流式细胞分析
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第十章 流式细胞分析
第一节 流式细胞分析理论知识
• 流式细胞术的定义：是一种对处在快速直 线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参 数的快速定量分析和分选的技术。
• 流式细胞仪的定义：是以激光为光源，集 流体力学技术、电子物理技术、光电测量 技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、 单克隆抗体技术为一体的细胞分析仪器。
• 样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞 通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细 胞荧光信息。
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞
单个细胞的悬液
荧光
染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压
力 从样品管进入流动室形成样本流
• 鞘液作用：辅助样本流被正常检测 的基质液。主要作用是包裹样本流 的周围，保持样本流中细胞处于喷 嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻 塞喷孔。
液流系统示意图
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波
长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞 的快速流动，每个细胞经过光照区的时间 仅为1μs左右，且细胞所携带荧光物质被 激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间 和激发光的强度有关，因此细胞必须达到
可测量的参数
• 分为：结构参数和功能参数 • 1、结构参数：细胞大小、形态、细胞核与
细胞质的比值，色素颗粒，亚细胞形态， DNA，RNA，蛋白质含量，细胞表面抗原， 碱性蛋白，染色体结构。
• 2、功能参数：氧化还原酶状态，表面电荷， pH值，膜电位，酶活性，DNA合成能力， 膜的流动性，细胞受体，线粒体膜电位， 细胞浆和膜的钙离子活性。
足够的光照强度。
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长
波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光
（三）光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和 小孔组成。 滤光片主要分为： 1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞 等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
上的光通过。 2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。 3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长
范围内的光通过。
长通滤片
短通滤片
带通滤片
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
• （四）细胞分选系统
• 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对 具有某种特征的细胞需进一步培养和研究 时进行的。
什么是流式细胞仪
●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞的样本制备技术
• 关键是制备：单细胞悬液。
流式细胞的检测步骤
• 1、单细胞悬液 • 2、对测量细胞进行荧光标记染色 • 3、流式细胞测量 • 4、对测量结果进行定量分析 • 5、对测量结果进行生物医学意义解释
影响因素
• 1、荧光染色 • 2、激光光源的稳定性 • 3、细胞流速的稳定性 • 4、细胞悬液样品的影响
第二节 仪器检测原理
• 分类： • 流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和
科研型。 • 临床型只有分析功能，没有分选功能，操
作简便，易学易掌握。 • 科研型既有分析功能又有分选功能，可快
速将所感兴趣的细胞分选出来。
流式细胞仪的分类
• 流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细 胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。
• 前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细 胞内某种生物化学成分wenku.baidu.com参数。
• 狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑 直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核 浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。
狭缝扫描流式细胞仪
– 侧向散射角(Side Scatter，SSC)：与激光束正 交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度 正相关。
• 散射光信号波长与激光相同。
2.荧光信号 当激光光束与细胞正交 时，一般会产生两种荧光信号。一种是细 胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号， 称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧 光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光 信号，通过对这类荧光信号的检测和定量 分析能了解所研究细胞的性质和数量。
荧光信号
激光的作用原理
• 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激 发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的 光信号分别到达不同的光电倍增管，光电 倍增管将光信号转换成电信号。电信号输 入到放大器放大，放大器分两类：线性放 大和对数放大。
分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
二、散射光信号和荧光信号的检测
• 散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。
– 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞 的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值， 来排除样品中的各种碎片。
被检细胞直径 大于激光光斑直径， 细胞通过光束时各 部分被依次扫描。
流式细胞仪的结构可分为流动室及液流 驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学 系统；信号检测与存贮、显示、分析系统； 细胞分选系统等五个部分。
• 一、流动室与液流驱动系统
• 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一 个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心， 流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
第一节 流式细胞分析理论知识
• 流式细胞术的定义：是一种对处在快速直 线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参 数的快速定量分析和分选的技术。
• 流式细胞仪的定义：是以激光为光源，集 流体力学技术、电子物理技术、光电测量 技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、 单克隆抗体技术为一体的细胞分析仪器。
• 样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞 通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细 胞荧光信息。
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞
单个细胞的悬液
荧光
染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压
力 从样品管进入流动室形成样本流
• 鞘液作用：辅助样本流被正常检测 的基质液。主要作用是包裹样本流 的周围，保持样本流中细胞处于喷 嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻 塞喷孔。
液流系统示意图
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波
长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞 的快速流动，每个细胞经过光照区的时间 仅为1μs左右，且细胞所携带荧光物质被 激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间 和激发光的强度有关，因此细胞必须达到
可测量的参数
• 分为：结构参数和功能参数 • 1、结构参数：细胞大小、形态、细胞核与
细胞质的比值，色素颗粒，亚细胞形态， DNA，RNA，蛋白质含量，细胞表面抗原， 碱性蛋白，染色体结构。
• 2、功能参数：氧化还原酶状态，表面电荷， pH值，膜电位，酶活性，DNA合成能力， 膜的流动性，细胞受体，线粒体膜电位， 细胞浆和膜的钙离子活性。
足够的光照强度。
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长
波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光
（三）光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和 小孔组成。 滤光片主要分为： 1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞 等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
上的光通过。 2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。 3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长
范围内的光通过。
长通滤片
短通滤片
带通滤片
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
• （四）细胞分选系统
• 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对 具有某种特征的细胞需进一步培养和研究 时进行的。
什么是流式细胞仪
●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞的样本制备技术
• 关键是制备：单细胞悬液。
流式细胞的检测步骤
• 1、单细胞悬液 • 2、对测量细胞进行荧光标记染色 • 3、流式细胞测量 • 4、对测量结果进行定量分析 • 5、对测量结果进行生物医学意义解释
影响因素
• 1、荧光染色 • 2、激光光源的稳定性 • 3、细胞流速的稳定性 • 4、细胞悬液样品的影响
第二节 仪器检测原理
• 分类： • 流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和
科研型。 • 临床型只有分析功能，没有分选功能，操
作简便，易学易掌握。 • 科研型既有分析功能又有分选功能，可快
速将所感兴趣的细胞分选出来。
流式细胞仪的分类
• 流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细 胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。
• 前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细 胞内某种生物化学成分wenku.baidu.com参数。
• 狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑 直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核 浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。
狭缝扫描流式细胞仪
– 侧向散射角(Side Scatter，SSC)：与激光束正 交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度 正相关。
• 散射光信号波长与激光相同。
2.荧光信号 当激光光束与细胞正交 时，一般会产生两种荧光信号。一种是细 胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号， 称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧 光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光 信号，通过对这类荧光信号的检测和定量 分析能了解所研究细胞的性质和数量。
荧光信号
激光的作用原理
• 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激 发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的 光信号分别到达不同的光电倍增管，光电 倍增管将光信号转换成电信号。电信号输 入到放大器放大，放大器分两类：线性放 大和对数放大。
分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
二、散射光信号和荧光信号的检测
• 散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。
– 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞 的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值， 来排除样品中的各种碎片。
被检细胞直径 大于激光光斑直径， 细胞通过光束时各 部分被依次扫描。
流式细胞仪的结构可分为流动室及液流 驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学 系统；信号检测与存贮、显示、分析系统； 细胞分选系统等五个部分。
• 一、流动室与液流驱动系统
• 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一 个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心， 流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群