微生物育种课件

连续诱变育种过程中如何选择出发菌株 突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提高 发酵水平不太容易。 在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上改 变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过一次 变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加。
表：灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌 株表型变异与产量递增的关系
（二） 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散） 目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象） 2. 同步培养（生理状态一致） 3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 4.菌悬液的制备方法 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
通常做法：取几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱 变试验，挑选处理后的菌落上千个，进行生产能力的 测定，作出生产能力分布状况，然后分别统计它们的 正突变株、负突变株和稳定株的频率。
三、诱变剂及诱变剂量的选择
1、诱变剂种类选择： 不同微生物对同一种诱变剂敏感性有很大区别，这不仅有 细胞透性的差异，也与诱变剂进入细胞后相互作用不一致 有关（修复机制）。 根据诱变剂作用机理，再结合菌种特性来选择诱变剂种 类。例如，灰黄霉素野生菌使用氯化锂、紫外线效果好；头孢C产生
(5)采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变剂 的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株； (6)在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积少 量所需产物或其前体的菌株; 而在选择产抗生素的出发菌株 时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程 度提高的菌株作为出发菌株。
通常丝状菌菌株由于遗传分离产生不纯现象，一个多核细胞 经诱变剂处理后，某个核发生有益的突变易被其他尚未突变 的核竞争性地抑制，多核菌体会降低单位存活菌的突变率
制备菌悬液时，采取分散法，使细菌或孢子团块在培养 液或悬浮液中充分分散，力求90%以上为单孢子。并务必 除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的。 菌悬液的浓度，要求霉菌孢子浓度约为106mL-1，放线 菌孢子浓度约为106-107mL-1。菌悬液的孢子或细菌数可 用平板计数、血球计数器计数和光密度法测定。 制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理 时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化而 影响诱变效果。
微生物育种
微生物育种，无论从自然变异选择还是人工诱变的选择，都是 建立在遗传和变异的基础上的。 工业微生物育种技术的发展，大致经历了如下阶段： 自然选育 微生物纯种培养法发明之后，开始了微生物纯种的自然选育。如
当时的酒精发酵 ，纯系良种的推广，扭转了酒精生产不稳定的现象。这是最 早应用微生物遗传学原理于微生物育种实践的一个实例。
微生物育种的途径：诱变、杂交、基因工程 诱变育种是发酵工业育种的重要手段和技术，目前几乎所 有工业生产菌种都经过诱变处理。 从自然界分离的野生菌株，在产量或质量上均难适合工业 化生产的要求。理想的工业生产菌种必须具备： 1、遗传性状稳定 2、纯净无污染
3、繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物
2. 最适诱变剂量的选择
(3) 诱变剂对产量的诱变作用，大致趋向是：处理剂量大，杀菌 率高(90～99％)，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少； 但在不多的正变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株。

四、诱变处理方式
4、能诱变产生遗传性变异 5、产量高、收得率高

高产突变是一种数量遗传，是由多基因决定的，产量的提 高，需要通过多代诱发突变逐渐积累 诱变是不定向的，会产生各种突变体，从中筛选出复合要 求的菌种是诱变育种中一项重要而艰苦的工作


突变的产生，打破了原有的细胞代谢系统，必然引起代谢 失调，降低其生存能力，需要注意调整培养基和培养条件， 使突变体能生存下来并发挥作用
加入适量嘧啶、嘌呤 或酵母膏，继续振荡 培养20～60 min
2. 菌悬液制备方法
(2) 产孢子菌类
处理材料是孢子，而不是菌丝。
成熟而新 鲜的孢子 液体培养基 振荡培 养至孢子刚刚萌发
离心洗涤 过滤 菌体计数，调
振荡打碎孢子 团块
整浓度
(3) 不产孢子的真菌
三种方法：
菌丝尖端法
加入缓冲液
5. 菌悬液的浓度
单孢子(或单细胞)悬液的制备
2 菌悬液制备方法
(1) 细菌
• 采用同步化的预培养方法：
20～24h 培养 的新鲜斜面
基本培养基 35～37℃振 荡培养至对数期
6℃培养1h ， 使之同步生长
菌体计数， 调整浓度
含玻璃珠三角瓶 振荡10min 过滤
制备菌悬液
低温(2℃)10min 离心洗涤
诱变育种的步骤 •出发菌株的选择与纯化 •单孢子（单细胞）悬液的制备 •诱变剂及诱变剂量的选择 •诱变处理方法 •高产菌株的分离
一、出发菌株
对出发菌株的要求： (1)从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽然产量 较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高；
(2)在生产中使用的，具有一定Hale Waihona Puke Baidu产能力，并且在生产过 程中经过自然选育的菌株；
目标：提高有效产物的产量
改善菌种特性、提高产品质量 简化工艺条件 开发新品种
诱变的不可预测性
正变株 微生物 诱变育种 负变株
高产菌株的缺陷： (1)孢子数量减少 (2)生活周期延长 (3)可能发生回复突变 发生概率大
诱变育种的复杂性
高产突变型菌株是一种数量性状的遗传变异，是 由多基因决定的：
1. 这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变 2. 高产菌株产量的提高，是多代诱发突变积累的结果。 只有那些每次诱变后有1～2个控制产量的基因突变，使 产物合成稍有增加，又能维持其最起码代谢平衡的菌 株才能生存下来。 3. 高产菌株的环境适应能力差，育种时必须注意调整 环境条件。
诱变育种的注意事项
1. 在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相
当的知识和全面的了解。 2. 诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为7～ 10天的抗生素菌种来说，一代诱变需2～3月，因此 事先需作好充分准备，如全面了解菌种培养特征 和生化特征，以及有关培养条件对其影响等，最 后再进行严密设计，确定正确的选育程序和方法。
单细胞悬液的制备
1 单细胞、均匀的悬液，可以均匀地接受诱变 剂，又可避免长出不纯的菌落
2 菌体要年轻、健壮、同步生长
3 菌悬液制备方法： 细菌：预培养及同步化 孢子：预培养到孢子萌发0.5~1倍孢子长 4 用原生质体作诱变材料
供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮 ： 供试细胞培养物要新鲜，细胞生理活性方面既要同步，又要 处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性好。对细菌来 说，常常通过前培养达到要求。
菌比较有效的诱变剂是紫外线、氯化锂、甲基磺酸乙酯、博莱霉素； 青霉素生产菌以亚硝基胍、氮芥、乙烯亚胺等烷化剂更为适合。
对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突 变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂。
对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂。
对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可 能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。
平滑紧密
平滑紧密
白
白
淡可可棕 3547
D-756 13
几乎每代出发菌株分别在发酵单位、菌落大小、菌落结构或颜色、基质菌丝 颜色、可溶性色素以及生长速度等表型发生过变异，继续经诱变处理，产量 又有显著的提高。 ▼
头孢菌素C产生菌C-20诱变系谱菌株表型变异与产量递增关系
菌株编号 C-1 抗生素产量 /% 100 表型特征 菌落直径 基质菌丝颜色 其他
直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。
处理单菌落周围尖端菌丝 混合处理法
2.4 诱变剂及诱变剂量
1. 诱变剂种类的选择
(1) 选择诱变剂
(2) 根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂 遗传稳定的:先强后弱; 遗传不稳定的:先选优良出发菌株,后温和诱变 (3) 参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂
组织紧密,生长速度慢
生长速度快 菌落表面不规则纹蜜集 沉没培养形成菌团 菌苔变厚,纹变疏 菌落边缘不规则,生长较慢 菌苔稍增厚 菌苔厚,边缘规则,放射纹疏 菌苔扁薄,边齐,放射纹密
这些表型上改变了的菌株，说明已动摇了遗传稳定性，继续处理，对 诱变剂的敏感性就提高了，因而容易发生变异，易于达到育种目的
组织松,生长速度快
C-2 UV
C-3 NM C-4 X射线 C-7 UV+Lф C-8 UV C-15 NTG C-17 EMS C-19 NS C-20 EMS
213
548 829 1120 1610 2630 3028 3223 4000 8-11.5 7-8 6-8 4-5 4.5-5.2 8-9 8-9 乳白 柠檬黄 柠檬黄 柠檬黄 鹅黄 (边缘柠檬黄) 乳黄 粉玉色
菌号 4541 B-53 诱变代数 1 11 菌落颜色 可溶性色 变株效价 素 提高/% 龟背灰绿 赭石 白 白 火泥棕 海螺橙 鱼鳃红 100 2011 2642 6911
菌落大小 /cm 1.3 0.8 0.6 0.4
菌落表面 结构 平滑疏松 平滑紧密 平滑紧密
71046 10
C-04
自然分离后 0.5
2、最佳剂量的选择： 经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株，宜 用较温和的诱变剂和较低剂量处理。
要筛选具有特殊性状的菌株、较大幅度提高产量的菌株， 则用强诱变剂和高剂量处理。
对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处理。 对多核细胞菌株，用高剂量处理。
2. 最适诱变剂量的选择
(1) 使所希望得到的突变 株在存活群体中占有最 大的比例。 (2) 最大形态变异率的 剂量不一定是诱发正变 的最适剂量。
一代诱变约需2～3个月

突变的机制
碱基置换（转换 颠换）
点突变 移码突变（缺失 添加）
诱变
畸变：缺失、添加、易位、倒位 突 变
自发突变
第一节 诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从中筛选出产量高、性状优良的突变株， 并 设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其在最适的工 艺条件下最有效地合成产物。
诱变育种 40年代初，Beadle和Tatum“一个基因一种酶”学说的提出，意
味着遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进了工业微生物育种技术的发展。 如抗生素工业的兴起。
代谢控制育种 以50年代末Glu发酵成功为标志，其优势在于以诱变育种为
基础，打破了微生物调节机制这一天然屏障，获得各种解除或绕过了微生物 正常代谢途径的突变株，从而人为地积累有用产物。代谢控制育种 的兴起意 味着诱变育种发展到理性阶段，导致了氨基酸、核苷酸及某些次生代谢产物 的高产菌株大批投入生产。
出发菌株的纯化
纯种分离方法，常用划线分离法和稀释平板法。
在诱变育种中，出发菌株的纯化虽然是辅助手段，但 它是不可缺少的技术步骤，例如前面的例子中，灰黄 霉素变种B-53，经自然分离，获得的变株C-04的产 量比前者显著提高。 ▲
二、单孢子（单细胞）悬液的制备
在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬 液状态。这样一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变 剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。 菌悬液是直接供诱变处理的，由出发菌株的孢子或菌体 细胞与生理盐水或缓冲液制备而成，其质量将直接影响诱 变效果。对菌悬液的制备有如下的要求：
(3)采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求 低以及产孢子早而多的菌株；
(4)有些菌株在发生某一变异后会提高对其他诱变因素的敏感 性，故有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。
例如，在金霉素生产菌株中，曾发现以分泌黄色色素的菌株作出发菌株时， 只会使产量下降，而以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量会不断 提高；
诱变育种有以下几个优点：速度快，收效大、方法简单。
诱变育种的三大要素：诱变剂、诱变条件、筛选技术。 分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估
诱变育种的目标及用途
概念：选用理、化致变剂处理均匀而分散的微生
物细胞群，促使其突变率显著提高；采用简便、 快速和高效的筛选法筛选出少数符合育种目的 的突变株来供生产实践与研究应用。