根癌农杆菌介导法
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Vir接收信号 VirA编码受体蛋白 C端活化 VirA蛋白被激活 Vir族蛋白活化
（具激酶功能，使组氨酸残基磷酸化） 酸基团至Vir蛋白) （受体蛋白与化学信号分子结合） （转移其磷
四、类似接合孔复合体的合成和装配 五、T-DNA的加工和转运 六、T-DNA的整合
Biblioteka Baidu
——影响T-DNA
转移的因素
农杆菌菌株 菌株侵染力：农杆碱型菌株>胭脂碱型菌株> 章鱼碱型菌株
Vir区 （virulence region)
Con区 （region encoding conjugation)
Ori区 （origin of replication)
——Ti质粒的改造
策略
由于野生Ti质粒直接作为植物基因工 程载体，存在许多障碍，故对野生型Ti质 粒可以采取两种不同的改造策略——一元 载体系统和二元载体系统。
外植体的接种及培养 一般接种时间1~30min 接种菌液浓度0.3~1.5OD
——基因枪法Vs
农杆菌法
转化 效率 基因枪法 低 宿主 范围 无限制 操作 可 控度 高
简便
根癌农杆 菌介导法
高
单子叶 植物；一 些双子叶 植物
复杂
低
农杆菌菌株高侵染活力的生长时期 一般用0.3~1.0OD农杆菌菌液接种植物材料
基因活化的诱导物 常用诱导物：乙酰丁香酮（AS）、羟基乙酰 丁香酮（HO-AS)
外植体的类型和生理状态 发育早期的组织细胞具有很强的分裂能 力，这些组织发生创伤活环境诱导时，加 速分裂，处于转化的敏感期。
外植体的预培养 一般为2~3天 作用：促进细胞分裂；使外植体适应于试管 立体培养的条件；有利于外植体能与培养 基平整接触。
基因组的过程
一、农杆菌对受体的识别 菌株对植物细胞所释放的化学物质产生趋 向性。
二、农杆菌附着到受体细胞 创伤部位生存了8~16h（细胞调节期）的菌 株才能诱发肿瘤。期间，农杆菌产生纤丝将自 身缚附在植物细胞壁表面。
三、诱导和启动毒性区基因表达 把植物受伤细胞提取液加入培养基，Vir 区基因均被诱导和活化。
植物基因工程
——根癌农杆菌介导法
——农杆菌
农杆菌是普遍存在于 土壤中的一种革兰氏 阴性细菌，它能在自 然条件下趋化性地感 染大多数双子叶植物 的受伤部位，并诱导 产生冠瘿瘤或发状根。
——原理
根癌农杆菌的细胞内有一个大的致瘤质粒，简称Ti 质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤 口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
——二元载体
基本原理：T-DNA区与Vir区不在同一个载 体上，Vir区通过反式作用使T-DNA区发生 缺失Vir，T-DNA卸甲， 转移。 引入酶切位点 微型Ti质粒 去掉T-DNA去 根癌农杆菌 辅助Ti质粒 外源基因 微型Ti质粒 含有辅助Ti 质粒的根癌农杆菌 植物
——T-DNA导入植物
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系, 改 造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。
——Ti质粒结构
特点
Ti-质粒的基因结构
T-DNA区 （transferred DNA region)
转移到植物基因组中的DNA 序列，与肿瘤形相关。 激活T-DNA的转移，使植物 致瘤，是毒性区。 调控Ti质粒在根癌农杆菌 之间的转移，是接合转移 编码区。 调控Ti质粒的自我复制， 为复制起始区。
相较而言，二元载体更多优点： 1、构建方便；2、效率高；3、不会带人大量 无用的冗余DNA序列。
——一元载体
（卸甲载体）
1. 切除T-DNA中的致瘤基因，仅保留两侧边 界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。 2. 在T-DNA区中删除致瘤基因位点插入与中 间载体同源的质粒序列。 3. 用特定转移方法转移中间载体，发生同源 重组。 4. 根据中间载体所携带的抗性基因进行筛选。 5. 用筛选后的菌株侵染植物组织细胞。
（具激酶功能，使组氨酸残基磷酸化） 酸基团至Vir蛋白) （受体蛋白与化学信号分子结合） （转移其磷
四、类似接合孔复合体的合成和装配 五、T-DNA的加工和转运 六、T-DNA的整合
Biblioteka Baidu
——影响T-DNA
转移的因素
农杆菌菌株 菌株侵染力：农杆碱型菌株>胭脂碱型菌株> 章鱼碱型菌株
Vir区 （virulence region)
Con区 （region encoding conjugation)
Ori区 （origin of replication)
——Ti质粒的改造
策略
由于野生Ti质粒直接作为植物基因工 程载体，存在许多障碍，故对野生型Ti质 粒可以采取两种不同的改造策略——一元 载体系统和二元载体系统。
外植体的接种及培养 一般接种时间1~30min 接种菌液浓度0.3~1.5OD
——基因枪法Vs
农杆菌法
转化 效率 基因枪法 低 宿主 范围 无限制 操作 可 控度 高
简便
根癌农杆 菌介导法
高
单子叶 植物；一 些双子叶 植物
复杂
低
农杆菌菌株高侵染活力的生长时期 一般用0.3~1.0OD农杆菌菌液接种植物材料
基因活化的诱导物 常用诱导物：乙酰丁香酮（AS）、羟基乙酰 丁香酮（HO-AS)
外植体的类型和生理状态 发育早期的组织细胞具有很强的分裂能 力，这些组织发生创伤活环境诱导时，加 速分裂，处于转化的敏感期。
外植体的预培养 一般为2~3天 作用：促进细胞分裂；使外植体适应于试管 立体培养的条件；有利于外植体能与培养 基平整接触。
基因组的过程
一、农杆菌对受体的识别 菌株对植物细胞所释放的化学物质产生趋 向性。
二、农杆菌附着到受体细胞 创伤部位生存了8~16h（细胞调节期）的菌 株才能诱发肿瘤。期间，农杆菌产生纤丝将自 身缚附在植物细胞壁表面。
三、诱导和启动毒性区基因表达 把植物受伤细胞提取液加入培养基，Vir 区基因均被诱导和活化。
植物基因工程
——根癌农杆菌介导法
——农杆菌
农杆菌是普遍存在于 土壤中的一种革兰氏 阴性细菌，它能在自 然条件下趋化性地感 染大多数双子叶植物 的受伤部位，并诱导 产生冠瘿瘤或发状根。
——原理
根癌农杆菌的细胞内有一个大的致瘤质粒，简称Ti 质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤 口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
——二元载体
基本原理：T-DNA区与Vir区不在同一个载 体上，Vir区通过反式作用使T-DNA区发生 缺失Vir，T-DNA卸甲， 转移。 引入酶切位点 微型Ti质粒 去掉T-DNA去 根癌农杆菌 辅助Ti质粒 外源基因 微型Ti质粒 含有辅助Ti 质粒的根癌农杆菌 植物
——T-DNA导入植物
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系, 改 造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。
——Ti质粒结构
特点
Ti-质粒的基因结构
T-DNA区 （transferred DNA region)
转移到植物基因组中的DNA 序列，与肿瘤形相关。 激活T-DNA的转移，使植物 致瘤，是毒性区。 调控Ti质粒在根癌农杆菌 之间的转移，是接合转移 编码区。 调控Ti质粒的自我复制， 为复制起始区。
相较而言，二元载体更多优点： 1、构建方便；2、效率高；3、不会带人大量 无用的冗余DNA序列。
——一元载体
（卸甲载体）
1. 切除T-DNA中的致瘤基因，仅保留两侧边 界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。 2. 在T-DNA区中删除致瘤基因位点插入与中 间载体同源的质粒序列。 3. 用特定转移方法转移中间载体，发生同源 重组。 4. 根据中间载体所携带的抗性基因进行筛选。 5. 用筛选后的菌株侵染植物组织细胞。