subsp.CellulosaStreptomyces lividans1326pI J702S.lividans10-164(xylanase2negative mutant) Streptomyces thermoviolaceus pUC18,pUC19,M13m p18,E.coli JM109OPC-52019,pI J702Streptomyces griseus PSR2 Thermomonospora fuscaλgtWES.λB,pBR322E.coli,S.lividans Trichoderma reesei pBluescript,pUC19,pCR1000E.coli X L1-Blue,INV1αF的。
球形芽孢杆菌的木聚糖酶基因在大肠杆菌中表达,产生的酶主要分布在胞内[5];芽孢杆菌C-125的木聚糖酶基因,以pBR322为载体克隆到大肠杆菌中产生的木聚糖酶则在胞外、胞内和周质空间的分布分别是0147μ(82%)、0102μ(315%)和0108μ(14%),胞外酶活相对最高[6];枯草芽孢杆菌的木聚糖酶基因在大肠杆菌中不分泌表达,以双向复制载体pMK3电转化到蜡状芽孢杆菌No518中,表达量虽然相似,但是能分泌到胞外[7]。
由于克隆的木聚糖酶基因表达水平比在原始菌株中低,许多研究者利用改变宿主菌和使用具有高效表达启动子的载体构建新型高效表达基因工程菌,不仅提高了酶活性而且有些木聚糖酶能分泌到胞外。
Lapidot[8]等根据一个已知序列的芽孢杆菌木聚糖酶基因,重新设计引物,利用PCR方法只克隆起始密码子ATG以后的结构基因(不带前导序列),转到T27RNA多聚酶表达载体pET3d上,在IPTG诱导下表达的木聚糖酶高达140UΠml。
Jung[9]等用枯92草芽孢杆菌染色体上的强启动子替换热纤维梭菌木聚糖酶基因自身的启动子,并去掉C末端与酶活无关的一段基因序列,把该基因转化到枯草芽孢杆菌中表达,胞外酶活可达30UΠml。
G hangas[10]等将褐色高温单孢菌的木聚糖酶基因用穿梭质粒转到浅青紫链霉菌中表达,其表达量是在大肠杆菌中表达量的10-20倍,但只有原始菌株表达量的四分之一。
Herbers[11]等将热纤维梭菌的热稳定木聚糖酶基因转到烟草中,产生的木聚糖酶位于烟草的质外体空间,酶的热稳定性及活性都没有丧失而且酶易于提纯。
另一例烟草中表达的是粪堆梭菌的木聚糖酶基因,该基因在烟草花叶病毒35S的启动子控制下表达,表达的木聚糖酶大部分在培养液的上清液中,一小部分在细胞内,木聚糖酶蛋白的量占可溶性总蛋白的5%[12]。
值得一提的还有Whitehead[13]的工作,他们使用大肠杆菌--类菌体穿梭载体将栖瘤胃拟杆菌的木聚糖酶基因接合转移至脆弱拟杆菌和单形拟杆菌中,该基因在这两种菌中都能表达,粗酶液的比活分别是原始菌株的1400倍和1600倍。
3 木聚糖酶基因的定点诱变随着各种新技术的发展与应用,人们对木聚糖酶基因的研究不断深入。
绝大部分克隆的木聚糖酶基因已被测序,同时推知了木聚糖酶的氨基酸序列。
为了阐明木聚糖酶的作用机制,鉴定其氨基酸组成中哪一个氨基酸残基对酶的催化作用是必需的,这一点十分重要。
使用化学修饰剂及随机诱变和定点诱变技术,在这方面已取得了多项进展。
尤其是定点诱变技术,利用合成的寡核苷酸作诱变物,根据设计的方案,在已知的核苷酸序列中准确地改变蛋白质氨基酸编码中一个或数个碱基,改变组成蛋白质的一个或数个氨基酸残基,以研究蛋白质的结构与功能的关系。
另外,通过对克隆的木聚糖酶基因进行定点诱变以改变木聚糖酶性质,如酶活性,热稳定性,pH值稳定性等,对该酶在工业生产上的应用具有十分重要的意义。
Okada[14]等根据前人研究的木聚糖酶的作用机制可能与蛋清溶菌酶的酸-碱作用机制相似,推测催化过程可能涉及酸性氨基酸残基,即羧基氨基酸,又根据短小芽孢杆菌木聚糖酶的三维结构及其氨基酸序列与其它菌的氨基酸序列的同源性比较,选出Asp221,G lu293和G lu2182三个酸性氨基酸残基进行定点诱变,分别用Ser,G lu残基替代Asp221,用Ser, Asp残基替代G lu293和G lu2182,结果表明诱变的六种酶的分子量都没有变化,圆二色谱分析只有一种酶的二级结构稍有变化,其它诱变对二级结构都没有影响。