一种高效简便的原代神经元培养方法

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世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。

相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。

我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。

9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。

（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。

1.材料选择。

一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。

胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。

因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。

和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。

很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。

2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。

我强烈不建议用血清培养。

原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。

严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。

神经元原代培养方法

神经元原代培养方法
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。

孕雌鼠麻醉然后解剖，胎
儿收集到HBSS-1中然后快速断头。

剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集
入 HBSS-2 液中机械磨碎。

皮质碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中3 7°C消化15分钟。

胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲
洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨
酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/mL庆大霉素）。

以1×105c
ell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2
湿温培养箱里进行培养。

每3天用吸管换液，一次换0.5mL。

体外培养8
天细胞就能用于实验。

选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎
组织的细胞连接还很少。

因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，
会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易
发生损伤。

另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。

如果用的是乳鼠，一般是在培养36个
小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。

另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、
8天的、18天的细胞。

其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年
的不同效应。

新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定

新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【摘要】目的建立一种简单、高效、稳定的海马神经元原代培养方法,以获得高纯度、高活力的海马神经元.方法 24h内新生鼠,用含B27的Neurobasal无血清培养基培养,显微镜下观察神经元的生长状态,MTS法测定不同时间神经元细胞的活力,并用Tau-1和MAP-2抗体鉴定海马神经元的纯度.结果(①接种24h后,细胞完全贴壁,可见双突起和多个突起的神经元;72h后,海马神经元胞体饱满,立体感较强,突起之间相互形成突触联系,神经元极性完全建立;5～6d的神经元,突起形成密集的神经纤维网络.②MTS法测定结果显示,在培养1～8d时间内,海马神经元随着培养时间的延长,活力增加,第8d细胞活性到达高峰,继续培养时,活力开始下降.③Tau-1和MAP-2免疫荧光检测神经元,海马神经元纯度达到(85.5±5.4)％.结论本实验方法简单易行,神经元纯度高、细胞活性好,且体外存活时间长,是神经疾病体外研究的良好细胞模型.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2016(030)004【总页数】6页(P284-287,290,封3)【关键词】海马神经元;无血清原代培养;方法;优化与鉴定【作者】郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【作者单位】广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436【正文语种】中文【中图分类】R329在神经系统研究领域内，体外培养神经元细胞是研究神经元功能以及病理、生理变化的重要手段之一，在现代医学和神经科学中被广泛应用。

原代神经元[1]直接来源于动物脑组织，在形态和生理功能上都能较好的模拟动物的体内细胞，得出的数据结果更加真实可信，与神经细胞系相比，它们能提供准确的生物学信息，并且它具有机体干扰少，影响因素单一，结果容易分析等优点。

神经元细胞培养步骤

神经元细胞培养
灭菌准备：
1、将玻璃培养皿（3个）、滤器（清洗、换滤片、锡纸包裹）放入盒中、将盒拿到桶中灭菌
2、将显微镜搬至超净台灭菌
3、将直头镊（1个）、弯头镊（1个）放入盛有酒精的小烧杯，放入超净台
材料准备：17天孕鼠、冰块、75%酒精、50mL离心管、PBS、胰酶、培养基、双抗、注射器、灭菌的显微镜、灭菌的玻璃培养皿（3个）、10cm培养皿（1个）、计数器、包被好的培养板
1、处死孕鼠，取小鼠，放入50mL离心管（冰块上），移至超净台，
2、将小鼠倒入盛有PBS的玻璃培养皿中，关灯，开显微镜
3、将头取出（左手直头镊，右手弯头镊），放入盛有PBS的玻璃培养皿中
4、夹取皮层（皮质及髓质），放入盛有PBS培养皿中，移去显微镜
5、将PBS倒入50mL离心管
6、用枪弃去PBS，再以PBS洗3次，晃匀
7、弃去PBS，加入5mL胰酶，放于37℃细胞培养箱内5分钟
8、弃去胰酶，以PBS洗2次，吸掉
9、加入5mL PBS,对着底面吹打成悬液
10、吸至50mL离心管中，
11、灭菌后的滤器置于15mL离心管，用注射器将细胞加入，抽空气再吹数次
12、离心，25℃，1500rpm，5分钟
13、配制培养液，混匀
14、弃上清，将离心管中加入5mL培养液，吹打成悬液
15、再加入5mL培养液，再次吹打
16、加1滴加至计数器中央，显微镜下观察，
17、20—50个/每16小格，即20—50 ×104 = 2—5×105，若密度加大，则加入培养液稀释
18、加100uL至96孔板中（四边不用），晃匀，
19、放37℃细胞培养箱。

小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法

小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法小鼠背根神经节神经细胞原代培养是神经学研究、药物筛选及细胞病理学研究中必不可少的一环。

本文将介绍一种新的小鼠背根神经节神经细胞原代培养方法的步骤及注意事项。

步骤1: 动物处理。

用取出小鼠的背根神经节放入无菌的PBS缓冲液中搅拌7-8分钟，使神经节中的细胞离体，并通过多次离心来去除PBS缓冲液。

步骤2: 细胞悬浮。

将含有神经细胞的细胞悬液用1mL冰冷的PBS缓冲液洗涤2次。

再用1mL冰冷的70%酒精进行紧密覆盖，静置5分钟。

再用PBS缓冲液洗涤5次，最后用DMEM/F-12添加10%胎牛血清（FBS）调整至适当浓度。

步骤3: 细胞培养。

将细胞悬液转移到含有0.1%聚赖氨酸的DMEM/F-12培养基中，距离表面1cm左右，进行孵育24-48小时。

孵育室应控制在37℃的恒温条件下，同时CO2含量应设定在5%。

步骤4: 原代细胞出现。

24-48小时后，可见到原代神经细胞在培养皿中生长，而其他非神经细胞则无法生长。

这是因为神经元比其他细胞易受到聚赖氨酸的作用，从而对组织细胞进行筛选。

步骤5: 细胞传代。

当原代细胞数量足够时，可进行细胞传代。

将同等的DMEM/F-12培养基中加入0.5%胰酶，将原代细胞取下进行培养。

注意事项：1.处理过程中必须保持无菌，防止微生物污染。

2.神经节处理过程中的时间要注意，过久会导致细胞死亡，过短则分离不完整。

3.使用的培养基及化学试剂要质量优良。

4.培养条件要严格控制，CO2含量及温度要保持恒定。

本文介绍的方法较为简单易行，对于初学者或初学者也容易了解。

但细胞培养中实验操作需要非常谨慎，为保证实验的准确性和有效性，一定要保证实验过程中的无菌、温度、CO2含量和实验技术的高效性。

新生大鼠背根神经节神经元的分离、培养及鉴定

新生大鼠背根神经节神经元的分离、培养及鉴定发表时间：2015-10-09T15:22:53.543Z 来源：《医药前沿》2015年第21期供稿作者：张雨尧1 梁宸1 胡学昱2（通讯作者）[导读] 1第四军医大学学员旅陕西西安2第四军医大学西京医院骨科陕西西安我们采用新生大鼠DRGn来作为研究对象分析电刺激对神经元突起再生的影响，进行轴突生长发育的研究，是经典而常用的方法之一[4]。

张雨尧1 梁宸1 胡学昱2（通讯作者）（1第四军医大学学员旅陕西西安 710032）（2第四军医大学西京医院骨科陕西西安 710032）【摘要】目的：建立一种简单、稳定、高效的新生大鼠背根神经节神经元原代培养方法。

方法：摘取新生24h SD大鼠背根神经节，采用0.25%胰酶和0.1%Ⅳ型胶原酶消化，制成单细胞悬液，接种于Neurobasal/B27无血清培养液中。

将培养3d的DRGn于倒置相差显微镜下进行形态学观察，扫描电镜行细胞形态学检测，应用β-tubulinⅢ进行免疫细胞化学染色，鉴定细胞纯度。

结果：体外培养的背根神经节神经元生长状态良好，纯度可达到(92±6)%。

结论：本实验方法简单、稳定、高效，可以获得高纯度的背根神经节神经元。

【关键词】背根神经节；动物实验；细胞培养；纯化【中图分类号】R74 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0034-03The dissection, purification and culture of dorsal root ganglion neurons from new born ratsZhang Yuyao1, Liang Chen1, HU Xueyu(corresponding author)21 Fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China2 Department of orthopaedics, Xijing hospital,Fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China【Abstract】Objective To establish an simple, efficient, reliable method for the purification culture system of dorsal root ganglion neurons derived from new born rats. Methods Dorsal root ganglions harvested from new born SD rats were digested with the mixture of trypsin and collegonease Ⅳ, then turned into single cell suspension and plated in neuralbasal media. The purified rate was evaluated according to cell count and β-tubulinⅢ immunocytochemistry stain. Results Cultured dorsal root ganglion cells could survive healthily. The purification rate of neurons was（92±6）%. Conclusion The method, which is used for culture and purification of DRGn, is a simple, efficient and reliable way. Using it could obtain highly purify neurons.【Key words】Dorsal root ganglion; Animal experimentation;Cell Culture;Purification背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）主要由感觉神经元组成，参与脊髓反射与感觉功能的调节，DRG因其细胞种类、生物学特性单一，越来越受到人们的重视。

神经元原代培养方法

一、器材二氧化碳培养箱(Forma Series Ⅱ Water Jacketed CO2 Incubator) Thermo公司；SW-CJ- 2F 型超净工作台苏州安泰空气技术有限公司;80- 2B 型离心沉淀机盐城市科学仪器厂;LS-B50L 立式压力蒸汽灭菌器江阴滨江医疗设备厂;AB104 － N 电子天平上海电子仪器厂倒置显微镜 OLYMPUS-IX71二、试剂Neurobasal®-A Medium (1×)无血清培养基 500ml 美国Gibco公司；B-27 Supplement(50×) 10ml 美国Gibco公司DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Invitrogen公司胰酶（Trypsin 1:250） 5g Solarbio公司；多聚赖氨酸( Poly-L-Lysine，MW 150000- 300000) 25mg Solarbio公司；无支原体胎牛血清四季青浙江天杭生物科技有限公司;马血清（特级）北京元亨生物技术有限公司;注射用硫酸链霉素 100万单位/瓶华北制药股份有限公司注射用青霉素钠 80万单位/瓶华北制药股份有限公司三、方法1.试剂的配制（1）神经元专用培养液将500ml Neurobasal®-A Medium (1×)无血清培养基和10ml B-27 Supplement(50×)混合后，加青霉素和链霉素（终浓度为100单位/ml）使其混匀，4℃储存备用。

（2）D-Hank,s缓冲液称取NaCl8.0g KCl0.4g Na2HPO4·12H2O0.09g KH2PO40.06g 葡萄糖1g,加双蒸水定容至1000ml,调PH于7.2-7.4，抽滤后4℃储存备用。

（3）0.25%胰酶称取0.25g胰酶溶于100ml D-Hank,s缓冲液中，抽滤后4℃储存备用。

最详细的神经元原代培养

最详细的神经元原代培养(2010-08-31 12:08:56)转载▼标签：教育序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why.为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。

相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。

我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。

9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。

1.材料选择。

一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。

胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。

因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。

和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。

2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。

我强烈不建议用血清培养。

原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。

原代海马及皮质神经元培养方法

原代海马及皮质神经元培养方法海马和皮质神经元是神经系统的重要组成部分，在研究神经生物学和药物疗效等方面具有重要价值。

为了研究这些神经元的生理特性和功能，我们常常需要从动物体内分离和培养这些神经元。

以下是针对原代海马和皮质神经元的培养方法。

1.实验动物准备：首先，需要准备实验所需的动物。

一般情况下，小鼠是最常用的实验动物。

在实验进行前，需要确保动物符合实验伦理和动物保护要求，并获得相应的实验动物使用许可。

2.动物脑组织的获取：在实验动物处死后，需要尽快取出脑组织。

使用无菌技术将大脑取出，并将其放入生理盐水或培养基中。

3.脑组织的分离和消化：将脑组织放入含有0.02％的溴酚红的磷酸缓冲生理盐水中，用无菌剪刀和镊子将其剪碎成小块。

然后，将组织块放入含有0.25％胰酶的溶液中，在37℃的恒温培养箱中消化2至5分钟。

然后，将溶液过滤并离心，以去除细胞碎片和大块组织。

4.细胞的分离和培养：将离心沉淀涂布在含有25％培养基和10％胎牛血清的培养皿中，然后放入37℃的恒温培养箱中。

培养基的成分可以根据具体需要进行调整。

细胞会附着在培养皿上，并开始生长和繁殖。

在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以提供细胞所需的营养物质。

5.细胞的处理和分选：在培养4至7天后，细胞会形成较为密集的神经元网络。

在这个时候，可以通过处理和分选细胞来提高神经元的纯度。

例如，使用抗体标记法可以针对神经元选择性地杀死胶质细胞。

此外，还可以使用细胞遗传方法，如转染特定基因或使用荧光探针标记细胞。

6.测试和分析：经过特定时间的培养后，可以对原代海马和皮质神经元进行测试和分析。

这些测试和分析可以包括细胞生存率、纯度、形态特征、电生理活性、细胞内信号和细胞功能等方面的内容。

这些测试和分析的方法可以通过显微镜观察、电生理仪器、蛋白质和基因分析等手段进行。

7.特殊处理：有时对于特定的研究需要，还可以对原代海马和皮质神经元进行特殊处理。

例如，可以通过给予特定药物、激素或其他刺激条件，来模拟不同的疾病模型或研究特定功能。

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版讲解

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。

相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。

我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。

9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。

1.材料选择。

一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。

胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。

因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。

和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。

2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。

我强烈不建议用血清培养。

原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。

Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。

原代神经细胞培养

原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。

2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。

3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。

包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。

4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。

取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。

2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。

3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。

4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。

注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。

5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。

6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。

7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。

8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。

9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。

原代神经元培养

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

原代神经元细胞培养技巧

原代神经元细胞培养技巧
以下是 9 条关于原代神经元细胞培养技巧：
1. 哎呀呀，培养原代神经元细胞，那选对材料可太重要啦！就好比你要做一道美味佳肴，那食材得新鲜优质对吧？比如你得挑健康的胚胎组织，可别随便拿些不靠谱的材料来凑数呀！
2. 嘿，解离细胞这一步可得小心谨慎哦！这就像拆一件精密的玩具，不能太粗鲁，不然全给弄坏啦！要温柔地进行操作呢。

3. 哇塞，接种细胞时可得仔细着点儿！就像给小宝贝们找个舒服的家，密度要合适，位置要恰当，不能马马虎虎哟！
4. 知道吗，培养基那可是细胞的营养大餐呀！怎能随随便便选呢？一定要找最适合它们的，不然它们怎么茁壮成长呢？就像给孩子选奶粉一样重要呐！
5. 天呐，培养环境那简直就是细胞的小天地！温度、湿度、气体都得严格把控，这可不是闹着玩的呢，你说是不是？
6. 哇哦，换液的时候可得注意啦！你想呀，如果给它们换了不好的液体，那不就像给人喝了不健康的水一样嘛，能行么？
7. 诶，观察细胞可不能马虎呀！那可是随时了解它们状态的关键呀，这就好比你时刻关注着自己宝贝的一举一动，有没有问题一下子就知道啦！
8. 哎呀，防止污染那可是重中之重啊！稍微不注意让细菌病毒钻了空子，那不就全完啦？这可不比家里打扫卫生，得超级认真呀！
9. 总之呢，培养原代神经元细胞真的需要特别细心和耐心！每一个环节都不能掉以轻心，都要像对待艺术品一样精心呵护，这样才能培养出健康优秀的细胞呀！。

原代DRG神经元培养

原代DRG神经元培养主要试剂和溶液的配置Dulbecco缓冲液(1L): 0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8.0 g NaCl，Na2HPO4•12H2O 2.89g溶于900 ml ddH2O中，溶解完全后调pH值至7.2-7.4，定容至1 L。

0.3%胰酶(250 ml)（神经元用）:称取0.75 g胰酶(Sigma)溶于200 ml Dulbecco缓冲液中，定容至250 ml，0.22 μm微孔小滤器过滤除菌。

0.5%胶原酶IA (250 ml):称取1. 25 g 胶原酶(Sigma)溶于200 ml Dulbeaco缓冲液中，定容至250 ml，0.22 μm微孔小滤器过滤除菌。

DMEM培养液:称取DMEM固体培养基(Gibco-BRL, USA) 13.48 g溶于800 ml ddH2O中，用3.7 g NaHCO3调pH值至7.2-7.4，定容至1 L。

0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

临用前配制成含10% FBS (Hyclone, USA)的完全培养基。

Neurobasal (Gibco): 4℃保存，临用前按50:1的比例加入B27无血清培养液添加剂(Gibco)。

Poly-D-lysine (Sigma): 1 mg/ml，可回收利用。

0.25%胰酶(250 ml)（细胞系用）：NaCl 2 g，KCl 0.05 g，KH2PO40.05 g，Na2HPO4·12H2O 0.721 g，胰酶(Sigma) 0.3125 g，EDTA 0.05 g，苯酚红0.001 g，碳酸氢钠0.145 g。

先将胰酶和EDTA 入瓶内溶1-2 h（4 o C），然后加入KH2PO4，Na2HPO4·12H2O及苯酚红的混合液混匀，溶解2 h （4 o C），在混合后的最后10 min加入0.145 g碳酸氢钠，调pH值至7.0~7.5，立即过滤以防碳酸挥发。

小鼠原代神经元细胞的分离

原代神经元细胞的分离培养（小鼠）
本实验是自己实验室平时做的（仅供参考）
实验材料的准备：出生24h以内的小鼠若干只；预冷的pbs（不含钙、镁离子）；DMEM（高糖）培养液（实验之前预热）；75%酒精；尖头镊子、小剪刀；含EDTA的胰酶（实验之前预热）；神经元细胞培养液；灭菌的1.5mlEP管若干只
实验阶段：（整个操作保持无菌）
1，取小鼠用酒精擦拭全身，用剪刀剪下小鼠头部，小心剥下头皮和脑壳后取出整个脑子放入预冷的pbs中（也可以把pbs放在冰盒上面）
2，用剪头镊子小心剥下脑膜、小脑和大脑中的血管后将其放进1.5mlEP管中
3，用小剪刀反复剪（感到手很累了为止），然后用1ml枪头将其加入预热的胰酶中，反复吹打几次后放进37℃ 5%CO2培养箱中孵育20min，期间晃一晃有利于重复消化
4，消化时间到了之后，用含血清的DMEM培养液终止消化后，用吸管反复吹大几次
5，过筛网：用大概200目的筛网过滤后，计数种于培养皿中（培养皿提前一天用多聚赖氨酸包被）（6cm dish种300w个为好）
6，24h后，换成神经元培养液，48h后加入5-氟-脱氧尿苷（终浓度20ug/ml），以后每3-4天换半液。

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评估神经元，ＮＳＥ染色、ＮＭＤＡＲ１染色和台盼兰染色。结果：神经元纯度高（＞９５％），死亡率低（＜５％），细胞形态好，交联充分，背景干净。结论：利用新生大鼠皮质建立了高质量、高产量、简便的神经元培养模型。关键词皮质神经元；原代培养；细胞模型；乳鼠
ＵＢ／ｎｇ￣ＷＮＧＸｕ－ｈｕｉｓＮＩ
，，
济南２５００３１
２．解放军第３０３医院南宁５３００２１３．第三军医大学大坪医院野战外科研
究所
０Ｚｈｅｎ，ＣＡＯＢ／ｎｇ－ｚｈｅｎ￣Ｊ．ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｎａ／ｎＭｉｌｉｔａｒｙＡ／ｃａ，Ｊ如ａｎ
０．２５％胰酶消化３０ｍｉｎ，漂洗后轻柔吹散细胞，过滤后１０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清，加接种液吹匀后过滤，
１．济南军区总医院
静置３～５ｍｉｎ，取上层液体计数并接种。接种后４、４５、９６ｈ全量换液，之后每３ｄ半量换液１次。培养第５天
Ｆｉｒｓｔｌ￣ｔｈｅｃｏｄｅｘｏｆｎｅｗｂｏｒｎＷｉｓｔａｒｍｉｃｅｙｏｕｎｇｅｒｔｈｎａ１２ｈｏｒｓｕｏｌｄｗａｓｈｏｔｒｏｕｇｈｌｙｓｅｐａｒａｔｅｄ．Ａｎｄｈｅｔｎｈｅｔｃｏｒ￣ｔｅｘｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ０．２５％ｔｙｒｉｓｉｎｆｏｒ３０ａｉｒｎａｔｅｆｒｃｕｔｔｉｎｇｉｎｔｏｐｉｅｃｅｓ．Ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｒｓｅｄ．ｂｌｅｗｎｄａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄａｔ１０００ｒｐｍｆｏｒ５ｍｉｎａｔｆｅｒｉｌｆｔｅｉｎｒｇ．Ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗａｓａｂｎｄａｏｎｅｄ，ｎｄａｔｈｅｒｅｓｕｌｔａｎｔｗａｓａｄｄｅｄｗｉｔｈｐｌｎｔａａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ，ｇｅｎｔｌｙｂｌｅｗｎｄａｉｌｆｔｅｒｅｄ．Ａｆｔｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｒｆ３－５ｍｉｎ，ｔｈｅｓｕｐｅｎａｒｔａｎｔｌｉｑｕｉｄｗａｓｗｉｈｄｔｒａｗｎｉｎｏｒｄｅｒｔｏ
．
重庆４０００４２
基金项目
２５００３１。Ｃｈｉｎａ；２．Ｎｏ．３０３ＨｏｓｐｉａｌｔｏｆＣｈｉｎｅｓｅＰｅｏｐｌｅ＇ｓＬｉｂｅｒａｔｉｏｎＡｒｍｙ，Ｎａｎ／ｕｎｇ５３００２１，Ｃｈｉｎａ；３ＤａｐｉｎｇＨｏｓ ’ ｐｉｔａｌ，ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｉｔｔｕｔｅｏｆＳｕｒｇｅｒｙＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｎｇ４／０００４２，Ｃｈｉｎａ
神经损伤与功能重建．２０１６年１１月－第１１卷・第６期
．
４７１
论著．
一
种高效简便的原代神经元培养方法
张涛，胡怀强，王旭辉，牛兵，陶珍，曹秉振
作者单位
摘要目的：建立一种简便高效的原代神经元培养方法。方法：出生１２ｈ内的ｗｉｓｔａｒ乳鼠，分离皮质后剪碎，
十二五全军重点项
目
Ｎｏ．ＢＷＳ１１Ｊ０６２
ห้องสมุดไป่ตู้
Ａｂｓｔｒａｃｔ０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｌｌｅｉｃｆｉｅｎｔａｎｄｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｍｏｄｅｌｏｆｃｕｌｔｕｒｉｎｇｐｉｒｍａｒｙｎｅｕｒｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：
中图分类号Ｒ７４１；Ｒ７４１．０２文献标识码ＡＤ０Ｉ１０．１６７８００．ｃｎｋｉ．ｓｊｓｓｇｎｃｊ．２０１６．０６．００１
ＡｎＥｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄＣｏｎｖｅｎｉｅｎｔＭｏｄｅｌｏｆＣｕｌｔｕｒｉｎｇＰｒｉｍａｒｙＮｅｕｒｏｎｓＺＨＡＮＧＴａｏ一，ＨＵＨｕａｉ — ｑｉａｎｇ，