用根癌农杆菌介导获得籼稻转基因植株
农杆菌介导法
农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。
在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。
基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。
而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。
本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。
1材料以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。
菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。
农杆菌菌株为EHA105。
2方法2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。
将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培养 ,得到胚性愈伤组织。
2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。
根癌农杆菌介导的水稻转化研究进展
已分离出大量农杆 菌菌株，并对某些进行了修饰以用于转 化。 用于水稻转化的主要 有两个 Ｔｉ质粒载体 系统 ；共 整合载体 系统和 双元载体系统。前 者是 指 Ｔｉ质粒 上编码致 癌基 因的序列被一 段 ｐＢＲ３２２ＤＮＡ所 取代 ，带外源基因的 ｐＢＲ３２２衍生中间载体由大肠 杆菌转入农杆菌后，二者相 同的 ｐＢＲ３２２序 列友生 同源重组 ．外源 基 禹就此整合在缴械 Ｔｊ质粒 上。后者是 指在 一十农杆 菌株系 中
首倒报道该法获得转化 植株是 １９９３年，此后 ，一 些实验 室相 继获 得了不 同亚种 的水稻转 基 因植株。详见表 １： ２ 影响农杆菌 升导转 化水 稻的因 素
由农杆菌舟导来转化水稻是否成功 ．受到根多 因素的影响 ，其 中至关重要 的包括 ：水稻基 因型．接种组织类型，幼嫩程度 ．载体类 型，农杆菌菌系，供选择的标记基 因和选择剂 ，组 织培养 条件等 。 ２．１ 水 稻 基１８卷第 ２期 ２００２年 ４月
生 物 学 杂 志 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ
文章 编号 ：１００８－９６３２（２００２）０２－０００４－ ０４
Ｖ ｏ１．１９ Ｎ ｏ．２ Ａ ｐｒ，２００２
根 癌 农 杆 菌介 导 的水 稻 转化 研 究进 展
何迎 春 ，高 必 达 ，易 图永 ，任 春 梅
（湖 南农 业大 学植保 系，湖 南长沙 ４１０１２８）
摘 要 ：农杆 菌舟导的水稻基因转化是水稻基 因转化的热门。表 文对由农轩 菌介导转化获得 的水稻品 系（品种 ），影响农杆 菌舟 导转化的因素．农轩 菌浸染的方法，外源基 因的检 刹和遗传等方 面作踪合论述，并提 出 了农杆 菌介 导转化水稻 的前示。
根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
ａ ｖ ｌ经 伤 害处 理 的萌 发 种 子 的离 体 根作 起 始 材 ｉ 小可替代 的 优势 ， 如转 入 的外源 Ｄ Ａ结构 完 整 、 Ｎ 转 ｎ ｔ ｅ 以 ４ ８作筛 选 剂 ， 经农 杆 菌转 化 后 只得 到抗性 化机理 清楚 、 整合 位 点较 稳定 、 贝数 低 、 源 基 因 料 ， Ｇ １ 拷 外 表达 比较稳 定 等 ， 因此人 们 一直 在 探 索单 子 叶植 物 的农 杆 菌介 导 的 遗 传 转 化 技 术 。进 入 ２ ０世 纪 ９ ０ 年代 以后 ， 着人 们 对农 杆 菌侵 染 机 制 的进 步 了 随 愈伤 组 织 。 Ｌ 等 分 析 了 经 农 杆 菌 感 染 后 影 响 ｉ Ｇ Ｓ基 因 瞬 时 表 达 的 因 素 ， 次 使 用 Ｐ ５ — Ｕ — Ｕ 首 ３ Ｓ Ｇ Ｓ Ｉ Ｔ结 构 ，ｄＡ基 因 中插 入 一 个 植 物 内含 子 ， 免 Ｎ ｕｉ 避
ｏ ｂｒ ） 其 目的 是 造 泛 的应 用 。但 单 子 叶植物 ， 其 是 禾本 科 作 物 一 直 ｐ ｎ ａｅ 的成 熟 胚 （ 盾 片 经 切 割 处 理 ， 尤 利 详 ． ， 被认 为不 在农 杆 菌宿 主范 围 以 内 ， 难 以转 化 的物 成伤 害 反 应 ， 于农 杆 菌侵 染 ， 见 ２ ２节 ） 结 果 是 ９ ０年 ， 宝健 李 种 （ｅ ａ ｉａ ｔ ｐｃｅ ） 因 此 最 初 人们 一 直 采 用 非 只得 到 抗 卡 那 霉 素 的 愈 伤 组 织 。１ ９ ｒ ｌ ｔ ｎ ｓｅｉｓ ， ｃ ｃｒ 等 首 次报 道用 酚 类化 合 物 ， 处理 农 杆 菌及 在 共 预 农杆 菌介 导 的方 法对 单 子 叶植 物 进行 遗 传 转 化 ， 其
维普资讯
植 物 生 理 学 通讯
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展植物真菌是一类重要的微生物，在自然界中具有重要的地位，它们可以在植物体内或外引起多种作物的病害。
为了有效防治和控制植物真菌的病害，基因转化技术已经成为一种重要的手段。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术具有高效、简单、灵活等特点，在植物真菌遗传改良研究中得到了广泛应用。
本文将对根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展进行综述。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术是利用根癌农杆菌T-DNA插入真菌染色体中，实现外源基因的导入。
根癌农杆菌T-DNA在感染植物组织过程中，T-DNA的两侧的重复序列对应产生质粒的头部和尾部，T-DNA插入到植物基因组中去除了生发区和生殖区基因的调节因子，导致细胞无法分化造成根癌，自然或人工去除这些基因后，再将目的基因嵌合到T-DNA后导入目标植物组织并在细胞层或组织层产生效应。
1. 研究目的明确根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的研究目的是为了利用该技术将外源基因导入真菌细胞中，从而使真菌获得新的性状或功能。
目前，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术已被成功应用于多种真菌，如白僵菌、酿酒酵母、木霉等。
这些研究表明，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在真菌改良中具有广阔的应用前景。
2. 技术改进在根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的研究过程中，研究人员还对该技术进行了不断改进，以提高其转化效率和稳定性。
通过对根癌农杆菌T-DNA的结构和功能进行深入研究，研究人员已成功构建了一些具有高效转化能力的根癌农杆菌株系，并利用这些株系进行了真菌遗传转化研究。
研究人员还对真菌遗传转化的各个环节进行了逐一优化，从而取得了一系列令人满意的研究成果。
3. 应用领域拓展三、面临的挑战与未来展望尽管根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在植物真菌遗传改良研究中取得了一系列的进展，但在实际应用中仍然面临着一些挑战。
由于真菌的遗传特性复杂，其遗传转化技术相对于细菌和植物来说较为困难，因此对真菌的遗传机制和代谢途径的研究仍需要进一步加强。
根癌农杆菌介导转化水稻成熟胚及转Metr基因植株的获得
收稿日期 ! 修回日期 ! ! % % & % " ’ !" ! % % & ’ % ! ! " 基金项目 ! 国家植物转基因专项 ! 编号 # " $ 国家自然科学基金项目 ! 编号 # " $ 江苏省科技厅项目 ! 编号 # 和江苏省 教 ( ) % * + , + ’ % * % ’ " % # , . ! % % ! * % ’ 委基金项 目 ! 编 号# % $ % ’ / ( , ! ’ % % % *" 0 1 3 4 5 6 78 ; 5 < 3 = ; >? 4 ; = @ 6 = < BC > ; = 5DEF C 4 3 6 B 5! : 3 H ( ) % * + , + ’ %" : ; 5 < 3 = ; >: ; 5 1 4 60 B < 6 = B 6 2 2 9: A G ! ! " $ I 3 1 = 7 ; 5 < 3 = : 3 H * % ’ " % # F 6 ; 4 5 J 6 = 5 @3 K @ B < 6 = B 6; = 75 6 B L = 3 > 3 : 3 H , . ! % % ! * % ’" ; = 7M 7 1 B ; 5 < 3 = : 3 H % ’ / ( , ! ’ % % % *" 3 K( < ; = @ 1A 3 N + A 9! 2 A & 6 4 = J 6 = 5 # # 作者简介 ! 于恒秀 ! $ 女$ 副教授 $ 专业方向 # 植物遗传育种 (? 1 ’ O -’" 6 > % # ’ & + " O " O * % &) M + J ; < > L P Q 1 H 6 7 1 H B = "9 9 通讯作者 ! 顾铭洪 ! $ 男$ 教授 $ 博士生导师 $ 专业方向 # 植物遗传育种 (? # # ’ O * O’" 6 > % # ’ & + " O " ! ’ * O) M + J ; < > 1 J L Q 1 H 6 7 1 H B = "9 A
根癌农杆菌介导籼稻高效遗传转化体系的构建
Ｘ Ｉ Ｈ ｕａ ａ 。。 ， Ｅ － ｎ ，，，
许 惠 滨 ，魏 毅 东 ，连 玲 ，等 ． 根 癌农 杆 菌介 导 籼 稻 高 效 遗 传 转 化 体 系 的 构建 口］ 福建 农 业 学 报 ，２ １ ，２ （ ） ７ －４ ０ ． ０ ２ ７ ５ ：４ ５ ８ ．
ＸＵ Ｂ， Ｉ — Ｈ— ＷＥ Ｄ，ＬＡＮ Ｙ Ｉ Ｌ，ｅ ｔ ｔ ．Ｄｅｅｏ ｍｅ ｔ ｆ ｇ ｒｑ ｅ ｃ ｒｎ ｆｒ ｔ ｎｏ ｄｅ ｉ ｄａｅ ｙ ｒｂｃｅｉｍ ［］ ｕ ｉｎ ａ ｖ ｌｐ ｎ ｈＦ ｅ ｕｎ ｙＴ ａｓｏｍａｉ ｆｎ ｉ Ｒｃ Ｍｅ ｉ ｄｂ ｏａ ｔｒｕ Ｊ．Ｆ ｊａ ｏ Ｈｉ ｏ Ｉ ａ ｅ ｔ Ａｇ
（ ． ｃ Ｒｅｅ ｒｈ Ｉ ｓｉｕｅ，Ｆｕ ｉｎＡｃ ｄｅ ｆＡｇ ｉｕ ｔ ｒ ｌＳ ｉｎ ｅ ，Ｆｕ ｈ ｕ Ｆｕ ｉｎ ３ ０ １ ，Ｃ ｉａ； １ Ｒｉｅ ｓａ ｃ ｎ ｔｔｔ ｊａ ａ ｍｙ ｏ ｒｃ ｌｕ ａ ｃｅ ｃ ｓ ｚ ｏ ， ｊａ ５ ０ ９ ｈ ｎ ２ Ｋｅ ｂ ｒ ｔｒ ｆ ｒ ｌ ｓ Ｉ ｎ ｖ ｔｏ ｎ ｌｃ ｌｒＢｒ ｅ ｎ ｆ ｂ ｉ ｃ ｏ ｏ ｔ ｉａ。 ． ｙＬａ ｏ ａｏ ｙ ｏ Ｇｅｍｐ ａ ｍ ｎ ｏ ａ ｉｎａ ｄ Ｍｏｅｕ ａ ｅｄｉｇ ｏ Ｈｙ ｒｄ Ｒｉｅｆ ｒＳ ｕ ｈＣｈ ｎ Ｍｉｉｔｙｏ Ａｇｒｃ ｌ ｒ ，Ｐ． Ｃ ｉ ａ Ｆｕ ｈ ｕｂ ａ ｃ ｎｓｒ ｆ ｉｕ ｔ ｅ ｕ Ｒ ｈ ｎ ／ ｚ ｏ ｒ ｎ ｈ，Ｎａｉｎ ｌ ｃ ｍｐ ｏ ｅ ｎ ｎｅ ｆ Ｃ ｉａ／ ｊａ ｔｏ ａ ｅＩ ｒ ｖ ｍｅ ｔＣｅ ｔｒｏ ｈ ｎ ．Ｆｕ ｉｎ Ｒｉ Ｅｎ ｉ ｅｒｎ ｂ ｒ ｔｒ ｆ Ｃｒ ｐ Ｍｏｅｕ ａ ｅｄｉｇ／Ｆｕ ｉ ｎＫｅ ｂ ｒ ｔｒ ｆＲｉｅＭｏｅｕ ａ ｇ ｎ ｅ ｉｇＬａ ｏ ａｏ ｙ ｏ ｏ ｌｃ ｌ ｒＢｒｅ ｎ ｊａ ｙ Ｌａ ｏａ ｏ ｙ ｏ ｃ ｌｃ ｌ ｒ Ｂｒｅ ｎ ｅｄｉｇ，Ｆｕ ｈ ｕ， ｊａ ３ ０ ０ ，Ｃ ｉａ； ． ｎ ｕ ａ ｏ ｆ Ｎａ ｉｎ ｌＫｅ ｂ ｒ ｔｒ ｆ ｊａ ｚ ｏ Ｆｕ ｉｎ ５ ０ ３ ｈ ｎ ３ Ｉ ｃ ｂ ｔｒｏ ｔｏ ａ ｙ Ｌａ ｏ ａｏ ｙ ｏ Ｆｕ ｉ ｎ
农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展
基金项目上海市科技兴农项目（沪农科推字〔2021〕第1-3号）；安徽省科技重大专项（201903a06020011）。
作者简介陈思（1997—），女，安徽安庆人，助理农艺师，从事水稻遗传育种工作。
*通信作者收稿日期2022-06-17农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展陈思张从合*王慧吴浩然杨力黄艳玲管昌红（安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，安徽合肥230088）摘要在水稻遗传转化过程中，农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多，比如转入的外源DNA 结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等，已被广泛应用于转基因技术中。
本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述，并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。
关键词水稻；根癌农杆菌；农杆菌介导转化法；遗传转化中图分类号S511文献标识码A文章编号1007-5739（2023）05-0001-04DOI ：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.05.001开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Research Progress on Influencing Factors of Agrobacterium-mediated GeneticTransformation of Rice and Its ApplicationCHEN SiZHANG Conghe *WANG HuiWU HaoranYANG LiHUANG YanlingGUAN Changhong(Anhui Win-all Hi-tech Seed Co.,Ltd./National Key Laboratory for New Variety Development of Hybrid Rice of Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hefei Anhui 230088)AbstractIn the process of rice genetic transformation,agrobacterium-mediated transformation method has manyadvantages compared with other methods,such as the complete structure and relatively stable expression of the transferred exogenous DNA,simple operation and high transformation rate.It has been widely used in transgenic technology.This paper reviewed the principles of rice genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens and the factorsaffecting genetic transformation,and discussed the application prospects of agrobacterium-mediated methods.Keywordsrice;Agrobacterium tumefaciens ;agrobacterium mediated transformation method;genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物之一，是全球1/2以上人口的主食，也已经成为植物基因组学研究的重要对象[1]。
农杆菌介导水稻转基因技术的原理与运用分析
·29·所谓的转基因技术实际上是DNA 技术的重组方式，从外源克隆到的优良基因直接地注入到植物体的基因组织当中来，对作物的遗传性特征进行改变，使其向着人类更加向往的发展方向。
转基因技术自从问世以来实现了非常快速的发展，目前全球种植转基因的作物越来越多。
农杆菌介导是转基因技术之一，其在水稻转基因当中的应用，采取的是外源基因转化的方式，使外源基因的转化更具更正性，降其为稳定性等，进而实现大片段的基因转换等。
近年来水稻转基因技术不断地发展，并取得了相当大的成效，其中农杆菌介导水稻转基因技术发胡了重要的作用，以下降低基本的原理以及运用情况进行重点分析。
1.基本原理农杆菌介导是一种天热性的基因转化系统。
在具体的划分过程中可以分诶根瘤农杆菌和发根农杆菌。
首先，根瘤农杆菌当中有一种肿瘤诱导颗粒，这种颗粒具有可转移性的DNA 以及毒性区和冠瘿碱代谢基因。
在T -DNA 的两端是在两个数为25bp 的重复性序列，分别位于左右两个边界当中，两个边界的序列之间又是生长素和细胞分裂素合成的共性基因以及冠瘿碱合成性基因。
不同的区域内存在多个基因段，每一个基因段当中又有非常多基因。
一旦植物出现被伤害的情况，就会分泌出具有酚类化合物的一种汁液，此种汁液是通过染色体的毒性基因等介导㢟进行传输的，从而使农杆菌可以向只的其他部位上进行移动，并附着在其表面之上。
在T -DNA的转移上两个边界序列与之关系非常密切，特别是右侧的边界对于T -DNA 的精准转移是必不可少的重要条件，而且在边界序列之间也存在着一定的基因，但这些基因对于T -DNA 的转移并不发生太大的影响。
因此，T -DNA 区域的基因是可以采取外源性基金进行替代的，之后再利用农杆菌将已经改造后的T -DNA 转移到植物的基因组织当中，进而获取到转基因的植株。
伴随着科学技术水平的不断提升，农杆菌转化也进入到了非常关键的阶段，人们对此进行了多次地改造，并使其载体不断地创新与完善，转化的效率不断地提升，这样应用的范围也会越来越广泛。
农杆菌介导的遗传转化籼稻Kasalath的条件优化
伤组织 ，以 ２ ． ５ ｍｇ ／ Ｌ的 ２ ， ４ ＿ ＿ Ｄ诱导效果 最佳 ；用菌液 Ｏ Ｄ６ ０ ０ Ⅲ ｎ 为０ ． ０ ５ 、０ ． １ 、０ ． １ ５ 、０ ． ２ 、０ ． ３ 、０ ． ４的农杆菌 Ａｇ ｌ ０
和Ｅ Ｈ Ａ１ ０ ５与愈伤组织共培养介 导遗 传转化 ，皆以 ０ １ ） ６ ｏ ０ ｍ ｎ 为０ ． １ ５的农杆菌溶液效果最好 ， 且Ｅ Ｈ Ａ１ ０ ５的介导 效
果 比 Ａｇ ｌ ０更佳 ，其抗性愈伤 率可达 ８ ２ ． ０ ％；Ｅ Ｈ Ａ１ ０ ５的介导（ 共培养） 时 间以 ３ ｄ为宜 ；分化培养前对愈伤组织进 行 ６～８ ｈ快 速干燥或 ４ ８ ～７ ２ ｈ慢速干燥处理 ，可以明显提高愈伤组织的再生成苗率 ，并缩短分化时间 ；在对 愈 伤组织侵染处 理前的预培养处理和对抗性 愈伤 进行 分化培养前的预分化培养处理对 Ｋａ ｓ ａ ｌ ａ ｔ ｈ的遗传转化效率影响 不大 ，可省略 以缩短遗 传转化时间 。遵循 以上优化条件 ，从愈伤组织诱导至遗传转化获得再生植株全需 ７ ０ ｄ以上） ，遗传转化效率可达到 已报道 的最高值 ６ ５ ％。
关
键
词 ：籼稻；２ ， ４ ＿ ＿ Ｄ ；农杆菌介导；遗传转化；影响因素 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ７ — １ ０ ３ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５ ￣ ） ４ ７ １ — ０ ７
中图分类号 ：￥ ５ １ １ ． ２ １ ０ ． ３ ５ ３
Ｓ ｔ ｕｄｙ ｏ ｎ ｔ ｈｅ ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｉ ｅ ｎｔ ａ ｎｄ ｒ ａ ｐｉ ｄ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｔ ｒ ａ ｎｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｋａ ｓ ａ ｌ ａ ｔ ｈ ｍｅ ｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｂｙ Ａｇｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ
根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
［中 图分 类 法］￥３３０．２５
［文 献 标 识 码 ］Ａ
［文 章 编 号 ］１００３－６１８０ （２００８）Ｏ１—００３Ｏ一 ０３
水 稻是 重要 的粮 食 作 物 ，全 世界 约 有 三 分 之 一 以上 的人 口以 稻 米 为 主食 ，因此 ，提 高 水 稻 产 量 、改 良稻 米 品质关 系到人 类 的发展 和健康 ．近年 来 ，应 用基 因工 程 技术 导 人 外 源有 利 基 因 已创 造 出一批 抗病 、抗 虫 、抗逆 的水 稻新 品种 、新 品系．本 实验采 用根 癌农 杆 菌介 导 的遗 传 转 化方 法 ，将反 义编码 Ｗａｘｙ（蜡 质 基 因）片段 基 因导 入 水 稻 中． 通过成 熟胚 和 幼胚 转 化 效果 的 比较 ，以期 获 得转 化 的最 佳受 体．
参 考文 献
［１３ Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｈ ，Ｈｉｎａｔａ Ｋ．ＮＡＡ－ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏ－ｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ Ｓｏ ｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ Ｌ［－Ｊ］．Ｅｘｐ
Ｂｏｔ，１９７９ ，３０ Ｉ３６３－３７０．
１．２ 培养基
外植体 培养 基 培 养基 中均加入 水水 解酪 蛋 白 ０．５ ｇ／Ｌ，蔗糖 ３０ ｇ／Ｌ，葡萄糖 １０ ｇ／Ｌ，琼脂粉 ８ ｇ／Ｌ．
① 愈伤组 织诱 导培 养基 ：Ｎ６＋２，４一Ｄ ２ ｍｇ／Ｌ （单 位 下同）＋ＫＴ ０。５＋ＮＡＡ ０。５ ＰＨ＝５。８
②共 培养 培养 基 ：Ｎ６＋ ２，４一Ｄ ２＋ 乙 酰 丁香 酮 １００ ｇｍｏｌ／Ｌ ｐＨ＝５．２
根癌农杆菌介导的水稻转化体系
根癌农杆菌介导的水稻转化体系刘永巍，田红刚，孟昭河，孟巧霞，李春光，张景龙（黑龙江省农垦科学院水稻研究所，黑龙江佳木斯１５４０２５）摘要：简要回顾了水稻转基因发展的历程；通过农杆菌介导法转化水稻的流程，分析了几种根癌农杆菌介导的目的基因转化水稻的影响因素：农杆菌菌系及Ｖｉｒ基因的活化、水稻基因型和培养基种类、农杆菌侵染外植体的时间、共培养的方式、共培养时间、选择标记与报告基因的选择、选择压；最后提出了水稻遗传转化中存在的问题及解决的方法。
关键词：水稻；转化；根癌农杆菌水稻是人类重要的粮食作物，全世界约有１／３以上的人口以稻米为主食。
随着科技的进步，对水稻基因转化技术的研究有了突飞猛进的发展，这归功于人类对植物基因结构、功能和表达有较为清晰的了解。
近年来，应用基因工程技术导入外源有利基因已创造出一批抗病、抗虫、抗逆的水稻新品种、新品系。
目前，水稻转基因的方法有：ＰＥＧ法（聚乙二醇法）、脂质体法、显微注射法、电击法、激光微束法、超声波法、花粉管通法、基因枪法、农杆菌介导法等等。
其中以后两种方法应用较多，尤其是农杆菌介导法，随着研究的深入，转化效率的提高，已经成为越来越多科研人员培育新品种的有效方法。
然而，由于水稻品种间遗传差异大，且其对转化反应的基因型依赖性强。
因此，建立一种有效、稳定的水稻农杆菌转化系统仍有许多问题需要做细致深入的研究。
１转基因水稻的发展历程早期的水稻转基因方法主要是以原生质体为受体的ＰＥＧ、电击法等以直接转化为主，并于１９８８年获得第一批转基因水稻，但这些方法受到基因型、原生质体培养和再生植株困难的限制。
此后，又相继出现了脂质体转化法、显微注射法、激光微束法等等，这此方法都各有其特点、适用范围及局限性。
基因枪转化方法是由美国康奈尔大学生物化学系ＪｏｈｎＣ．Ｓａｎｔｏｒｄ等人于１９８７年研制成功，此方法已在籼稻、粳稻和爪哇稻中获得了转基因植株。
基因枪法虽然使用方便，可转化多种组织和器官，但插入基因的拷贝数往往较多，在后代中容易丢失、大片段基因难以导入、实验成本高。
利用根瘤农杆菌制备转基因植物的方法
利用根瘤农杆菌制备转基因植物的方法一、背景介绍1. 转基因植物简介随着生物技术的发展，转基因植物已在农业生产中得到广泛应用。
转基因植物是指将外源基因导入植物基因组，从而赋予植物新的性状或改善原有性状的植物。
转基因植物具有抗病虫害、耐逆境、提高产量等特点，在农业生产中具有重要的应用价值。
2. 根瘤农杆菌简介根瘤农杆菌是一种土壤中常见的细菌，它具有特殊的DNA转移酶，能够将外源基因导入植物细胞核。
根瘤农杆菌被广泛应用于制备转基因植物的过程中。
二、根瘤农杆菌制备转基因植物的方法1. 选择表达载体在利用根瘤农杆菌制备转基因植物的过程中，首先需要选择合适的表达载体。
表达载体是一种携带外源基因并能够在植物细胞内表达的载体。
常用的表达载体包括质粒和农杆菌头部。
2. 构建重组质粒将外源基因插入表达载体中，构建重组质粒。
在构建重组质粒时，需要考虑外源基因的稳定性、表达水平和对植物生长发育的影响。
3. 选择合适的宿主植物选择适合的植物作为宿主植物。
在选择宿主植物时，需要考虑植物的再生能力、组织培养条件和对外源基因的接受性。
4. 根瘤农杆菌介导的遗传转化将构建好的重组质粒介导至根瘤农杆菌中，使其在植物组织中导入外源基因。
通过适当的方法，将根瘤农杆菌转化入宿主植物细胞内，实现外源基因的导入。
5. 诱导再生植株待外源基因在植物细胞内表达后，通过诱导再生植株的方式，培养出带有外源基因的植株。
6. 筛选转基因植株通过对转基因植株进行筛选，筛选出带有目标性状的植株。
筛选过程中，通常使用抗性标记基因或荧光标记基因作为筛选标志。
7. 鉴定转基因植物对转基因植物进行鉴定，确认其确实带有外源基因并且表达稳定。
鉴定方法包括PCR、Southern blot等分子生物学技术和生化分析。
三、根瘤农杆菌制备转基因植物的优势1. 高效性根瘤农杆菌介导的遗传转化具有高效性，能够快速、准确地将外源基因导入植物细胞内。
2. 多样性根瘤农杆菌制备转基因植物的方法适用于多种植物，包括大豆、玉米、水稻等重要农作物。
根癌农杆菌介导水稻成熟胚及抗褐飞虱基因植株的获得
根癌农杆菌介导水稻成熟胚及抗褐飞虱基因植株的获得李三和;韩光明;闸雯俊;刘凯;胡刚;游艾青【摘要】以水稻(Oryza sativa L.)籼型两系恢复系M5274和晚粳稻不育系N55S 成熟胚为材料,以携带有双元载体的根癌农杆菌(A grobacterium tumefacie ns)EHA1 05为载体进行抗飞虱基因Bph14、Bphi008A、Osg1的遗传转化,共获得515棵再生植株,包括198株Bph14转基因植株、72株Bphi008A转基因植株和245株Osg1转基因植株.PCR检测结果表明,获得的515株再生植株中,有244株阳性转基因植株,3个不同抗褐飞虱基因中,转Bph14基因的再生苗阳性率最高,增加筛选次数能有效减少转化所得的假阳性植株.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2016(000)009【总页数】4页(P2392-2395)【关键词】水稻(Oryza sativa L.);根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化;抗褐飞虱基因【作者】李三和;韩光明;闸雯俊;刘凯;胡刚;游艾青【作者单位】湖北省农业科学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心/湖北省作物种质与遗传改良重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心/湖北省作物种质与遗传改良重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心/湖北省作物种质与遗传改良重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心/湖北省作物种质与遗传改良重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心/湖北省作物种质与遗传改良重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心/湖北省作物种质与遗传改良重点实验室,武汉430064【正文语种】中文【中图分类】S511近年来，褐飞虱迁入中国的虫量大，由于目前大多数水稻（Oryza sativa L.）品种不抗虫，尤其是一些主要的杂交稻品种，对褐飞虱等虫害还有“超感虫性”（hyper-susceptibility）［1］。
根癌农杆菌介导的高效水稻遗传转化影响因素研究进展
根癌农杆菌介导的高效水稻遗传转化影响因素研究进展韩光明;李三和;陈志军;游艾青;陈温福【摘要】对影响农杆菌介导水稻基因转化效率的各种因素进行了综述,并对转化过程中存在的问题进行了讨论,认为农杆菌菌株和载体、水稻基因型、转化受体、共培养条件、选择标记基因和转化程序等均是农杆菌介导高效水稻遗传转化必不可或缺的环节.要建立一个高效的农杆菌介导的植物转化系统,需要针对特定品种(品系)、特定组织和组培条件等诸多因素进行优化.%Influencing factors of rice genetic transformation mediated by Agrobacterium were reviewed in this paper, and problems in process of transformation were discussed. Agrobacterium tumefaciens strains and vectors, rice genotypes, transform receptors, co -culture conditions, selectable marker genes and transformation processes are considered as indispensable links of high efficiency Agrobacterium tumefaciens -mediated rice genetic transformation. Many factors shouldbe optimized in genetic transformation of rice before building up a high efficient Agrobacterium mediated transformation system for special varieties (lines) and tissue, as well as culture conditions.【期刊名称】《沈阳农业大学学报》【年(卷),期】2012(043)006【总页数】6页(P725-730)【关键词】根癌农杆菌;遗传转化;高效;影响因素;水稻【作者】韩光明;李三和;陈志军;游艾青;陈温福【作者单位】沈阳农业大学水稻研究所/农业部东北水稻生物与遗传重点实验室/北方超级粳稻育种教育部重点实验室,沈阳110161;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉430064;【正文语种】中文【中图分类】S511;S503.53由于稻属种质资源的局限性及传统育种方法的不足，人们试图通过常规育种与基因工程相结合的手段来提高水稻产量和品质，自农杆菌转化水稻获得转化细胞或转基因植株以来[1-2]，随着农杆菌转化技术的不断完善及应用的日益增多，农杆菌在转化禾本科作物应用方面显示出巨大的潜力[3-5]。
利用根癌农杆菌介导转化大豆成熟种子胚尖获得转基因植株
利用根癌农杆菌介导转化大豆成熟种子胚尖获得转基因植株刘海坤;卫志明【期刊名称】《植物生理与分子生物学学报》【年(卷),期】2004(30)6【摘要】利用根癌土壤农杆菌EHA105/pCAMBIA2301对来自大豆成熟种子的胚尖外植体进行遗传转化,并对农杆菌侵染时间长短以及乙酰丁香酮(AS)浓度等影响转化频率的条件进行了探讨.发现浸染时间以20 h为佳,乙酰丁香酮最佳浓度为200 umo1/L,并探讨了恢复培养的重要性.分别从3个大豆品种合丰35、合丰39、东农42得到了转基因植株,GUS染色及Southern杂交结果证明外源基因整合到大豆基因组中,获得转基因大豆的频率达6.4%～12.1%.【总页数】6页(P631-636)【作者】刘海坤;卫志明【作者单位】中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所,植物分子遗传国家重点实验室,中国科学院研究生院,上海,200032;中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所,植物分子遗传国家重点实验室,中国科学院研究生院,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】Q74【相关文献】1.根癌农杆菌介导转化获得耐逆性增强的高羊茅转基因植株 [J], 吴关庭;陈锦清;胡张华;郎春秀;陈笑芸;王伏林;金卫;夏英武2.根癌农杆菌介导转化水稻成熟胚及转Metr基因植株的获得 [J], 于恒秀;刘巧泉;王玲;黄健;龚志云;汤述翥;王为成;李凝;顾铭洪3.根癌农杆菌介导转化川草二号老芒麦胚性愈伤组织 [J], 李达旭;张杰;赵建;张艺;李力;刘素君;陈飞;杨志荣4.根癌农杆菌介导转化诸葛菜获得转基因植株 [J], 周冀明;卫志明;许智宏;刘世贵;罗鹏5.农杆菌介导法转化大豆体细胞胚获得转基因植株 [J], 王晓春;王罡;王萍;季静;刘尚前因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
根癌农杆菌介导的植物基因转化技术
实验7 根癌农杆菌介导的植物基因转化技术根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。
图1是植物表达载体pBI121的DNA图谱，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素抗性选择标记基因，以β－葡萄糖苷酶（β－glucuronidase,Gus）为报告基因，经pBI121转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。
图2－1 Ti质粒载体pBI121图谱实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。
一、试材与用具1．植物材料：烟草无菌苗2．农杆菌与载体：农杆菌LBA4404、质粒PBI1213．主要仪器：超净工作台、高压灭菌锅、小型离心机、光照培养箱或培养室、恒温摇床等。
二、方法步骤1．试剂的配制（1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白胨（5g/L），蔗糖（5g/L），MgSO4（2mmol/L） pH7.2。
固体培养基含琼脂15g/L。
（2）烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA（3）烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA（4）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
稻转基 因植株并 提供 了相应 的分 子证 据 。籼稻 组织 培养 比较 困难 ， 其转 基 因植 株 的获 得晚 于粳 稻” ， Ｊ而且难 于粳 稻 ， 今 ， 迄 其转 化 频 率 和绿苗 分化 频 率 多 数不 超 过 １ ％ 。因此 ， 用 ０ 要 于籼稻育 种 ， 必须建立 有效 的遗传转 化体 系 ， 提高转 化频率 。
的 方 法 一 。
１ ４ 遗 传 转 化 、 性 筛 选 和 绿 苗 分 化 ． 抗
主要 参照刘 巧泉等 的方 法 ， 除菌用 的抗生素作 了更改 ， 对 对抗性 筛选 的潮霉素 浓度稍加
调整 。 １５ Ｇ ． ＵＳ检 测 和 Ｐ Ｒ 扩 增 ｃ
按 Ｊｆ ｒｏ １ ８ ） 方 法 ， 定 抗 性 愈 伤 组 织 和转 基 因植 株 叶 片 的 ＧＵＳ活性 ຫໍສະໝຸດ ｅｆ ｓｎ（ ９ ７ 的 ｅ 测
ＣＣＳ￣； 分
＿
化 培 养 培 养 基 为 ＭＳ Ｈ； 苗 生 根 培 养 基 为 ＭＳ ＲＣ 绿 ＭＮＣ 上 述 培 养 基 参 照 刘 巧 泉 等 Ｈ，
的 方 法 ， 中 ， 伤 组 织 诱 导 培 养 基 由本 课 题 略 作 修 改 ， 性 筛 选 培 养 基 参 照 Ｐ ｒｒｋ ｓＩ等 其 愈 抗 ｏｔｙ ｕ
后愈 伤组织用 于遗传转 化 。 １２ 供 试 质 粒 和 菌 种 ．
ｐ３ １Ｗ４质 粒 由中国科学 院上海植 物 生 理研 究所 遗传 因子 研究 组 构 建 并提 供 。该 质粒 含 有蜡质基 因启 动子 、 蜡质基 因反义 片段 和 Ｇ ＵＳ基 因组成 的融合结 构 。并 通过冻 融法将该 质粒
维普资讯
上海 农 、 学报 Ｉ
２ ０ ， ８ １ ：６ ｌ ０２１（）１～ ９
ＡｃａＡｇ ｉｕｔ ｒ ｅ ｍｎ Ａ ｉ ｔ ｒｃ Ｌｕ ａ ｇ ａ
文 章 编 号 ：０ ０３ ２ （ ０ ２ ０ —６０ ［０ —９ ４ ２ ０ ） １１ —４
用 根 癌 农 杆 菌 介 导 获 得 籼 稻 转 基 因 植 株
收 稿 ｝期 ：０ １ ７ ９初稿 ； ０ １ ２ ５ 改稿 ｊ ２ ０ —０ 一ｏ ２ ０ —１ —０ 二 ＊国家科 拄部 玎Ｙ—Ａ一０ 一Ｏ 专 项 和上 海市 科委 科技 攻 ｌ 项 目（ 号 ０ ３ １ ０ ９ ２ ２ 芰 编 １９ ２ １） 作 者筒 舟 ： 丽 青 ， 殷 女 １６ 年 ４ 出生 ． 学本 科毕业 ， ９５ 月 大 副研究 员 研 究方 向 ： 植物 生物 技术 发 表论 文 ２ ０余篇 ＊＊上海师 范大 学 生命 与环 境 科学 学院 ． 士研 究生 ， 传专 业 硕 遗
按 Ｅ ｗ ｒｓ （９ １ 的方 法 ， ｄ ａｄ 等 １ ９ ） 提取 叶 片总 Ｄ 。 Ａ 按《 分子 克隆》 中介绍 的方法 对 转基 因植株 进行 Ｐ Ｒ检测 。 …， Ｃ 根据 ｐ ３ １ Ｗ４质粒 中蜡质 基 因反 义 片段 和 Ｇ Ｓ融 合基 因 片段 ， Ｕ 分别 设 计 和合 成 了 ｗ． ． Ｐ
定 和 Ｐ Ｒ检 阐 ， 果 证 明外 源 基 因确 已导 人 这些 转基 因 植株 之 中。 Ｃ Ｉ结
关键 词
籼 稻 ； 癌 农 杆 菌 ； 传转 化 ；转 基因 植株 根 遗
文献 标识 码 ： Ａ
中图 分类 号 ：Ｑ７ ５ ８
随着 生 物 技 术 的发 展 ， 物 转 基 因 技 术 有 了 较 大 的 进 步 ， 于 其 具 有 可 以 打 破 物 种 间 界 植 由 限 ， 接 进行 遗 传 操 作 实 现 定 向 改 良 ， 遗 传 稳 定 快 等 优 点 ， 以 正 被 应 用 于 育 种 实 践 。 直 且 所 水 稻 的转 基 因 研 究 始 于 ２ ０世 纪 ８ ０年 代 末 ， 先 在 粳 稻 上 获 得 突 破 ，９ ３年 获 得 了 粳 首 １９
… 通 讯联 系人 ，
维普资讯
１期
殷 丽 青 等 ： 根癌 农 杆菌 介 导获 得籼 稻 转 基 因植 株 用
１ ７
导 入 根 癌 农 杆 菌 ＥＨ ０ Ａ１５菌 种 。
１３ 培养基 ．
用 于根癌农杆 菌培 养 的培 养基 分 别为 Ｙ Ｂ、 Ｂ， 杆 菌 悬 浮 液 用 Ａ Ｅ Ａ 农 ＡＭ 培 养基 制 备 。 用 于 愈 伤 组织 诱 导 的 培 养 基 为 ； 培 养 的 培 养 基 为 共 ｃ； 性 筛 选 的 培 养 基 为 Ｃ Ｓ 、 抗 Ｃ ．
本研究 企 图以水稻蜡 质基 因反义 片段 为 目的基 因 ， 根癌 农杆 菌 介导 法 对籼 稻进 行遗 传 用 转化， 以期获得 转基 因植株 ， 并获取 相应 的分 子证据 。本 文报 道 该项研究 结果 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 品 种 和 遗传 转 化 受 体 ．
籼稻 （ ｒ ｔ ａ Ｓ Ｉｄ ｃ ） 特甫 品种 由扬 州大 学生物技术 学 院提供 。取授粉 １ － ｏ 婶２ ａｉ ｓ ｎ ｉ 龙 ｓ ｗ ｐ ａ ０ １ｄ的 未成 熟 胚 ， ２ ４ 用 ％Ｎａ ． 毒 ９ ｍｉ， 解 剖 刀 挑取 幼 胚 ， 行 组 培 诱 导 愈 伤 组 织 ， －７ ＯＣＬ 消 ０ ｎ用 进 ５ ｄ
殷丽青 王新其 王 慧 梅 ” 沈 革 志一
（ 海 市 农 业 科 学 院怍 物 育 种 栽 培 研 究 所 ， 海 ２ １ ０ ） 上 上 ０ １ ６
摘
要
用携 带 ｐ ３ 质粒 的 根 癌农 杆菌 Ｅ Ａ ０ 感 染 籼稻 龙 特甫 品种 的 幼胚 愈 伤 组织 ， １ ｗ４ Ｈ １５ 经
共 培养 并 在潮 霉 素 ２ －５ ｎ Ｌ浓 度 条 件下 筛选 ２ ５ ０ ～３次 ， 获得 了对 潮 霉 索 表 现 抗 性 的愈 伤 组 织 ． 其愈 伤 组织 转 化频 率 为 ２ ％； ５ ３ 将抗 性 愈 伤 组织 转 入分 ３化 培 养基 培养 形 成 植 株 ， ＧＵＳ活 性测 经